استفاده از روش رگرسیون متغیر های ظاهری برای پیش بینی مقدار تولید شیر و چربی در جمعیت گاوهای هلشتاین ایران

استفاده از روش رگرسیون متغیر های ظاهری برای پیش بینی مقدار تولید شیر و چربی در جمعیت گاوهای هلشتاین ایران

حامد خراتی کوپایی*¹، محمد رضا محمدآبادی²

1. دانش آموخته دوره کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح نژاد دانشگاه شهید باهنر کرمان.

2. دانشیار بخش علوم دامی دانشگاه شهید باهنر کرمان

تاریخ دریافت: 17/5/1391، تاریخ پذیرش: 4/10/1391

چکیده

ژن DGAT1  به عنوان یک  ژن کاندید در کروموزوم شماره 14 برای درصد چربی و تولید شیر مطرح می باشد. این ژن با کد کردن آنزیم دی آسیل گلیسرول اسیل ترانسفراز  نقش اصلی را در سنتز تری گلیسیرید و در نهایت چربی شیر دارد. در این پژوهش 398 نمونه خون از گاوهای هلشتاین استانهای تهران و اصفهان جمع آوری گردید، با انجام واکنش PCR یک قطعه 411 جفت بازی از اگزون شماره 8 این ژن تکثیر گردید. تعیین ژنوتیپ افراد جمعیت با استفاده از تکنیک PCR-RFLP  انجام شد. بر اساس نحوه برش آنزیم CfrI سه نوع ژنوتیپ KK ،KA ،AA  شناسایی شدند، همچنین فراوانی آللی K و A به ترتیب برابر با 37/0 و 63/0 تعیین شدند. سپس با استفاده از برازش GLM ، صفاتی که اثر ژن DGAT1 برا ی آنها معنی دار بود تعیین شدند و در نهایت با استفاده از کد بندی عامل های مدل و رگرسیون متغیر های ظاهری، مدل های پیش بینی ارائه شدند. از ضریب همبستگی بین رکورد های واقعی و پیش بینی شده به عنوان معیار اعتبار سنجی مدل های ارائه شده استفاده شد. نتایج این پژوهش نشان داد که مدل های ارائه شده برای پیش بینی صفات تولید شیر 305 روز، ارزش اصلاحی درصد چربی و درصد چربی بر اساس دو بار دوشش در روز،  تا حدودی قادر به پیش بینی تولید می باشند اما به دلیل استفاده از حجم اطلاعات کم، مقدار عددی ضرایب همبستگی به میزان کمی برآورد شدند. با استفاده از اطلاعات ژن ها  و رکورد های یبشتر می توان نتایج دقیق تری بدست آورد.

کلمات کلیدی: ژن DGAT1، رگرسیون، پیش بینی تولید و همبستگی.

مقدمه

تحقیقات نشان داده است که جایگاه های موجود روی کروموزوم ها مسئول تغییرات در صفات مهم اقتصادی هستند (Geldermann, 1975) در سال های اخیر پروژه های گوناگونی برای شناسایی ژن های کاندید موثر بر صفات اقتصادی در گاو های شیری  انجام شده است برای نمونه ژن های کاندیدی روی کروموزوم 14، به ویژه در جمعیت گاو های هلشتاین برای میزان چربی شناسایی شده است (Grisart et al., 2002; Coppieters et al., 1998; Riquet et al., 1999 ). ژن DGAT1 با کد کردن آنزیم دی آسیل گلیسرول اسیل ترانسفراز  نقش اصلی را در سنتز تری گلیسیرید و در نهایت چربی شیر دارد. جهش تک نوکلئوتیدی (SNP) باعث جایگزینی آدنین با گوانین در توالی DNA، و به دنبال آن   موجب تغییر اسید آمینه لیزین به آلانین در آنزیم دی آسیل گلیسرول اسیل ترانسفراز می­شود، این جهش تک نوکلئوتیدی می تواند اثر قابل توجهی را روی تولید شیر و ترکیبات آن ایجاد می کند (Grisart et al., 2002). در پژوهشی چند شکلی ژن ­­­­­DGAT1 و میزان اثر آن به روی تولید و ترکیب شیر در نژاد هلشتاین و فلکویه در کشور آلمان مورد بررسی قرار گرفت.  ژنوتیپ افراد با استفاده از تکنیک RFLP-PCR تعیین شد. بررسی میزان اثر ژن DGAT1 روی صفات تولید و تر­کیب شیر در نژاد هلشتاین  نشان داد که این ژن، درصد چربی و پروتئین به مقدار 28/0 و 06/0 درصد افزایش می­دهد (Thaller et al., 2003). در پژوهشی که روی گاوهای شیری نژاد هلشتاین، جرسی و ایر‏شایر نیوزیلند انجام شد، اثر ژن DGAT1 روی چربی و پروتئین شیر برای نژاد هلشتاین و جرسی در سطح 5 درصد معنی دار گزارش گردید. همچنین میزان اثر ژنوتیپ روی تولید شیر در نژاد ایر شایر معنی دار سطح 5 درصد تشخیص داده شد. متوسط اثر جایگزینی آللی برای پروتئین برابر با 2 تا 3 کیلوگرم برای نژاد هلشتاین تعیین شد. همچنین میزان  اثر جایگزینی آللی چربی شیر برای نژاد هلشتاین 6 کیلوگرم و برای نژاد جرسی 3 کیلوگرم گزارش گردید. (Spelman et al., 2002). اخیرا کشور های زیادی با به اشتراک گذاشتن اطلاعات ژنومیکی هزاران SNP وارد سیستم ارزیابی ژنتیکی شده­اند (Hayes et al., 2009; VanRaden et al., 2009). این موضوع بیانگر این مطلب است که اطلاعات ژنومیکی هم اکنون به عنوان یکی از مهم ترین منبع اطلاعات برای ارزیابی ژنتیکی در گله های گاو شیری مطرح می باشد (Liu, 2010). تا کنون پژوهش های گسترده ایی با استفاده از مدل سازی برای پیش بینی اثر ژن های بزرگ اثر و رکورد های صفات اقتصادی صورت گرفته است (Szyda et al., 2011; Liu, 2010; Szyda et al., 2005 ). برای نمونه، در پژوهشی که روی گله­های شیری هلشتاین کشور لهستان انجام گرفت از اطلاعات رکورد 1227 فرد و SNP50K، برای 29 صفت مهم اقتصادی ارزیابی ژنومیکی انجام شد. در این پژوهش با استفاده از ضریب همبستگی، میزان دقت ارزش های اصلاحی برآورد شده مورد آزمون قرار گرفت. نتایج  نشان دادند که ضریب همبستگی برای کیلوگرم تولید شیر ، پروتئین و چربی به ترتیب برابر با 43/0، 44/0 و 31/0 می باشد (Szyda et al., 2005). در پژوهشی دیگر که روی جمعیت گله های شیری هلشتاین کشور آلمان انجام گرفت با استفاده از مدل سازی و اطلاعات 4500 فرد واریانس ژنتیکی صفات تولیدی شیر ناشی از ژن کاندیدا برآورد گردید (Szyda et al., 2011). نسبت واریانس ناشی از ژن کاندید برای سه دوره شیردهی برای تولید شیر برابر با 04/0 ، 030/0 و 07/0 برآورد شد. این نسبت برای تولید چربی نیز برابر با 06/0، 08/0 و 14/ 0 برآورد گردید (Szyda et al., 2011). هدف از این مقاله ارائه مدل برای پیش بینی رکوردهای صفات مطرح شده با استفاده از روش رگرسیون متغیر های ظاهری در جمعیت مورد مطالعه می باشد. معمولا متغیر های معادلات رگرسیونی  مقادیری از یک دامنه پیوسته اختیار می کنند  ولی در برخی از موارد متغیرها دارای سطوح ناپیوسته هستند در این گونه موارد باید به هرکدام از عوامل سطوح (کد) مشخصی را اختصاص داد به این متغیرها، متغیر های ظاهری می گویند  متغیر های ظاهری معمولا (نه همواره) با سطوح فیزیکی که به آنها اختصاص می یابد بی ارتباط هستند. در واقع کد بندی عوامل ناپیوسته به این معناست که هرکدام از این عوامل دارای اثر معین روی متغیر پاسخ هستند. به عنوان مثال ژنوتیپ ها در این پژوهش ناپیوسته هستند و باید برای هر ژنوتیپ کد مشخصی در نظر گرفته شود.  باید به این نکته توجه داشت که برای گزینش متغیرهای ظاهری روش منحصر به فردی وجود ندارد البته اگر بتوانیم از این ویژگی برای بهره برداری از شکل خاصی از داده ها استفاده کنیم آنگاه این موضوع به نقطه قوت تبدیل می شود (Bazargan-Lari, 2005).

مواد و روش ها

نمونه گیری و تعیین ژنوتیپ

در این پژوهش 398 نمونه خون از گله گاو های هلشتاین زایش اول استان های اصفهان و تهران جمع آوری گردید. جزییات نمونه ها در جدول 1 نشان داده شده است.

جدول 1- تعداد نمونه ها در گله ها.

Table 1- Number of samples in herds.

استخراج DNA با استفاده از روش نمکی انجام گرفت(Lien et al. 1990; Miller et al. 1988). نمونه­های استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر بر اساس50 نانوگرم DNA در هر میکرولیتر با استفاده از آب دوبار تقطیر رقیق شدند. برای انجام واکنش PCR از آغازگرهای رفت و برگشت زیر استفاده گردید (Kaupe et al., 2004):

5′-GCACCATCCTCTTCCTCAAG-3′                                                                              5′-GGAAGCGCTTTCGGATG-3′.

قابل ذکر است که جایگاه DGAT1  با شماره 077528EU¹ در بانک اطلاعاتی NCBI به ثبت رسیده است (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/eu077528). سیکل های حرارتی PCR به صورت زیر انجام شد: واسرشته سازی اولیه: در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه‏، 35 چرخه با واسرشته سازی در 94 درجه سانتیگراد و به مدت 60 ثانیه، اتصال به مدت 60 ثانیه در دمای 60 درجه سانتیگراد و سنتز در دمای 72 درجه سانتیگراد و به مدت 60 ثانیه. سنتز نهایی: به مدت7 دقیقه و در دمای 72 درجه سانتیگراد. واکنش PCR در حجم 15 میکرو لیتر و با استفاده از 100 نانوگرم DNA ژنومی و 5/1 میکرولیتر از PCR بافر 10X، 5/1 میلی مولار MgCl₂، 4/0 میلی مولار dNTP، 6/0 پیکو مول از هر آغازگر، 5 درصد DMSO و 1 واحد آنزیم Taq پلیمراز انجام شد. افزودن 5 درصد DMSO به واکنش اجازه تکثیر برابر هر برای هر دو آلل را می دهد. با انجام واکنش PCR قطعه 411 جفت بازی از ژن DGAT1، که دربرگیرنده جایگزینی K232A است تکثیر شد. برای شناسایی تغییرات آلل در مکان های نوکلئوتیدی 10433 و 10434 ژن DGAT1، 5 میکرولیتر از DNA تکثیر شده با 2 واحد از آنزیم برشیCfrI به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد هضم شد. محصولات برش داده شده در ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز شدند و در نهایت ژل آگارز با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی گردید. با استفاده از تکنیک RFLP مشخص شد که  آلل  Kبا آنزیم برشی بریده نمی شود و آلل A بریده می شود. افراد KK، بدون جهش  افراد KA دارای یک آلل جهش یافته و افراد AA در هر دو آلل آنها جهش صورت گرفته است. افرادی که تنها در ناحیه 411 جفت بازی دارای باند هستند، جهش در آنها رخ نداده است و به شکل وحشی باقی مانده اند. افرادی که در دو ناحیه 411 جفت بازی و 203 یا 208 جفت بازی دارای باند هستند، هتروزیگوت می باشند و در نهایت افرادی که دارای دو باند در ناحیه 203 و 208 جفت بازی هستند، هموزیگوت جهش یافته می باشند  به علت نزدیک بودن دو قطعه 203 و 208 جفت بازی افراد AA به شکل یک باند ضخیم روی ژل قابل تشخیص هستند .برای تایید صحت انجام PCR و تعیین ژنوتیپ نهایی افراد از نشانگر اندازه PUC Mix 8 استفاده گردید.

آنالیز آماری و ارائه مدل

 با استفاده از نسخه 16 نرم افزار SPSS و رویه GLM  اثر ژنوتیپ های بدست آمده در قالب یک مدل اثرات ثابت[1] مورد بررسی قرار گرفتند. مدل استفاده شده در این پژوهش شامل عامل­های زیر بود:                                    

y_ijkmnr=µ+G_i+ S _j+ M_k+N_m+C_n+e_ijkmnr

در این مدل عاملها عبارتند از y : مشاهده برای هر صفت، µ: اثر میانگین، G: اثر ژنوتیپ ها در سه سطح، S: اثر گله در 10 سطح، M: اثر سال تولد در 5 سطح ،  Nاثر ماه تولد در 12 سطح C: اثر سال زایش در 5 سطح. : اثر عوامل ناشناخته . قابل ذکر است که چون تمام افراد مورد مطالعه در اولین دوره شیردهی بوده اند از آوردن اثر دوره شیردهی در مدل خودداری شده است. باید توجه داشت که هدف از انجام این آنالیز تعیین  صفاتی است که اثر ژنوتیپ ها بر آنها معنی دار می باشد، چون مدل های پیش بینی باید برای صفاتی ارائه شوند که اثر ژن برای آنها معنی دار باشد. سپس با استفاده نسخه 16 نرم افزار  SPSS  ضرائب رگرسیونی برای عامل های مدل برآورد شدند. در نهایت با استفاده از ضرایب رگرسیونی معنی دار، مدل­های پیش بینی تولید افراد جمعیت ارائه شد. تعداد  رکورد ها و صفات مورد مطالعه در جدول شماره دو نشان داده شده اند.

برای ارائه مدل از رگرسیون متغیر های ظاهری بر رکورد ها استفاده گردید در این بخش با کد بندی عامل­های مدل، رگرسیون کد ها بر رکورد ها به عنوان ضرائب رگرسیون استفاده گردید. برای ژنوتیپ­های KK، KA و AA کد های 1، 2 و 3. برای اثرات گله کد های 1 تا 10 . سال تولد کد های 1 تا 5. جزئیات  نحوه  کد بندی در جدول 2 نشان داده شده است. از مدل کلی رگرسیونی زیر برای پیش بینی رکوردها استفاده گردید.

                                   Y=β₀+αZ + ε                                                                    

در این مدل Y میزان تولی، β₀ میانگین، αضرائب رگرسیونی برای اثرات ژنوتیپ،گله، سال تولد، ماه تولد و سال زایش، Z کد های اثرات ژنوتیپ، گله، سال تولد، ماه تولد و سال زایش و ε میزان خطا. قابل ذکر است که ضرائب رگرسیونی معنی دار برای پیش بینی تولید در مدل نهایی مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت برای آزمون مدل­های پیش بینی از ضریب همبستگی بین رکورد های حقیقی و پیش بینی شده (توسط مدل) استفاده گردید.

نتایج و بحث

به منظور تائید تکثیر قطعه مورد نظر، محصولات PCR با استفاده از الکتروفورز بروی ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفتند. مشاهده تنها یک باند 411 جفت بازی با کمک استفاده از نشانگر اندازهPUC Mix 8  ، نشان دهنده تکثیر درست قطعه انتخاب شده از اگزون شماره 8 ژن DGAT1 و صحت انجام PCR بود.

جدول 2- تعداد رکورد های مورد استفاده.

Table 2- Number of used records.

جدول 3- نحوه کد بندی عامل های مدل.

Table 3- Coding of effects model.

شکل 1-  نتایج حاصل از انجام PCR.

Figure 1- Results of PCR reaction.

در پژوهش انجام شده، جایگاه مورد مطالعه در 398  نمونه، 100 درصد چند شکلی نشان دادند، نتایج تعیین ژنوتیپ افراد مورد مطالعه نشان داد که فراوانی آلل های K و A به ترتیب برابر با 37/0 و 63/0 می باشد. همچنین فراوانی های ژنوتیپی KK، KA و AA به ترتیب برابر با 09/0 ، 56/0 و 34/0 برآورد گردید. نتایج تعیین ژنوتیپ با با نتایج (Naghdi et al.2010) که فراوانی آلل های DGAT^A و  DGAT^K را به ترتیب برابر با 67/0 و 33/0 در جمعیت ماده گاو های هلشتاین استان اصفهان گزارش کردند تقریبا همخوانی دارد،  شکل 2 نمونه ای از تعیین ژنوتیپ افراد را نشان می دهد.

شکل 2 -  نمونه ایی از تعیین ژنوتیپ افراد در جمعیت.

Figure 2- Genotyping of samples population. 

در پژوهشی که روی گاو های نر هلشتاین استان خراسان انجام گرفت، فراوانی آلل های DGAT^A و  DGAT^K برابر با 21/0و 79/0 تخمین زده شد (Hosseinpour et al., 2011). نتایج آماری این پژوهش نشان داد که اثر ژن DGAT1 به روی تمام صفات مورد مطالعه در سطح یک درصد معنی دار می باشد. جزییات تجزیه واریانس در جدول 4 نشان داده شده است.

جدول 4- نتایج حاصل از تجزیه واریانس

Table 4- Results of analysis variance.

با استفاده از برآورد ضرائب رگرسیون مدل­های پیش بینی صفات به شرح زیر ارائه شدند.                                                                     

Y_EBVFP= - 0.116+0.034Z₁+0.013Z₂

در این مدل 116/0 میانگین، 034/0 ضریب رگرسیون برای اثر ژنوتیپ، 013/0 ضریب رگرسیون برای اثر گله و Z₁ و Z₂ کد های اثرات ژنوتیپ و گله می باشند.

Y_FATP2X= 3.486+0.062Z₁-0.056Z₂-0.002Z₃

در این مدل 486/3 میانگین، 062/0 ضریب رگرسیون برای ژنوتیپ، 056/0- ضریب رگرسیون برای اثر گله و 002/0- ضریب رگرسیون برای ماه تولد.Z₁، Z₂ وZ₃ کد های اثرات ژنوتیپ، گله و ماه تولد می باشد.

Y_Milk305=9601.37+587.87Z₁+288.78Z₂-1917.94Z₃

در این مدل 37/9601 میانگین، 87/587 ضریب رگرسیون ژنوتیپ، 78/288 ضریب رگرسیون گله و 94/1917- ضریب رگرسیون سال تولد. Z₁، Z₂ و Z₃ کد های اثرات ژنوتیپ، گله و سال تولد.                 

در این پژوهش به دلیل اینکه ضرایب رگرسیون برآورد شده برای اثرات مدل صفات FAT_2X و Milk _2x معنی دار نبودند، مدل پیش بینی برای این صفات ارائه نگردید. نتایج حاصل از میزان ضریب همبستگی بین رکورد های حقیقی و پیش بینی شده در جدول 5 خلاصه شده اند.       

جدول 5- ضرائب همبستگی بین رکورد های پیش بینی شده و رکورد های حقیقی.

Table 5- Correlation coefficients between predicted and true records.

* معنی داری در سطح 05/0   ** معنی داری در سطح 01/0.

**Significant in level 0.01          *Significant in level 0.05          

با توجه به ضرائب همبستگی  صفات FAT_P2X، Milk₃₀₅و  EBV_FP  می توان دریافت که مدل های ارائه شده توانسته است تا حدودی رکورد های افراد جمعیت را پیش بینی کند. یکی از مهم ترین دلایل پایین بودن ضرائب همبستگی  این است که صفات مورد مطالعه جز صفات پلی ژنیک هستند و تحت کنترول تعداد زیادی ژن هستند، در صورتی که تنها اثر یک ژن بزرگ اثر (DGAT1) در مدل وارد شده است. یکی از دلایل دیگر پایین بودن ضرائب همبستگی استفاده از تعداد کم رکورد می باشد، پر واضح است که با افزایش تعداد  رکورد ها می توان ضرائب رگرسیون را دقیق تر برآورد کرد و ضریب همبستگی را افزایش داد. قابل ذکر است که با بسط مدل های ارائه شده و وارد کردن سایر اثرات موثر بر تولید به خصوص ژن های بزرگ اثر دیگر می توان پیش بینی دقیق تری از رکوردهای تولید داشت. بهترین نمونه برای این مطلب مقایسه نتایج این پژوهش با نتایج پژوهش انجام شده در کشور لهستان می باشد Szyda et al., 2005)). مهم­ترین عامل تفاوت قابل توجه میان ضرائب همبستگی ها، مربوط به تعداد SNP ها (SNP50K) و رکوردهای (1227) مورد استفاده در دو پژوهش می باشد. با وجود اینکه مقدار ضرایب همبستگی  به میزان کمی  برآورد شدند، اما از نظر آماری معنی دار تشخیص داده شدند که این امر با توجه به واریانس ناشی از DGAT1 برای این صفات قابل توجیه می باشد. نتایج حاصل از واریانس ناشی از ژن بیان کننده این مطلب است که بخش اعظم واریانس صفات FAT_P2X، Milk₃₀₅ و EBV_FP در جمعیت به وسیله جایگاه ژن 1DGAT کنترل می شود. با توجه به این که صفت مورد مطالعه جز صفات پلی ژنیک می­باشد و توسط جایگاه های زیادی کنترل می­شود (به این معنا که هر کدام از این جایگاه ها بخشی از واریانس مربوط به صفت را در جمعیت کنترل می­کنند)، اما با این حال واریانس ناشی از ژنDGAT1  نشان دهنده اثر قابل توجه این ژن در جمعیت می‏باشد. به طوری که مطالعات نشان دادند واریانس جایگاه ژن 1DGAT برای صفات FAT_P2X، Milk₃₀₅ و EBV_FP  به ترتیب برابر با 07/3 ، 82/0 و 89/0 درصد می­باشد (Kharrati koopaee et al., 2011).