دانشگاه شهید باهنر کرمان

 آمار

تعداد نشریات26
تعداد شماره‌ها447
تعداد مقالات4,557
تعداد مشاهده مقاله5,380,005
تعداد دریافت فایل اصل مقاله3,580,078
نصیری, محمدرضا, قوتی, شاهرخ, طهمورث پور, مجتبی. (1388). مطالعه بیماری ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز در گاوهای سرابی (DUMPS) با تکنیک PCR-SSCP و PCR-RFLP. , 1(1), 103-116. doi: 10.22103/jab.2009.1152
محمدرضا نصیری; شاهرخ قوتی; مجتبی طهمورث پور. "مطالعه بیماری ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز در گاوهای سرابی (DUMPS) با تکنیک PCR-SSCP و PCR-RFLP". , 1, 1, 1388, 103-116. doi: 10.22103/jab.2009.1152
نصیری, محمدرضا, قوتی, شاهرخ, طهمورث پور, مجتبی. (1388). 'مطالعه بیماری ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز در گاوهای سرابی (DUMPS) با تکنیک PCR-SSCP و PCR-RFLP', , 1(1), pp. 103-116. doi: 10.22103/jab.2009.1152
نصیری, محمدرضا, قوتی, شاهرخ, طهمورث پور, مجتبی. مطالعه بیماری ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز در گاوهای سرابی (DUMPS) با تکنیک PCR-SSCP و PCR-RFLP. , 1388; 1(1): 103-116. doi: 10.22103/jab.2009.1152

مطالعه بیماری ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز در گاوهای سرابی (DUMPS) با تکنیک PCR-SSCP و PCR-RFLP

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
مقاله 6، دوره 1، شماره 1، تیر 1388، صفحه 103-116    اصل مقاله (408.39 K)
نوع مقاله: مقاله پژوهشی
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2009.1152
نویسندگان
محمدرضا نصیری؛ شاهرخ قوتی؛ مجتبی طهمورث پور
چکیده
بررسی و تشخیص بیماری های ژنتیکی در جوامع انسانی و حیوانی از اهمیت خاصی برخوردار است. خون گیری از 162 گاو سرابی ایستگاه تحقیقاتی سراب (استان آذربایجان شرقی) انجام شد. استخراج DNA از نمونه‌ها به روش گوانیدین تیو سینات-سیلیکاژل صورت گرفت. هدف از این مطالعه، شناسایی حاملین بیماری پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز (DUMPS) در گاوهای بومی سرابی ایران بود. واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تکثیر قطعات 177 و 108 جفت بازی از اگزون 4 ژن SLC35A3 و اگزون 5 ژن UMPs با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی انجام شد. محصولات واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن SLC35A3 به روش SSCP برای بررسی تفاوت فرم فضایی رشته‌های منفرد روی ژل اکریل آمید الکتروفورز شدند. عمل هضم آنزیمی (RFLP) با استفاده ازآنزیم AvaI برای به دست آوردن الگوی هضمی مناسب به منظور تشخیص و شناسایی حاملین بیماری DUMPS روی محصولات واکنش زنجیره ای پلیمراز ژن UMPs انجام شد. نتایج این بررسی نشان داد که جهش (G→T) در موقعیت 559 اگزون 4 ژن SLC35A3 و همچنین جهش (C→T) در موقعیت 405 اگزون 5 ژن UMPs در گاوهای سرابی وجود نداشتند و بنابراین هیچ دام ناقلی مشاهده نشد.
کلیدواژه‌ها
بیماری ژنتیکی اتوزومال؛ پیچیدگی ستون فقرات؛ مارکرمولکولی؛ گاو سرابی؛ CVM؛ DUMPS؛ PCR-RFLP؛ PCR-SSCP
اصل مقاله

مطالعه بیماری ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز در گاوهای سرابی (DUMPS) با تکنیک PCR-SSCP و PCR-RFLP

 

محمد رضا نصیری1و2، شاهرخ قوّتی1، مجتبی طهمورث پور1و2، محمد دوستی*1، مرتضی مهدوی1، بلال صادقی1 و محمد رضا آرمین3

1 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فرودوسی مشهد

2 پژوهشکده بیوتکنولوژی و فناوری زیستی دانشگاه فردوسی مشهد

3 گروه بیوتکنولوژی و بهنژادی گیاهان زراعی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فرودوسی مشهد

 

چکیده

بررسی و تشخیص بیماری های ژنتیکی در جوامع انسانی و حیوانی از اهمیت خاصی برخوردار است. خون گیری از 162 گاو سرابی ایستگاه تحقیقاتی سراب (استان آذربایجان شرقی) انجام شد. استخراج DNA از نمونه‌ها به روش گوانیدین تیو سینات-سیلیکاژل صورت گرفت. هدف از این مطالعه، شناسایی حاملین بیماری پیچیدگی ستون فقرات (CVM) و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز (DUMPS) در گاوهای بومی سرابی ایران بود. واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تکثیر قطعات 177 و 108 جفت بازی از اگزون 4 ژن SLC35A3 و اگزون 5 ژن UMPs با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی انجام شد. محصولات واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن SLC35A3 به روش SSCP برای بررسی تفاوت فرم فضایی رشته‌های منفرد روی ژل اکریل آمید الکتروفورز شدند. عمل هضم آنزیمی (RFLP) با استفاده ازآنزیم AvaI برای به دست آوردن الگوی هضمی مناسب به منظور تشخیص و شناسایی حاملین بیماری DUMPS روی محصولات واکنش زنجیره ای پلیمراز ژن UMPs انجام شد. نتایج این بررسی نشان داد که جهش (G→T) در موقعیت 559 اگزون 4 ژن SLC35A3 و همچنین جهش (C→T) در موقعیت 405 اگزون 5 ژن UMPs در گاوهای سرابی وجود نداشتند و بنابراین هیچ دام ناقلی مشاهده نشد.

کلمات کلیدی: بیماری ژنتیکی اتوزومال، پیچیدگی ستون فقرات، مارکرمولکولی، گاو سرابی، CVM ،DUMPS ،  PCR-RFLP، PCR-SSCP.

                                                 

 

 

 


 


مقدمه

بی شک شناسایی، کنترل، حذف آلل های مغلوب نهفته اتوزومال در افراد هتروزیگوت و جلوگیری از انتشار آنها در گله و بهنژادی و سودآوری گله‌ها از مهمترین اهداف اصلاحی هر کشوری می‌باشد (Herzog, 1992). بنابراین، یافتن روش‌های دقیق تشخیصی در این راه، کمک شایانی به شناسایی، حذف ناقلین این بیماری‌ها و حفظ ذخایر ژنتیکی مطلوب می‌نماید. بیشتر نقص‌های ژنتیکی به صورت مغلوب به ارث می‌رسند. بنابراین، تشخیص دقیق حیواناتی که از نظر ژن عامل بیماری، هتروزیگوت هستند بسیار مشکل است، زیرا این حیوانات اغلب به طور طبیعی به زندگی خود ادامه می‌دهند. بنابراین، می‌توانند این ژن را با تولید مثل، در جمعیت پخش کنند و باعث افزایش فراوانی آلل مغلوب گردند (Herzog, 1992).

تشخیص مولکولی ناهنجاری ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات (CVM)[1]، نخستین بار توسط Agerholm و همکاران (2000) در جمعیت گاوهای هلشتاین دانمارک تشخیص و گزارش شد. پیچیدگی ستون فقرات یک بیماری مادرزادی کشنده در گاوهای هلشتاین است و به صورت آتوزوم نهفته بروز می‌کند. این بیماری عامل سقط،‌ مرگ و میر جنین و زایمان گوساله به صورت مرده و زودتر از موئد می‌باشد (Agerholm et al., 2001, Rusc et al., 2007). پس از مدت کوتاهی ظهور (CVM) در آمریکا، انگلستان، هلند و ژاپن نیزگزارش شد
(Duncan et al., 2001, Nagahata et al., 2002). جهش G→T در موقعیت 559 اگزون 4 ژن SLC35A3[2] روی کروموزوم شماره 3 عامل بیماری شناخته شده است.

ژن SLC35A3 مسئول عملکرد transporter UDP-N-acetylglucosamine می‌باشد که انتقال ‌دهنده قندهای نوکلئوتیدی از سیتوزول به درون دستگاه گلژی می‌باشد
 (Ishida & Kawakita, 2004, Ishida et al., 2005). در این موضع قندهای نوکلئوتیدی به وسیله گلیکوزیل ترانسفرازها برای سنتز زنجیره قندی در گلیکوپروتئین‌ها، گلیکولیپیدها و پلی‌کربوهیدرات‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند که سرانجام باعث رشد و توسعه بخش محوری و مرکزی اسکلت بدن می‌شود. جهش در موقعیت 559 ژن SLC35A3 سبب می‌شود که بازگوانین تبدیل به تیمین شود (شکل 1).

 

 

 

 

 

شکل1- جهش (G→T) مربوط به ژن SLC35A3 در موقعیت 559 اگزون 4 در کروموزوم شماره 3 گاو و در نتیجه اسیدآمینه والین تبدیل به فنیل‌آلانین شود (Kanae et al., 2005). این جایگزینی باعث اختلال در عملکرد ژن SLC35A3 و سرانجام نقص در عمل UDP-N-acetylglucosamine transporter  می شود (Muraoka et al., 2001, Thomsen et al., 2000).

Figure 1- G®T mutation in the SLC35A3 gene at position 559 in exon 4 of chromosome 3 cows and thus amino acid valine is converted to Phenylalanine (Kanae et al., 2005). The replacement in the SLC35A3 gene is cause dysfunction and finally failure in practice UDP-N-acetylglucosamine transporter (Muraoka et al., 2001; Thomsen et al., 2000).


 


 

 

بیماری نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز (DUMPS)، به صورت آتوزوم نهفته است که اولین بار در سال 1985 در آفریقای جنوبی در گله‌های تحت پوشش تلقیح مصنوعی مشاهده گردید. این عارضه مختص گاوهای هلشتاین می‌باشد و در نژادهای دیگر مشاهده آن نادر به نظر می‌رسد. در اواخر سال 1991، 3461 نمونه از گاو هلشتاین آمریکایی مورد بررسی قرار گرفتند که از این تعداد 307 گاو نر و 287 گاو ماده، به عنوان ناقل شناسایی شدند. در این مدت در اروپا نیز 1226 حیوان مورد آزمون قرار گرفتند که 169 گاو نر و 245 گاو ماده ناقل این بیماری بودند (Harlizius et al., 1996, Freeman et al., 2004).

گوساله‌های مبتلا به DUMPS دارای مرگ زود هنگام حدوداً در روز چهلم بارداری می‌باشند و به صورت نارس و مرده متولد می‌شوند (Agerholm et al., 1997). از لحاظ تولید شیر، گاوهای ماده ناقل این نقص دارای تولید شیر طبیعی می‌باشند. اما، از نظر ترکیبات شیر در گاوهای ناقل مقدار اسید اروتیک 10-5 برابر بیشتر از حد طبیعی است
(Shanks & Robinson, 1990). بیماری نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز، بر اثر جهش در موقعیت کدون 405 اگزون 5 ژن اوریدین 5 منوفسفات سنتاز (UMPs) که روی کروموزوم شماره 1 گاو واقع شده است اتفاق می‌افتد. باز سیتوزین در این موقعیت در اثر جهش تبدیل به تیمین شده که این جهش باعث ایجاد نابهنگام کدون توقف می‌شود (Harlizius et al., 1996). هدف از انجام این پژوهش، بررسی وجود جهش‌های مرتبط با بیماری‌های CVM و DUMPS در گاوهای سرابی ایران و بهینه نمودن آزمون های مبتنی بر PCR-SSCP و PCR-RFLP برای تشخیص و شناسایی بیماری‌های یاد شده در گاوهای حامل بود.

مواد و روش‌ها

خونگیری از تعداد 162 راس گاو سرابی (28 راس نر و 134 راس ماده) ایستگاه تحقیقاتی سراب انجام شد. استخراج DNA از 100 میکرو لیتر نمونه خون، به روش گوانیدین تیو سینات-سیلیکاژل با کیت دیاتوم محصول شرکت Isogene (مسکو) انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه نانودروپ (Thermo Wilmington, USA) به روش طیف سنجی[3] تعیین شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی ژن SLC35A3 و جفت آغازگر اختصاصی ژن UMPs برای تکثیر قطعات مورد نظر توسط دستگاه ترموسایکلر (T-Personal, Biometra, Germany) بر اساس روش استاندارد انجام شد (جدول 1). اجزای واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر و غلظت نهایی مواد به صورت زیر بود:
مواد و مقادیر (8/8 pH) mM Tris-HCl  100، U1 آنزیم Taq پلیمراز (Invitrogen, California, USA)، 1/0 میلی گرم بر میلی لیتر[4](BSA)، mM 2/0 از هر (Pharmacia, Uppsala, Sweden) dNTP، mM 5/1 از MgCl2 و 100 نانوگرم از DNA هدف که با استفاده از برنامه دمایی زیر و در 35 سیکل تکثیر شدند: 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 دقیقه، 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه. برنامه دمایی و چرخه تکثیر برای ژن UMPs مشابه SLC35A3 با دمای اتصال 61 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه بود. الکتروفورز محصولات PCR برای بررسی اختصاصیت و راندمان روی ژل آگارز 2 درصد با ولتاژ 90 به مدت 40 دقیقه انجام شد و ژل توسط اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی و محصولات توسط پرتو فرا بنفش عکسبرداری بررسی شدند.

 

 

جدول 1- آغازگرهای اختصاصی ناحیه ژنی SLC35A3 و UMPs.

منبع

قطعات تولیدی
 (جفت باز)

توالی آغازگر ها

ناحیه ژنی

Rusc, & Kaminski, 2007

177

F: 5'-TCA GTG GCC CTC AGA TTC TC-3'

R: 5'-CCA AGT TGA ATG TTT CTT ATC CA-3'

SLC35A3

Schwenger et. al. 1993

108

F: 5'-GCA AAT GGC TGA AGA ACA TTC TG-3'

R: 5'-GCT TCT AAC TGA ACT CCT CGA GT-3'

UMPs

Table 1 – Locus-specific-primers of SLC35A3 & UMPs gene.

 

 

 

SSCP  و  RFLP

برای آزمون محصولاتPCR  با روش (SSCP)[5] جهت آزمون بیماری CVM، 4 میکرو لیتر از محصولات PCR با 12 میکرولیتر ازSSCP dye  ( 10 میکرولیتر بروموفنل 10 درصد + 2 میکرولیتر EDTA نیم مولار + 190 میکرولیتر گلیسرول + 800 میکرولیتر فرم آمید) مخلوط شد. سپس به مدت 5 دقیقه در دمای C°95 در دستگاه PCR قرار داده شد. بلافاصله پس از این مرحله، میکروتیوب ها در داخل یخ قرار گرفتند. سپس نمونه‌ها روی ژل اکریل آمید 10 درصد واسرشته با دمای Cº7، ولتاژ 320 و مدت زمان 150 دقیقه جهت مشاهده تفاوت‌های تک نوکلوئیدی الکتروفورز گردیدند. رنگ آمیزی ژل اکریل آمید به روش نیترات نقره صورت گرفت.

هضم آنزیمی (RFLP)[6] قطعه 108 جفت بازی ژن UMPs برای بدست آوردن الگوی هضمی مناسب با آنزیم AvaI انجام شد. الگوی باند های حاصله از هضم آنزیمی روی ژل اکریل آمید 10 درصد، مورد بررسی قرار گرفت. الگوی باندی دام سالم شامل سه باند (19، 36، 53 جفت بازی) و دام ناقل شامل چهار باند (19، 36، 53 و 89 جفت بازی) بود (شکل 2).

 

 

شکل 2- تصویر شماتیک سایت برشی آنزیم AvaI روی ژن UMPs.

Figure 2- Schematic diagram of AvaI restriction site on the UMPs gene.

 

 

به منظور بررسی عملکرد صحت آنزیم AvaI، فعالیت این آنزیم روی محصولات PCR به دست آمده از دو ژن لپتین گاوی[7] و FGFR3[8] آزمایش شد. بطوریکه آنزیم AvaI به ترتیب بر روی این دو ژن فاقد جایگاه برشی و دارای یک جایگاه برشی بود.

نتایج و بحث

استخراج DNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز

نتایج طیف سنجی نشان داد که DNA های استخراج شده از کیفیت مناسبی برای انجام PCR برخوردار بودند. نتایج بررسی محصولات PCR بر روی ژل آگارز نشان دادند که الگوی باندی مربوط به تکثیر قطعه 177 جفت بازی ژن SLC35A3 و 108 جفت بازی ژن UMPs فاقد باند غیر اختصاصی، دایمر و اسمیر بود که موید اختصاصی بودن جفت آغازگرها می‌باشد (شکل 3 و شکل 4).

CVM

نتایج بررسی الگوی تفاوت فرم فضایی رشته‌های منفرد (SSCP) روی ژل اکریل آمید 10 درصد واسرشته، نشان داد که هیچ یک از دام‌های موجود در ایستگاه گاو سرابی حامل ژن جهش یافته نبودند و این بدین معنی است که در دام‌های سرابی مورد بررسی، هیچ ناقلی از بیماری CVM وجود ندارد (شکل 5). در مطالعه Nagahata و همکاران (2002) در ژاپن، 40 گاو نر را مورد بررسی قرار دادند. در این پژوهش، بررسی‌های گوناگونی از قبیل توجه در علائم ماکروسکوپی، علائم کالبد شکافی و علائم رادیوگرافی در گوساله‌های مبتلا به CVM انجام شد که نهایتاً از این تعداد، 13 مورد ناقل CVM از طریق تکنیک‌های مولکولی شناسایی شد. همچنین در کشور لهستان برای تعیین فراوانی ناقلین CVM، Rusc و همکاران (2007) تعداد 202 گاو نر را که در سال‌های 2001 تا 2004 در تلقیح استفاده می‌شدند و 403 گاو نری که تحت ارزیابی برای استفاده آینده در تلقیح بودند را آزمون نمودند که همگی از نژاد هلشتاین ـ فرزین لهستانی (لهستانی سیاه و سفید) بودند. از تعداد 605 گاو نر بیان شده، 150 مورد ناقل CVM شناسایی شد.

 

 

 

 

 

شکل 3- الکتروفورز محصولات PCR ژن SLC35A. شماره 9-1 (قطعه 177 جفت بازی)، شماره 10 (کنترل منفی)، M: نشانگر وزنی مورد استفاده برای تعیین اندازه محصولات PCR. اندازه باندهای نشانگر وزنی M50 از بالا به پایین برحسب bp به قرار زیر می باشد (1000-900-800-700-600-500-400-300-250-200-150-100-50).

 

Figure 3- Agarose gel electrophoresis of SLC35A3 gene PCR products. Lanes (1-9), 177 bp fragment; Lane 10, Negative control, M, 50 bp ladder.

 

 

شکل 4- الکتروفورز محصولات  PCR ژن UMPs. شماره 1 کنترل منفی، شماره 7-2 قطعه 108 جفت بازی،M : نشانگر وزنی مورد استفاده برای تعیین اندازه محصولات .PCR اندازه باندهای نشانگر وزنی M50 از بالا به پایین برحسب bp به قرار زیر می باشد (1000-900-800-700-600-500-400-300-250-200-150-100-50).

 

Figure 4- Agarose gel electrophoresis of UMPs gene PCR products. Lane 1, Negative control, Lanes (2-7), 108 bp fragment; M, 100 bp ladder.

 

 

 

شکل 5- الکتروفورز اکریل آمید محصولات PCR ژن SLC35A3 برای بررسی به روش SSCP.

 

Figure 5- SLC35A3 gene PCR products on polyacrylamid gel electrophoresis for detecting of SSCP patterns.

 

 

 

 


DUMPS

هضم آنزیمی (RFLP) قطعه 108 جفت بازی ژن UMPs نشان داد هیچ یک از دام‌های موجود در ایستگاه گاو سرابی حامل ژن جهش یافته نبودند و همه دام‌ها الگوی سه باندی را نشان دادند و این بدین معنی است که در دام‌های سرابی مورد بررسی هیچ ناقلی از بیماری DUMPS وجود ندارد (شکل-6).

 

 

 

شکل 6- الکتروفورز اکریل آمید محصولات هضمی آنزیم برشی AvaI. شماره 1 (قطعه هضم نشده)، شماره 5-2 (محصولات هضم شده) ، M نشانگر وزنی pUC19/MspI مورد استفاده برای تعیین اندازه محصولات PCR. اندازه باندهای نشانگر وزنی از بالا به پایین برحسب bp به قرار زیر می باشد (501-489-404-331-242-190-147-111-110-67-34). M50: نشانگر وزنی، اندازه باندهای نشانگر وزنی از بالا به پایین برحسب bp به قرار زیر می باشد (450-400-350-300-250-200-150-100-50).

 

Figure 6- Restriction profiles of the 108 bp PCR fragments obtained after treatment with AvaI on polyacrylamid gel, Lane 1, undigested PCR product; Lanes (2-7), digested PCR products,  M, pUC19/MspI ladder; M50, 50 bp ladder.

 

 

 

با توجه به اینکه در این مطالعه برای اولین بار از آنزیم AvaI برای کاوش ژن UMPs گاو نژاد سرابی استفاده گردید و عدم وجود نمونه کنترل مثبت امکان حصول نتایج فرعی نیز وجود داشت که این خود دقت ویژه ای را می‌طلبید. بر همین اساس، برای بررسی صحت عملکرد آنزیم AvaI، این آنزیم روی محصولات PCR بدست آمده از دو ژنFGFR3  و لپتین گاوی مورد آزمون قرار گرفت. نتایج این آزمون فعالیت برشی صحیح آنزیم AvaI را تائید نمود (شکل 7 و 8).

 

 

 

شکل 7- الکتروفورز محصولات PCR ژن FGFR3 و محصولات هضمی با آنزیم برشی AvaI. شماره 2-1 (قطعه هضم شده)، شماره 4-3 (محصولات PCR ژن FGFR3)، M نشانگر وزنی 50bp مورد استفاده برای تعیین اندازه محصولات PCR. اندازه باندهای نشانگر وزنی از بالا به پایین برحسب bp به قرار زیر می باشد (500-450-400-350-300-250-200-150-100-50).

 

Figure 7- Agarose gel electrophoresis of FGFR3 gene PCR products & restriction profiles of this PCR fragments obtained after treatment with AvaI. Lanes (1-2), digested PCR products, Lanes (3-4), FGFR3 gene PCR products, M, 50 bp ladder.

 

 

 

شکل 8- الکتروفورز محصولات PCR ژن لپتین گاوی و محصولات هضمی با آنزیم برشی AvaI. شماره 3-1 (محصولات PCR هضم نشده)، شماره 6-4 (محصولات PCR ژن لپتین گاوی)، M نشانگر وزنی 50bp مورد استفاده برای تعیین اندازه محصولات PCR. اندازه باندهای نشانگر وزنی از بالا به پایین برحسب bp به قرار زیر می باشد (500-450-400-350-300-250-200-150-100-50).

 

Figure 8- Agarose gel electrophoresis of bovine leptin gene PCR products & restriction profiles of this PCR fragments obtained after treatment with AvaI. Lanes (1-3), undigested PCR products, Lanes (4-6), bovine leptin gene PCR products, M, 50 bp ladder.

 

 

 

همچنین نتایج حاصله تایید کننده این فرضیه می‌باشد که بیماری DUMPS محصولی ناخواسته از یک برنامه اصلاح نژادی بوده و منشا آن اسپرم گاوهای مرتبط با Happy herd beautician می‌باشد، چرا که در این پژوهش و پژوهش های مشابه روی نژادهای بومی مناطق دیگر دنیا، این بیماری شناسایی نشده است. مطالعه Kaminski  و همکاران ( 2005) روی گاوهای هلشتاین لهستانی انجام دادند و با وجود جامعه بزرگی (2209 راس) که مورد بررسی قرار دادند هیچ اثری از ناقلین DUMPS مشاهده نکردند. در مطالعه‌ای Patel  و همکاران (2006) روی گاوهای بومی هند و گاوهای زبو را مورد بررسی قرار دادند و در نهایت ناقلی از این بیماری را مشاهده نکردند. همچنینAkyuz  و همکاران (2008) در پژوهشی گاوهای بومی ترکیه و گاوهای براون سوئیس منطقه را آزمایش کردند و نتایج آنها نشان داد که هیچ دام ناقلی از این بیماری در گله‌های مورد بررسی وجود ندارد. نتایج این پژوهش، یافته های گزارش شده توسط افراد ذکر شده را تائید نمود.

نتیجه گیری کلی

عدم مشاهده آلل مغلوب جهش یافته بیماری‌های ژنتیکی پیچیدگی ستون فقرات و نقص در آنزیم اوریدین مونوفسفات سنتاز در گاوهای بومی سرابی مرکز اصلاح نژاد سراب استان آذربایجان شرقی نیز عدم استفاه از اسپرم‌های خارجی پرتولید و اصیل بودن دام‌های این ایستگاه را تایید نمود. ویژگی های‌خاص این دام، نوید بخش یک منبع ژنتیکی مناسب برای آن منطقه می‌باشد. برای حفظ خلوص ژنتیکی باید تمهیدات گسترده تری از سوی مسئولین صورت گیرد. زیرا خالص‌سازی این گله‌ها برای داشتن ذخایر ژنی خالص و مطلوب به منظور انجام کارهای اصلاحی و بهنژادی و اجرا نمودن راهبرد های اصلاحی هیچ مشکلی به لحاظ انتشار آلل مغلوب و همچنین کاهش راندمان اقتصادی بوجود نمی‌آورد و با اطمینان و ضریب دقت بالا می‌توان از اسپرم گاوهای برتر این نژاد، برای اصلاح نژاد دام‌های منطقه و اجرا نمودن راهبرد‌های اصلاح نژادی استفاده نمود. نتایج این پژوهش نشان دادند که لزوم استفاده از تکنیک‌های مولکولی (PCR-SSCP و
PCR-RFLP) به منظور شناسایی ناقلین بیماری‌های ژنتیکی اتوزومال در سطح گله‌های پایه و تجاری و همچنین در سطح اسپرم‌های وارداتی و تولیدی مراکز اصلاحی داخل کشور امری غیر قابل انکار است و این روش‌ها به آسانی توانایی بهینه شدن، تفکیک و شناسایی دام‌های حامل و آلل‌های جهش یافته را دارند. همچنین روش ارائه شده در این پژوهش می‌تواند برای شناسایی و غربالگری سایر دام‌های بومی و اسپرم‌های گاوهای مراکز اصلاح نژاد کشور برای تشخیص حاملین استفاده شود.

تشکر و قدردانی

از معاونت پژوهشی دانشکده کشاورزی و آزمایشگاه بیوتکنولوژی حیوانی دانشگاه فردوسی مشهد به سبب فراهم نمودن امکانات و تجهیزات پژوهشی، همکاران مرکز اصلاح نژاد دام ایستگاه تحقیقاتی سراب (استان آذربایجان شرقی) و همکاران پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی شمال غرب و غرب ایران صمیمانه تشکر و قدردانی می‌شود.

 

 

 

منابع

  1. Agerholm JS, Bendixen C, Andersen O, Arnbjerg J (2000) Complex vertebral malformations in Holstein calves. Report LK-564. National Committee on Danish Cattle Husbandry,Aarhus,Denmark.
  2. Agerholm JS, Bendixen C, Andersen O, Arnbjerg J (2001) Complex vertebral malformation in Holstein calves. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 13:283–289.
  3. Agerholm JS, Willadsen CM, Nielsen TK, Giese SB, Holm E, Jensen L, Agger JF (1997) Diagnostic studies of abortion in Danish dairy herds. Journal of Veterinary Medicine A 44: 551-558.
  4. Akyuz B, Ertugrul O (2008) Detection of deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) in Holstein and native cattle inTurkey. Journal ofAnkaraUniversityFaculty of Veterinary Medicine 55: 57-60.
  5. Duncan RB, Colin Jr, Carrig B, Agerholm JS, Bendixen C (2001) Complex vertebral malformation in a Holstein calf: report of a case in theUSA. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 13:333–336.
  6. Freeman AR, Meghen CM, Machugh DE, Loftus RT, Achukwi MD, Bado A, Sauveroche B, Bradley DG (2004) Admixture and diversity in West African cattle populations. Molecular Ecology 13: 3477-3487.
  7. Harlizius B, Schrober S, Tammen I, Simon D (1996) Isolation of the bovine uridine monophosphate synthase gene to identify the molecular basis of DUMPS in cattle. Journal of Animal Breeding and Genetics 133: 303-309.
  8. Herzog A (1992) Genetic defects in cattle and the possibilities of control. Wiener Tierarztliche Monatsschrift 79: 142-148
  9. Ishida N, Kawakita M (2004) Molecular physiology and pathology of the nucleotide sugar transporter family (SLC35). Pflügers Archiv European Journal of Physiology 447: 768-775
  10. Ishida N, Kuba T, Aoki K, Miyatake S, Kawakita M, Sanai Y (2005) Identification and characterization of human Golgi nucleotide sugar transporter SLC35D2, a novel member of the SLC35 nucleotide sugar transporter family. Genomics 85: 106-116.
  11. Kaminski S, Grzybowski G, Prusak B, Rusc A (2005) No incidence of DUMPS carriers in Polish dairy cattle. Journal of Applied Genetics 46 (4): 395-397.
  12. Kanae Y, Endoh D, Nagahata H, Hayashi, M (2005) A method for detecting complex vertebral malformation in Holstein calves using polymerase chain reaction–primer introduced restriction analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 17: 258-262.
  13. Muraoka M, Kawakita M, Ishida, N (2001) Molecular characterization of human UDP-glucuronic acid/UDP-N-acetylgalactosamine transporter, a novel nucleotide sugar transporter with dual substrate specificity. FEBS Letters 495: 87-93.
  14. Nagahata H, Oota H, Nitanai A, Oikawa S., Higuchi H., Nakade T, Kurosawa T, Morita M, Ogawa H. (2002). Complex Vertebral Malformation in a Stillborn Holstein Calf inJapan. Journal of Veterinary Medical Science. 64(12): 1107-1112.
  15. Patel RK, Singh KM., Soni KJ, Chauhan JB, Sambasiva Rao KRS (2006) Lack of carriers of citrullinaemia and Dumps in Indian Holstein cattle. Journal of Applied Genetics 47(3): 239-242.
  16. Rusc A, Kaminski S (2007). Prevalence of complex vertebral malformation carriers among Polish Holstein-Friesian bulls. Journal of Applied Genetics 48(3): 247-252.
  17. Schwenger B, Schober S, Simon D (1993). DUMPS cattle carry a point mutation in the Uridine Monophosphate synthase gene. Genomics 16: 241-244.
  18. Shanks RD, Robinson JL (1990) Deficiency of uridine monophosphate synthase amongHolsteincattle. Cornell Veterinarian 80: 119-122.
  19. Thomsen B, Horn P, Panitz F, Bendixen E, Petersen A. H, Holm L (2006) A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation. Genome Research 16: 97-105.

 

Investigation of Iranian native Sarabi Cows for Complex Vertebral Malformation (CVM) and Deficiency in Uridine Mono Phosphate Syntase Enzyme (DUMPS) Genetic Disorders by Using PCR-SSCP and PCR-RFLP Technique

 

M. R. Nassiry1,2,S. Ghovvati1, M. Tahmoorespour1, *M. Doosti1, M. Mahdavi1, B. Sadeghi1, & M. R. Armin3

1 Animal Science Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, P. O. Box: 91775-1163, Iran.

2 Institute of Biotechnology, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran

3 Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad

 

Abstract

Evaluating and detection of genetic disorders is very important in both human and animal communities. Blood samples were prepared from 162 cows from Sarabi cows’ research station in Sarab, East Azerbaijan province, Iran. DNA extraction was done based on guanidine thiocyanate – silica gel method. The aim of this study was to identify the CVM and DUMPS carriers in Sarabi native cows of Iran. Standard polymerase chain reaction was applied to amplify a 177 bp and a 108 bp fragments from exon 4 in SLAC35A3 gene and exon 5 in UMPs gene using specific primers pair. The SLC35A3 gene PCR products were analyzed using single stranded conformation polymorphism (SSCP) to reveal their mutations on polyacrylamide gel. In order to identify DUMPS carrier animals, a RFLP assay was conducted and the UMPs PCR products were digested by AvaI restriction enzyme. Results indicated that no G→T mutation at position 559 in exon 4 of SLAC35A3 gene and C→T mutation at position 405 in exon 5 of UMPs gene in examined cows respectively and subsequently no carrier was identified.

 

Keywords: Autosomal Genetic Diseases, CVM, DUMPS, Sarabi cow, PCR-RFLP, PCR-SSCP.


* نویسنده مسئول: محمد دوستی              تلفن: 8796845-0511         Doosti.mohammad@stu-mail.um.ac.irEmail:

[1] Complex Vertebral Malformation

[2] Solute Carrier family 35, memberA3

[3] Spectrophotometric method

[4] Bovine Serum Albumin

[5] SingleStrand Conformation Polymorphism

[6] Restriction Fragment Length Polymorphism

[7] Bovine Leptin gene

[8] Fibroblast Growth Factor Receptor 3

* Corresponding author: M. Doosti                                           Email: Doosti.mohammad@stu-mail.um.ac.ir

مراجع
  1. Agerholm JS, Bendixen C, Andersen O, Arnbjerg J (2000) Complex vertebral malformations in Holstein calves. Report LK-564. National Committee on Danish Cattle Husbandry,Aarhus,Denmark.
  2. Agerholm JS, Bendixen C, Andersen O, Arnbjerg J (2001) Complex vertebral malformation in Holstein calves. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 13:283–289.
  3. Agerholm JS, Willadsen CM, Nielsen TK, Giese SB, Holm E, Jensen L, Agger JF (1997) Diagnostic studies of abortion in Danish dairy herds. Journal of Veterinary Medicine A 44: 551-558.
  4. Akyuz B, Ertugrul O (2008) Detection of deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) in Holstein and native cattle inTurkey. Journal ofAnkaraUniversityFaculty of Veterinary Medicine 55: 57-60.
  5. Duncan RB, Colin Jr, Carrig B, Agerholm JS, Bendixen C (2001) Complex vertebral malformation in a Holstein calf: report of a case in theUSA. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 13:333–336.
  6. Freeman AR, Meghen CM, Machugh DE, Loftus RT, Achukwi MD, Bado A, Sauveroche B, Bradley DG (2004) Admixture and diversity in West African cattle populations. Molecular Ecology 13: 3477-3487.
  7. Harlizius B, Schrober S, Tammen I, Simon D (1996) Isolation of the bovine uridine monophosphate synthase gene to identify the molecular basis of DUMPS in cattle. Journal of Animal Breeding and Genetics 133: 303-309.
  8. Herzog A (1992) Genetic defects in cattle and the possibilities of control. Wiener Tierarztliche Monatsschrift 79: 142-148
  9. Ishida N, Kawakita M (2004) Molecular physiology and pathology of the nucleotide sugar transporter family (SLC35). Pflügers Archiv European Journal of Physiology 447: 768-775
  10. Ishida N, Kuba T, Aoki K, Miyatake S, Kawakita M, Sanai Y (2005) Identification and characterization of human Golgi nucleotide sugar transporter SLC35D2, a novel member of the SLC35 nucleotide sugar transporter family. Genomics 85: 106-116.
  11. Kaminski S, Grzybowski G, Prusak B, Rusc A (2005) No incidence of DUMPS carriers in Polish dairy cattle. Journal of Applied Genetics 46 (4): 395-397.
  12. Kanae Y, Endoh D, Nagahata H, Hayashi, M (2005) A method for detecting complex vertebral malformation in Holstein calves using polymerase chain reaction–primer introduced restriction analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 17: 258-262.
  13. Muraoka M, Kawakita M, Ishida, N (2001) Molecular characterization of human UDP-glucuronic acid/UDP-N-acetylgalactosamine transporter, a novel nucleotide sugar transporter with dual substrate specificity. FEBS Letters 495: 87-93.
  14. Nagahata H, Oota H, Nitanai A, Oikawa S., Higuchi H., Nakade T, Kurosawa T, Morita M, Ogawa H. (2002). Complex Vertebral Malformation in a Stillborn Holstein Calf inJapan. Journal of Veterinary Medical Science. 64(12): 1107-1112.
  15. Patel RK, Singh KM., Soni KJ, Chauhan JB, Sambasiva Rao KRS (2006) Lack of carriers of citrullinaemia and Dumps in Indian Holstein cattle. Journal of Applied Genetics 47(3): 239-242.
  16. Rusc A, Kaminski S (2007). Prevalence of complex vertebral malformation carriers among Polish Holstein-Friesian bulls. Journal of Applied Genetics 48(3): 247-252.
  17. Schwenger B, Schober S, Simon D (1993). DUMPS cattle carry a point mutation in the Uridine Monophosphate synthase gene. Genomics 16: 241-244.
  18. Shanks RD, Robinson JL (1990) Deficiency of uridine monophosphate synthase amongHolsteincattle. Cornell Veterinarian 80: 119-122.
  19. Thomsen B, Horn P, Panitz F, Bendixen E, Petersen A. H, Holm L (2006) A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation. Genome Research 16: 97-105.
 

آمار
تعداد مشاهده مقاله: 1,693
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 637


سامانه مدیریت نشریات علمی. طراحی و پیاده سازی از سیناوب