همسانه‌سازی، بیش بیان و بررسی خصوصیات آنزیم قلیایی فیتاز (phyC) در باکتری اشرشیا کلی

همسانه‌سازی، بیش بیان و بررسی خصوصیات آنزیم قلیایی فیتاز (phyC) در باکتری اشرشیا کلی

حمید آریان نژاد¹، محمد رضا نصیری*^2و3، علی اصغر اسلمی نژاد⁴، احمد آسوده⁵، حسام دهقانی⁶

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه علوم دامی، دانشگاه فردوسی مشهد.

²دانشیار، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

³دانشیار، گروه پژوهشی بیوتکنولوژی کشاورزی و دامی، پژوهشکده فناوری زیستی، دانشگاه فردوسی مشهد.

⁴استادیار، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

⁵ استادیار، گروه بیوشیمی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد.

⁶دانشیار گروه پژوهشی بیوتکنولوژی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی،دانشگاه فردوسی مشهد.

تاریخ دریافت: 18/5/1391، تاریخ پذیرش: 26/7/1391

چکیده

فیتاز (مایواینوزیتول هگزا کیس فسفات فسفو هیدرولاز) آنزیمی هیدرولیزی است که فسفات معدنی تولید می‌کند. ژن کد کننده فیتاز phyC از باکتری باسیلوس سابتیلیس ATCC12711 جداسازی و توالی یابی شد. توالی نوکلوتیدی ژن فیتاز حاوی ناحیه کدکننده به طول 1089 جفت باز است که 90 نوکلوتید ابتدایی آن، مربوط به سیگنال پپتید ژن می‌باشد. به منظور تولید آنزیم فیتاز نوترکیب، ژن هدف به وکتور بیانی pET32a (+) وارد شد و وکتور نوترکیب پس از تکثیر در باکتری اشرشیا کلی DH5α به باکتری اشرشیا کلی BL21(DE3) به عنوان میزبان بیان منتقل شد. تحریک بیان ژن با استفاده از IPTG در غلظت نهایی 1 میلی مولار در دمای 30 درجه سانتی­گراد و حضور کلرید کلسیم 10 میلی­مولار صورت گرفت. نمونه‌گیری در زمان‌های صفر تا پنج ساعت انجام شد و میزان تولید پروتئین نوترکیب با استفاده از الکتروفورز بررسی گردید. فیتاز محلول حاصل از ژن phyC-Trx با موفقیت به شکل درون‌سلولی در باکتری اشرشیا کلی بیان شد. وزن مولکولی فیتاز نوترکیب تولید شده در حدود 64 کیلو دالتون تخمین زده شد. اندازه­گیری فعالیت آنزیمی با استفاده از روش استاندارد فسفاتاز، فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده را 44/7 واحد در میلی‌لیتر نشان داد. همچنین pH بهینه برای فعالیت آنزیم فیتاز قلیایی نوترکیب در حدود 7 برآورد شد. نتایج نشان داد که فیتاز بدست آمده از باکتری باسیلوس سابتیلیس به جهت پایداری حرارتی و همچنین هزینه پایین تولیدی گزینه مطلوبی جهت استفاده در صنعت می‌باشد.

کلمات کلیدی: آنزیم فیتاز، اسید فایتیک، بیش بیان، باسیلوس سابتیلیس.

مقدمه

فیتات (مایو اینوزیتول هگزاکیس فسفات) یکی از شکل­های اصلی فسفر در دانه­ها، لگوم­ها و دانه­های روغنی می­باشد (Harland and Morris, 1995). اسید فیتیک 1 تا 3 درصد وزن بسیاری از غلات و دانه­های روغنی را تشکیل می­دهد و به طور معمول 60 تا 80 درصد فسفر در این گیاهان به این شکل می­باشد (Graf, 1987). فیتاز (مایواینوزیتول هگزاکیس فسفات فسفوهیدرولاز) آنزیم هیدرولیز کننده فیتات به مایواینوزیتول­های پایین­تر و در بعضی موارد مایو اینوزیتول آزاد و فسفر معدنی می­باشد (Oh et al., 2004). اسید فایتیک عامل کلات کننده چند یونی است که اثرات ضدتغذیه­ای خود را به وسیله کلات کردن کاتیون‌های همچون مس، روی، آهن، منیزیوم و کلسیم نشان می­دهد (Kerovuo et al., 1998). این عمل سبب غیرقابل دسترس شدن و عدم جذب مواد معدنی در روده حیوانات تک‌معده از قبیل طیور، خوک و ماهیان می­شود (Cheryan, 1980). تامین جیره حیوانات اهلی با استفاده از فسفر معدنی نه تنها سبب کاهش اثر ضد تغذیه­ای اسید فایتیک نمی‌شود، بلکه به سبب دفع آنها باعث آلودگی آب‌های سطحی می­گردد (Nasi, 1990). علاوه بر این، اسید فایتیک با اثرگذاری بر جذب پروتئین­ها، نشاسته و لیپیدها کیفیت خوراک مصرف شده را کاهش می‌دهد (Liu et al., 2006). از این رو، استفاده از فیتازها در صنعت به خصوص در تغذیه حیوانات اهلی ارزشمند است. هرچند که فعالیت فیتازی در سلول­های حیوانی (Craxton et al., 1997)، گیاهی (Reddy et al., 1982; Gibson et al., 1988) و میکروارگانیسم­های مختلف (Greiner et al., 1993; Pasamontes et al., 1997; Berka et al., 1998) گزارش شده است. اما، ژن­های تولیدکننده آنزیم فیتاز در میکروارگانیسم­ها بیشتر مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است. هزینه پایین­تر و فعالیت بیشتر آنزیمی از مهمترین دلایل استفاده از این دسته فیتازها می­باشد.

در سال­های اخیر فیتازهای قارچی و باکتریایی بسیاری مورد بررسی قرار گرفته­اند. آنزیم فیتاز تولید شده توسط باکتری­های گرم مثبت و قارچ­ها خارج سلولی می­باشد (Powar and Jagannathan, 1982; Shimizu, 1992). گونه­های قارچی از جنس آسپرژیلوس[1] تولید هیستیدین اسید فیتاز (HAP) می­کنند که در pH پایین و اسیدی فعال است اما پایداری حرارتی کمی دارند (Dvorakova et al., 1997). در نقطه مقابل، گروه دیگری از فیتازها که به فیتازهای قلیایی مشهور هستند، فیتات را در pH قلیایی تخریب می­کنند. این گروهی از فیتازها در گونه­هایی از جنس باسیلوس ( Choi et al.,2001; Gulati et al., 2007; Tye et al., 2002)، دانه­های گیاهی، گرده تیفا لاتیفولیا[2](Hara et al., 1985)  و لیلیوم لانگیزوریوم[3] (Scott et al., 1986) گزارش شده است. هیستیدین اسید فیتازها (HAP) تنها قادرند فیتات­های بدون یون­های فلزی را بشکنند اما فیتازهای قلیایی به شکل ویژه­ای بر کمپلکس فیتات و کلسیم تاثیرگذار هستند (Oh et al., 2004). زمانی که مقدار زیادی از کلسیم در جیره حضور دارد، تنها فیتازهای قلیایی برای فعالیت در روده کوچک پیشنهاد می‌شوند (Van der Klis et al., 1997). از این­رو، phyC دارای ویژگی­های بیوتکنولوژی مهمی همچون پایداری حرارتی است که در پلت­سازی مواد خوراکی و فرآیندهای دمادهی ویژگی بسیار ضروری به نظر می­رسد. همچنین پروفایل pH، اختصاصی عمل کردن و وضعیت فیزیولوژیکی فیتات در روده کوچک از دیگر ویژگی‌های آنزیم فیتاز قلیایی می باشد. علاوه براین، فیتاز قلیایی می­تواند فیتات را به دو مایواینوزیتول تری فسفات (Ins(2,4,6)P3)  و Ins(1,3,5)P3)  بسیار کمیاب هیدرولیز کند (Kerovuo et al., 1998). این ترکیبات کمیاب در صنعت داروسازی کاربرد بسیاری دارند.

باکتری باسیلوس سابتیلیس دارای وضعیت GRAS[4] می­باشد و استفاده از آن در تولید مواد غذایی و دارویی توسط سازمان امنیت دارو و غذا تایید شده است. اگرچه فیتاز تولید شده توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس پتانسیل مناسبی را برای تخریب کمپلکس فیتات از خود نشان داده است، اما فعالیت و بازده آنزیمی آن به منظور استفاده در صنعت، نیازمند افزایش است. بنابراین، جداسازی فیتاز از میکروارگانیسم­های مختلف و بررسی ویژگی­های آنزیمی آن­ها امری ضروری به نظر می‌رسد (Choi et al., 2001). همچنین استفاده از سیستم­های بیانی مختلف می­تواند به انتخاب بهترین راه جهت تولید آنزیم­های هیدرولیزی کمک کند. در اشرشیا کلی دو سیستم بیانی بر پایه استفاده از پروموتر T7 پلی­مراز (سیستم pET) و پروموتر Ptac (سیستم pFLAG) به منظور تولید آنزیم­های نوترکیب استفاده گردیده است. در وکتورهای pET، ژن هدف تحت کنترل پروموتر قوی T7 باکتریوفاژ کلون می­شود اما وکتورهای Ptac نسخه جهش داده شده از پروموترهای lac هستند و فعالیت پایه آنها کم می­باشد. سیستم pET به منظور خاصیت انتخابی بالا و تنظیم بیان ژن طراحی گردیده است. در حالی­که سیستم Ptac برای کنترل بیان ژن در سطح بالا مفید خواهد بود (Yamabhai et al., 2011).

در گزارش قبلی، همسانه‌سازی، بررسی خصوصیات مولکولی و پیش‌بینی بیان مجازی ژن فیتاز در وکتور pTZ57R/T بیان شد (Ariannejad et al., 2012). در این مطالعه، ژن هدف، به وکتور بیانی pET32a(+) انتقال داده شده و سپس بیش بیان آن در باکتری اشرشیا کلی BL21(DE3) انجام گردیده است. همچنین اندازه­گیری فعالیت آنزیمی و تعیین pH مطلوب برای فعالیت صورت گرفت. این اولین گزارش رسمی از تولید آنزیم نوترکیب فیتاز در ایران می­باشد.

مواد و روشها

سویه­های باکتری، پلاسمیدها و محیط کشت­ها

باکتری باسیلوس سابتیلیس سویه ATCC12711 از مرکز کلکسیون باکتری و قارچ ایران خریداری شد. باکتری­های اشرشیا کلی DH5α و BL21(DE3) به عنوان میزبان استفاده شدند. پلاسمیدهای pTZ57 R/T (Fermentas) و pET32a(+) (Novagen) به عنوان وکتورهای کلونینگ و بیان ژن مورد استفاده قرار گرفتند. اشرشیا کلی حاوی وکتور دست­ورزی شده بر روی محیط کشت مایع Luria Broth (1درصد تریپتون، 5/0 درصد عصاره مخمر، 5/0 کلرید سدیم) حاوی  µg/ml100 آمپی­سیلین کشت داده شد. pH محیط کشت 5/7 تنظیم و سلول ها در 37 درجه سانتی‌گراد به شکل هوازی کشت داده شدند.

تکثیر ژن فیتاز

استخراج DNA ژنومی از باکتری باسیلوس سابتیلیسATCC12711  با استفاده از کیت استخراج (Bioneer ، کره جنوبی( انجام شد. ژن فیتاز phyC با استفاده از آغازگرهای اختصاصی رفت5' GTGCACGTTCATAAAAGGAGGAAG 3' و برگشت 5' TTGCATGTTTATTTTCCGCTTCT 3' تکثیر شد. این آغازگرها بر اساس ناحیه محافظت شده توالی 16sRNA باکتری­های باسیلوس سابتیلیس ثبت شده در بانک جهانی ژن طراحی شد. واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (PCR) با استفاده از 5/2 میکرولیتر بافر آنزیم Pfu (Fermentas)، 25/1 واحد از آنزیم Pfu پلی­مراز (Fermentas)، 1 میکروگرم DNA ژنومی، 5/2 میکرولیتر dNTP و 25/0 میکرومول از آغازگرها در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. برنامه حرارتی جهت تکثیر ژن فیتاز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (T-Personal) ساخت آلمان به صورت زیر انجام شد: واسرشت­سازی 60 ثانیه در C˚ 94، اتصال 45 ثانیه در C˚61 و بسط 45 ثانیه در C˚ 72 برای 35 سیکل. یک مرحله واسرشت­سازی اولیه در دمای C˚94 برای 3 دقیقه و یک مرحله بسط نهایی به مدت 10 دقیقه در C˚72 نیز انجام گردید. محصول PCR به وکتور کلونینگ pTZ57R/T وارد و سپس به اشرشیا کلی DH5α منتقل شد.

ساختار وکتور بیانی فیتاز

استخراج پلاسمید pTz57R/T+phyC با استفاده از کیت Miniprep، شرکت Fermentas صورت گرفت. ناحیه کدکننده ژن فیتاز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی لینکردار رفت 5' AGCGGGATCCCGCATGAATCATTCAAAAACACTT 3' و برگشت 5' GCCCAAGCTTGGGTTATTTTCCGCTTCTGTCGGTCAGT 3' تکثیر شد. محصول PCR حاوی ناحیه کدکننده ژن فیتاز به همراه جایگاه برشی آنزیم­های BamHI در انتهای 5' و HindIII در انتهای 3' بود. محصول PCR تخلیص شده و وکتور بیانی pET32a(+) با استفاده از آنزیم­های برشی BamHI و HindIII هضم شدند و سپس واکنش الحاق با استفاده از آنزیم T4 DNA لیگاز (Fermentas) صورت گرفت. پلاسمید نوترکیب حاصل از الحاق به منظور تکثیر به باکتری اشرشیاکلی DH5α و پس از استخراج پلاسمید به میزبان بیان اشرشیاکلی BL21(DE3) منتقل گردید و بر روی محیط کشت LB-Agar حاوی µg/ml100 آمپی‌سیلین کشت داده شد. غربالگری و انتخاب کلنی حاوی ژن هدف با استفاده از روش کلنی PCR انجام گردید. سپس تک کلنی دست‌‌ورزی شده به مدت 16 ساعت در 5 میلی­لیتر محیط کشت مایع LB حاوی آمپی‌سیلین کشت داده شد. 1 میلی­لیتر از محیط کشت تهیه شده به 1000 میلی لیتر محیط کشت مایع حاوی آمپی­سیلین اضافه و تا رسیدن به OD، 620 نانومتر در دمای 37 درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکردار انکوبه شد. در این مرحله، نمونه صفر برداشته و سپس IPTG در غلظت نهایی 1 میلی­مولار به محیط کشت اضافه شد. نمونه­برداری در ساعت­های 1، 2، 3، 4 و 5 به منظور مشخص کردن بیان فیتاز نوترکیب صورت گرفت. سلول ها با استفاده از بافر 2× SDS شکسته شدند و بر روی ژل اکریل آمید 12 درصد الکتروفورز شدند.

اندازه­گیری فعالیت آنزیمی

به منظور تعیین میزان فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده، باکتری­های اشرشیا کلی BL21(DE3) حاوی پلاسمید نوترکیب القا شده با IPTG در غلظت نهایی 1 میلی­مولار به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتی­گراد با سرعت  g11000 سانتریفیوژ شدند. سپس با استفاده از دستگاه اُلتراسونیک (میزونیکس،امریکا) با 30 پالس 5 ثانیه‌ای دیواره باکتری‌ها بر روی یخ شکسته شد. مطابق دستورالعمل سیستم pET (آلمان ،Novagen) آنالیز فعالیت آنزیمی بر روی محصول سیتوپلاسمی صورت گرفت. محلول سوبسترا به مدت 30 دقیقه در 30 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. محلول سوبسترا شامل 2/0 درصد وزن به حجم سدیم فیتات (آمریکا، Sigma) در بافر استات سدیم 1/0 مولار و کلرید کلسیم در غلظت نهایی 10 میلی‌مولار در دامنه‌های مختلف pH تهیه شد (Shimizu, 1992). واکنش با اضافه کردن 750 میکرولیتر از تری کلرواستیک اسید 5 درصد متوقف و ارتوفسفات آزاد شده در محلول اندازه‌گیری شد ( (Bae et al., 1999. محلول رنگی به وسیله مخلوط چهار حجم از آمونیوم مولیبدات 5/1 درصد در محلول سولفوریک اسید 5/5 درصد و یک حجم از سولفات فرئوس 7/2 درصد تهیه و 750 میلی­لیتر از آن به نمونه اضافه شد. رنگ تولید شده در نمونه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (امریکا، Genray) اندازه­گیری شد. محلول استاندارد از محلول پایه 9 میلی‌مولار فسفات دی هیدروژن پتاسیم به نسبت‌های مختلف ساخته و رنگ تولید شده در آن­ها نیز با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه­گیری و منحنی استاندارد آن­ها رسم شد. فعالیت یک واحد فیتاز برابر با 1 میکرومول فسفر معدنی آزاد شده در 1 دقیقه مورد محاسبه قرار گرفت.

ایمنوبلاتینگ

دات بلات از روش­هایی است که در آن نمونه پروتئین به شکل مستقیم بر روی یک غشای خاص لکه‌گذاری می­شود. این روش نسبت به روش­های دیگر ایمنوبلاتینگ سریع‌تر بوده و برای کار با تعداد نمونه‌های زیاد بسیار مناسب است. از این رو، 5 میکرولیتر از نمونه‌های جمع‌آوری شده از باکتری نوترکیب القا شده در زمان‌های مختلف پس از شکستن دیواره سلولی بدون اضافه کردن بافر 2×SDS بر روی کاغذ نیتروسلولز لود شد. پس از خشک شدن نمونه، جایگاه‌های آزاد موجود روی غشا با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) 5 درصد محلول در TBS بلوکه گردید. سپس غشا در محلول آنتی­بادی اولیه آنتی His-tag در TBST (TBS همراه با 1 درصد Tween20) با رقت 1 به 1000 برای یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس سه بار شستشو با TBST انجام گرفت و غشا در محلول آنتی­بادی ثانویه با رقت 1به 1500 برای یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه گردید. بعد از شستشو آنتی­بادی ثانویه، غشا با استفاده از محلول رنگ‌زای DAB  (امریکا، Sigma) رنگ آمیزی شد.

نتایج

واکنش زنجیره ای پلی­مراز

ژن فیتاز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی به خوبی تکثیر شد. ناحیه کدکننده آنزیم فیتاز به طرز مطلوبی از روی پلاسمید نوترکیب pTZ57R/T+phyC تکثیر و از ژل تخلیص شد. فراورده تکثیر خالص‌سازی شده حاوی جایگاه‌های برشی برای آنزیم‌های BamHI و HindIII بود به خوبی هضم و در جایگاه همسانه‌سازی وکتور pET32a(+) الحاق شد. ساختار پلاسمید نوترکیب pET32-PhyC در شکل 1 نشان داده شده است.

شکل 1- کلونینگ ژن فیتاز در وکتور pET32a(+). A: الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز 1درصد (ستون 1: ناحیه کدکننده فیتاز (1089 جفت باز)، M: نشانگر وزنی 1 کیلو جفت باز. B: الکتروفورز pET32a(+) بر روی ژل اگارز (ستون1: pET32a(+) طبیعی، ستون2: pET32a(+) هضم شده با آنزیم های BamHI و HindIII (5900 جفت باز)، M: نشانگر وزنی 1 کیلو جفت باز. C: الکتروفورز pET32a(+)+phyC بر روی ژل آگارز 1 درصد (ستون 1: pET32a(+) نوترکیب حاوی ژن هدف (7039 جفت باز)، M: نشانگر 1 کیلو جفت باز.

Figure 1- Cloning strategy for inserting PCR amplified PhyC gene in pET32a(+) vector. A: Electrophoresis of PCR products on 1% agarose gel (lane S1: phytase ORF (1089), M = 1 kb DNA Ladder). B: Electrophoresis of pET32a(+) on 1% agarose gel (lane S1: native pET32a(+), lane S2: BamHI and HindIII digested  pET32a(+) (5900bp), M = 1 kb DNA Ladder). C: Electrophoresis of pET32a+ PhyC on 1% agarose gel (lane S1: recombinant pET32 contain PhyC (7039bp), M = 1 kb DNA Ladder).

ژن Trx سبب بیش بیان پپتیدها و کاهش سمیت پروتئین­ها نوترکیب تولید شده در اشرشیا کلی میزبان می‌گردد (Yamabhai et al., 2011). در بین ژن Trx و ناحیه کدکننده فیتاز، 6 اسید آمینه هیستیدین قرار گرفته که به منظور شناسایی و تخلیص پروتئین از آن استفاده می­گردد. سایت شناسایی انتروکیناز در نزدیکی ژن هدف قرار دارد و استفاده از این آنزیم سبب حذف قطعه 20 کیلودالتونی اضافه شده توسط Trx و His₆ می‌گردد. محصول الحاق به شکل موفقی به اشرشیا کلی BL21(DE3) منتقل گردید و نتیجه کلنی PCR و هضم آنزیمی با آنزیم های BamHI و HindIII صحت انجام واکنش را تایید کرد (شکل 2).

شکل2- کلنی PCR وهضم دو آنزیمی وکتور بیانی نوترکیب. C: کنترل منفی، S1 تاS4: نتیجه کلنی PCR (1089 جفت باز)، M: 1 نشانگر وزنی 1کیلوجفت باز و S5 وS6 محصول هضم آنزیمی. pET32a (قطعه 5900 جفت بازی) و phyC (قطعه 1089 جفت بازی).

Figure 2- Electrophoresis of colony PCR and double digestion of cloning construct (pET32a with PhyC). C: negative control, S1-S4: Presence of PhyC in Vector (1089 bp), M: 1 kb DNA Ladder and S5,S6: Product of double digestion of pET32a (5900 bp, upper band), PhyC (lower band).

القای بیان ژن با استفاده IPTG 1 میلی­مولار به خوبی صورت گرفت. ترن و همکاران در سال 2010 گزارش کردند که اضافه کردن CaCl₂ در طول القای بیان ژن سبب افزایش فعالیت فیتازی می­گردد (Tran et al., 2010). بعد از 5 ساعت القای بیان ژن مقدار زیادی از پروتئین نوترکیب در درون سلول تولید شد. اما بعد از 16 ساعت القای بیان ژن افزایش پیدا نکرد. افزایش دمای انکوباسیون بیشتر از 37 درجه سانتی­گراد باعث کاهش سطح بیان ژن گردید. بیشترین فعالیت آنزیمی اندازه­گیری شده در حضور یون کلسیم U/ml 44 /7 بود.

وزن مولکولی آنزیم نوترکیب تولید شده با الکتروفورز پروتئین بر روی ژل اکریل آمید 12 درصد 64 کیلودالتون تخمین زده شد  که با برآورد انجام شده در نرم افزار CLC Workbench 5 همخوانی داشت (شکل3). چوی و همکاران در سال 2001 گزارش کردند که وزن مولکولی آنزیم طبیعی فیتاز در حدود 44 کیلودالتون می­باشد (Choi et., al 2001). تفاوت موجود بین فیتاز نوترکیب و فیتاز طبیعی ناشی از توالی­های نشانگری موجود در وکتور pET32a(+) است که به پروتئین نوترکیب نهایی اضافه گردیده است. وزن مولکولی نشانگرهای Trx، S Taq، His₆ Taq با استفاده از نرم افزار CLC Main Worckbench5 در حدود 21 کیلودالتون تخمین زده شد. از این رو انتظار می‌رود خالص سازی پروتئین با استفاده از ستون های کروماتوگرافی تمایلی نیکل (Ni-NTA) و برش آن با آنزیم انتروکیناز سبب افزایش  فعالیت آنزیمی شود.

شکل3- الکتروفورز پروتئین فیتاز نوترکیب تولید شده در اشرشیا کلی BL21(DE3). لاین C: کنترل منفی؛ لاین های S1 تا S3: سلول­های اشرشیا کلی استخراج شده در زمان­های 1، 3 و 5 ساعت القا شده با IPTG 1 میلی مولار؛ M: نشانگر وزن مولکولی.

Figure 3- SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the recombinant phytase in E. coli BL21 (DE3). Lane C, negative control; lane S1, S2, S3 cell extracts from E. coli BL21 (DE3) cultured for  1, 3, and 5 h after 1 mM IPTG induction and lane M, molecular mass markers.

آنالیز بلاتینگ

روش دات بلات روش مناسبی است که مشکلات انتقال در وسترن بلات را حذف می­کند. محلول رویی در زمان های 1، 3 و 5 لود شده و به منظور تایید پروتئین نوترکیب تولید شده از آنتی‌بادی اولیه آنتی His استفاده گردید. حضور نقاط رنگی بر روی کاغذ نیتروسلولز نشان داد که پروتئین نوترکیب در باکتری حامل پلاسمید طراحی شده با موفقیت بیان شده است.

شکل4- آنالیز دات بلات پروتئین نوترکیب بیان شده در اشرشیا کلی BL21(DE3). ستون S1، S2 و S3 عصاره سلولی اشرشیا کلی BL21(DE3) نوترکیب کشت داده شده در زمان­های 1، 3 و 5 ساعت بعد از القا با IPTG 1 میلی مولار.

Figure 4- Dot blot analysis of the phytase protein expressed in E. Coli BL21(DE3). Lane S1, S2, S3 cell extracts from E. coli BL21 (DE3) cultured for 1, 3, and 5 h after 1 mM IPTG induction.

اثر pH بر روی فعالیت آنزیمی

اثر دامنه‌های مختلف pH بر روی فیتاز قلیایی طبیعی توسط کراوو و همکاران تعیین شد (Kerovuo et al., 1998). آن­ها گزارش کردند که pH بهینه برای فعالیت انزیم فیتاز قلیایی 7 می­باشد. نتایج این بررسی نشان داد که pH بهینه جهت فعالیت آنزیم فیتاز بدست آمده از باکتری باسیلوس سابتیلیس ATCC12711 در دامنه pH 6 تا 5/8 قرار دارد و بیشترین فعالیت آن در 7pH= بود (شکل 5).

شکل 5- فعالیت فیتاز بیان شده در دامنه‌های مختلف pH.

Figure 5- The activity of expressed phytase was determined at different pH.

بحث

فیتازهای مورد استفاده در جیره حیوانات اهلی بایستی در برابر حرارت، فرآیندهای آماده‌سازی و انبار مقاوم باشد. همچنین، هزینه پایین تولید و موثر بودن در آزادسازی فسفر در روده باریک از دیگر ویژگی­های مهم آنزیم­های هیدرولیزی محسوب می­شود. مقاومت حرارتی فیتاز تولید شده از جنس باسیلوس در دامنه 60 تا 95 درجه سانتی­گراد گزارش شده است. از این رو تحقیقات گسترده­ای برای تولید آنزیم فیتاز از باکتری باسیلوس سابتیلیس صورت گرفته است (Tran et al., 2010، Kim et al., 1998، Kerovuo et al., 1998). در مقایسه با فیتازهای تجاری تولید شده توسط اسپرژیلوس نایجر و اشرشیا کلی، آنزیم نوترکیب تولید شده توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس نسبت به حرارت پایدارتر می­باشد. متاسفانه فعالیت فیتاز آنزیم­های قلیایی نسبت به آنزیم های اسیدی کمتر می­باشد که ضرورت انجام کارهای تحقیقاتی بیشتر بر روی این دسته از آنزیم­ها را ایجاب می­کند.

فعالیت فیتاز تولید شده در این مطالعه، مانند اکثر فیتازهای تولید شده در جنس باسیلوس در 7pH= بهینه بود. فیتات هضم نشده در روده کوچک اثر منفی بر جذب مواد معدنی دارد. انتظار می­رود تنها فیتازهای قلیایی برای هضم فیتات در روده کوچک مفید باشند. فیتازهای قلیایی دارای بیشترین فعالیت در دامنه pH 6 تا 9 در حضور یون کلسیم هستند (Choi et al., 2001). حضور یون کلسیم با غلظت 2 تا 5 میلی­مولار برای فعالیت آنزیم فیتاز قلیایی ضروری است. در حضور کلریدکلسیم 5 میلی­مولار در 7pH=، حدود 40 درصد از فعالیت آنزیمی بعد از 10 دقیقه در 100 درجه سانتی­گراد مشاهده شده است (Tran et al., 2010). فیتاز US417 در غیاب یون کلسیم پایدار و در 50 درجه سانتی­گراد فعال بوده است (Farhat et al., 2008). همچنین این گروه گزارش کردند که اسید آمینه پرولین در موقعیت 257 در پایداری حرارتی انزیم فیتاز تاثیرگذار است. در بیان ژن فیتاز باسیلوس سابتیلیس در مخمر پیشیا پاستوریس، فعالیت آنزیمی در حضور CaCl2 5 میلی­مولار و 5/5 pH= در دمای 80 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه مشاهده شد (Olazaran et al., 2010). به منظور استفاده از وکتور بیانی pET در تولید نیمه صنعتی آنزیم­ها، استفاده از لاکتوز به جای IPTG پیشنهاد شده است. گزارش­ها نشان می­دهد که بیشترین میزان القای بیان بعد از 4 ساعت با لاکتوز بدست می­آید ((Olazaran et al., 2010. تاخیر در تولید آنزیم هنگام استفاده از لاکتوز به جای IPTG می­تواند ناشی از فرآیند تبدیل لاکتوز به آلولاکتوز باشد (Tran et al., 2010).

نتایج این مطالعه همانند دیگر تحقیقات در زمینه تولید فیتاز قلیایی از باکتری باسیلوس سابتیلیس نشان داد که ژن phyC در مقایسه با فیتازهای تجاری آسپرژیلوس نایجر و اشرشیا کلی دارای مزیت­های خاصی جهت استفاده در صنعت خوراک حیوانات اهلی است (Kim et al., 1998; Tran et al., 2010; Olazaran et al., 2010). همچنین می­توان از این آنزیم در صنعت داروسازی استفاده کرد (Kerovuo et al., 1998). با توجه به اینکه این اولین گزارش رسمی تولید آنزیم نوترکیب فعال فیتاز در ایران بوده، آنزیم فیتاز قلیایی تولید شده در باکتری باسیلوس سابتیلیس در این مطالعه با شماره دسترسی 76111 در اداره ثبت مالکیت صنعتی به عنوان اختراع ثبت گردید.

تشکر و قدردانی

این مقاله مستخرج از پروژه پژوهشی به شماره 100315 مصوب معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه فردوسی مشهد می­باشد که بدین وسیله از آن معاونت محترم تقدیر و تشکر می­گردد. تصویب این پروژه از محل حمایت­های مالی ستاد سلول های بنیادی می­باشد که مراتب تشکر و قدردانی را از آن ستاد محترم داریم. پروژه در آزمایشگاه­های دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری زیستی دانشگاه فردوسی مشهد انجام گرفته و بدین ترتیب از مسؤلان مربوطه کمال تشکر را داریم.