مقایسه بیان ژن PNOC و NPYدر جوجه خروس‌های گوشتی سویه راس تغذیه شده با عصاره گیا ه خرفه

وکیلی, رضا; زکی زاده, سونیا

doi:10.22103/jab.2014.1228

تعداد نشریات	26
تعداد شماره‌ها	447
تعداد مقالات	4,557
تعداد مشاهده مقاله	5,380,005
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	3,580,078

مقایسه بیان ژن PNOC و NPYدر جوجه خروس‌های گوشتی سویه راس تغذیه شده با عصاره گیا ه خرفه

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 11، دوره 5، شماره 4، اسفند 1392، صفحه 151-164 اصل مقاله (3.14 M)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2014.1228

نویسندگان

رضا وکیلی؛ سونیا زکی زاده

چکیده

این آزمایش به منظور بررسی میزان بیان ژن prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY) در جوجههای تغذیه شده با عصاره گیاهی خرفه انجام شد، تعداد250 قطعه جوجه نر یک روزه سویه راس 308 به صورت تصادفی به 5 تیمار غذایی هر کدام با 5 تکرار اختصاص یافتند. هر تکرار شامل تعداد 10 قطعه جوجه بود و اثرسطوح مختلف عصاره خرفه در قالب تیمارهای مختلف بر بیان ژن های مؤثر بر اشتهای جوجههای گوشتی طی یک دوره 42 روزه بررسی شد. تیمارهای غذایی شامل 5 تیمار شاهد (جیره پایه بدون عصاره خرفه)، جیره پایه همراه 50،100،150 و 200 میلی گرم عصاره گیاه خرفه بودند. برای تعیین میزان بیان ژنهای PNOC و NPYاز روش لیواک استفاده شد. در پایان 42 روز 2 پرنده از هر تکرار به طور تصادفی انخاب و کشتار شده و بافت ساقه مغز آنها برای تعیین اثر تیمارها بر میزان بیان ژنهای PNOC و NPY استفاده شد. بیان ژنNPY در تیمارهای حاوی خرفه نسبت به شاهد از نظر آماری تفاوت معنیداری نداشت، اگرچه در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر بود. بیان ژنPNOC در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر از شاهد بود ((p>0.01، در حالیکه سایر تیمارهای حاوی خرفه نسبت به شاهد تفاوت معنیداری نداشتند. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که استفاده از 200 میلی گرم عصاره خرفه سبب افزایش معنیدار بیان ژن PNOC و افزایش غیر معنیدار بیان ژن NPY گردید، لذا میتوان عصاره خرفه را در افزایش بیان ژنهای نوروپپتیدهای افزاینده اشتها موثر دانست.

کلیدواژه‌ها

عصاره دانه خرفه؛ Prepronociceptin (PNOC)؛ Neuropeptide Y(NPY)؛ جوجه گوشتی؛ بیان ژن

اصل مقاله

مقایسه بیان ژن PNOC و NPYدر جوجه خروسهای گوشتی سویه راس تغذیه شده با عصاره گیا ه خرفه

رضا وکیلی¹*، سونیا زکی زاده²

¹ استادیار گروه علوم دامی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کاشمر

² استادیار گروه علوم دامی مجتمع آموزش عالی جهادکشاورز ی خراسان رضوی

تاریخ دریافت: 08/03/1391، تاریخ پذیرش: 16/11/1391

چکیده

کلمات کلیدی: عصاره دانه خرفه، Prepronociceptin (PNOC)، Neuropeptide Y(NPY)،جوجه گوشتی، بیان ژن.

مقدمه

تحقیقات انجام گرفته در مورد سازوکار های کنترل اشتهای پرندگان از سه دهه قبل آغاز شده است. ولی هنوز موارد بسیاری در این زمینه ناشناخته باقی مانده است. هیپوتالاموس نقش مهمی را در دریافت و پردازش سیگنالهای مربوط به اشتها برعهده دارد و از دو گروه نورونی تشکیل شده است . یکی از این گروهها اشتها را کم می کند.گروه دیگر دریافت غذا را از طریق تنظیم بیان ژن نوروپپتید وایNPY) ) و پپتید مرتبط با ژن آگوتی (AgRP) تحریک میکند.NPY یکی از فراوانترین میانجی‏های مغز است. میزان NPY در هیپوتالاموس تابعی از وضعیت تغذیهای بدن است، به طوری که در طی گرسنگی میزان آن افزایش و پس از تغذیه کاهش می‏یابد. مهمترین بخش هیپوتالاموس که در آن NPY بیان می‏گردد، هستهی کمانی استBungo et al., 2011) ). نورون‏های حاوی NPY در هستهی کمانی به هستهی مجاور بطنی (PVN) کشیده می‏شوند و تزریق مکرر درون بطن مغزی[1] (ICV) NPY به درونPVN پرخوری و چاقی ایجاد می‏کند. تزریق مرکزی NPY مصرف انرژی را نیز کاهش می‏دهد که منجر به کاهش میزان چربی قهوهای، تضعیف فعالیت سمپاتیک و مهار محور هیپوتالاموس ـ هیپوفیزقدامی ـ تیروئید می‏گردد(Kelley et al., 2002 Kiris et al., 2007,). ماده Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) یک اوپیوئید مرتبط باهپتا دکاپپتید بوده و آگونیست گیرندههای ORL1 است (آگونیست ماده ای است که به رسپتور متصل و تحریک فیزیولوژیک آن را باعث میشود). مطالعات اخیر نشان داده است که تزریق داخل بطن مغزی این ماده سبب افزایش اشتها میگردد (Pawel et al., 2010). PNOC مولکول پیش سازی است که ساختار مشابه Nociceptin/OrphaninFQ دارد (1996 (Mollereau et al.,.

دادههای مقدار بیان ژن معمولا توسط سطوح بیان ژن کنترل که اصطلاحا ژن خانگی نامیده میشود، نرمال میگردند. گلسیرآلدئید تری فسفات دهیدروژناز یکی از رایجترین ژنهای خانگی است که برای مقایسه دادههای بیان ژن کاربرد فراوانی دارد. در انسان مشخص شده است که سن و جنس تاثیری روی مقدار بیان mRNA بافتها ندارند و میتوان از مقایسه سطوح بیان شده این ژن برای دادههای بیان ژن به عنوان کنترل داخلی استفاده نمود (Barber et al., 2005).

نتایج مطالعات دیگری نشان داده است که عصاره اتانولی درصد ساقه و برگ خرفه با اثر بر سیستم اعصاب مرکزی و محیطی موجب افزایش اشتها، فعالیت ضد تشنجی، مهار انقباضات عصبی – عضلانی به دنبال تحریک الکتریکی فعالیت شل کنندگی عضلانی و فعالیت ضد دردی میشود که فعالیت ضد دردی عصاره به وسیله نالوکسان کاهش مییابد که احتمال دارد بر اثر ضددردی خرفه از طریق گیرنده اوپیوئیدی باشد (Radhakrishnan et al., 2001). با توجه به اینکه تحریک گیرندههای اوپیوئیدی موجود در دستگاه عصبی مرکزی سبب افزایش اشتها میگردد، لذا به نظر میرسد اثرات ضد دردی و افزاینده اشتها عصاره دانه خرفه از طریق تداخل با گیرنده های اوپیوئیدی باشد. هدف تحقیق حاضر اثر سطوح مختلف عصاره خرفه بر بیان ژنهای مذکور و رابطه آن با اشتهای جوجههای گوشتی بود.

مواد و روش ها

جامعه مورد مطالعه

تعداد 250 قطعه جوجه نر گوشتی یکروزه سویه تجاری راس 308 به 25 گروه 10 قطعهای با میانگین وزن گروهی مشابه تقسیم شدند. هر 5 گروه به طور تصادفی تحت یک تیمار قرار داشتند. . تیمارهای غذایی شامل 5 تیمار شاهد (جیره پایه بدون عصاره خرفه)، جیره پایه همراه 50،100،150 و 200 میلی گرم عصاره گیاه خرفه بودند. تیمارهای غذا شامل نسبت های مختلف گیاه خرفه، به مدت 42 روز اعمال گردید.

روش نمونه گیری

پس از کشتار جوجهها در 42 روزگی، از تکرارهای هر تیمار دو جوجه که میانگین هر تکرار بودند، انتخاب (جمعا 50 جوجه) و پس از جدا نمودن سر، ساقه مغز به کمک تیغ بیستوری جدا شد. نمونه های بافت ساقه مغز از هر دو جوجه، گرفته شد و با محلول PBS 10% شستشو و به تانک ازت مایع منتقل شد. نمونه بافتها تا زمان استخراجRNA در دمای 80 – نگهداری شدند.

استخراج RNA و سنتز cDNA

برای استخراج RNA ابتدا نمونههای هر تکرار به طور جداگانه هموژن گردید. بدین منظور مقداری از بافت مورد نظر را خرد کرده در هاون ریخته و با کمک نیتروژن مایع پودر یکنواختی از آن تهیه شد RNA با استفاده از کیت RNeasy Mini Kit (Qiagen، آلمان) طبق دستور العمل شرکت سازنده استخراج و کمیت و کیفیت آن توسط دستگاه اسپکتوفتومتر نانودراپ ND-2000 تعیین شد و عمل تیمار RNA استحراجی با DNase و ساخت cDNA با استفاده از کیت فرمنتاز لیتوانی انجام شد ساخت cDNA تک رشته ای با استفاده از 1 میکروگرم از RNA کل تیمار شده با DNase ، اغازگرهای هگزامر و آنزیم ترانس کریپتاز معکوس Revertaid H Minus M-Mulvi در حجم 20میکرولیتر طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد.

طراحی آغازگرهای اختصاصی ژنهای GAPDH,prepronociceptin ,neuropeptide Y(NPY) ابتدا ژنوتیپها و توالیهای مربوط به ژنهای GAPDH, prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY) بطور جداگانه از بانک اطلاعات ژنی (NCBI) جمع آوری شدند و با استفاده از نرمافزار primer premier-5 نسبت به طراحی آغازگرهای اختصاصی اقدام شد. سپس با استفاده از ابزار Blast از یکتا بودن محل اتصال جفت آغازگرها اطمینان حاصل شد. سنتز آغازگرها توسط شرکت Bioneer کشور کره جنوبی انجام شد. از ژن گلیسرآلدئید-تری فسفات-دهیدروژناز یا GAPDH به عنوان ژن مرجع و مقایسه شاخص بیان سایر ژنها با آن استفاده گردید (Huggett et al., 2005; Tricarico et al., 2002).

جدول 1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در واکنشهای Real-Time PCR.

Table 1- Properties of primers used in Real-Time PCR.

توضیحات

Definition

پرایمر

Primer

طول قطعه تکثیرشده

Product Len.bp

شماره دستیابی

Accession No.

نوروپتیدوای

Neuropeptide Y

F: 5`CAGGCAGAGATATGGAAAGAG 3`

R:5` CAGAGGAGTGGAGAATGAATTG 3`

176

NM_205473

پریپرونوسیسپتین

Prepronociceptin

F: 5`CGGAAGTGGAACAACCAGAAG 3`

R: 5` ATCTCGTTGTGCTCGCTGAG 3`

113

NM_001185051

گلیسرآلدئید -3- فسفات دهیدروژناز

GPDH

F: 5' GCTGCTAAGGCTGTGGGGAA 3'

R:5' ACGGCAGGTCAGGTCAACAAC 3

108

NM_204305.1

pcr کیفی

بعد از استخراج RNA از بافت کبد PCR کیفی انجام شد. واکنش PCR در حضور یک مخلوط اصلی شامل بافر X10 آغازگرهای اختصاصی با غلظت5/1 میکرومولار، dNTP وMgCl₂ و آنریم Taq طبق برنامه زیر برای سه ژن GAPDH, prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY) و شش آغازگر انجام گرفت. رژیم حرارتی واکنش PCR در مرحله واسرشته سازی یک چرخه 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه بود که در ادامه برای 40 سبکل از حرارت مرحله واسرشته سازی 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها 60 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و بسط آغازگرها در 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه استفاده گردید. مرحله بسط نهایی آغازگرها دارای یک چرخه 72 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه بود.

PCR کمی نسبی (Relative Quantitative PCR) ‏

واکنش Real time -PCR کمی بر روی نمونه ها با 3 بار تکرار با استفاده از کیت Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) شرک فرمنتاز کشور لیتوانی و با استفاده از دستگاه (ABI (Applied Biosystems 7300 آمریکا ( Malinen et al., 2003; Vandesompele et al., 2002 ) با شرایط زیرانجام گرفت. مخلوط واکنش (25 ماکرولیتر) شامل 5/12 میکرو لیتر SYBR Green Master Mix ، 6/0 میکرومول از آغازگرهای رفت و برگشت، 500 نانوگرم از cDNA الگو بود. برنامه حرارتی زیر برای هر 3 ژن GAPDH, prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY) به طور یکسان استفاده شد.

بهینه کردن واکنش Real time PCRکمی نسبی

جهت آغاز بکار دستگاه از برنامه حرارتی شبیه برنامه RT-PCR کیفی که در بالا توضیح داده شد، استفاده گردید و مقدار مواد واکنش به علت نداشتن الگوی قبلی از مقادیر استاندارد گفته شده در کیت فرمنتاز استفاده شد. اجزای واکنش استاندارد کیت بصورت زیر بهینهسازی گردید. اجزای واکنش شامل Mastermix، سایبر گرین5/12 میکرولیتر، ،آغازگر رفت.15/0 میکرولیتر، آغازگر برگشت 15/0 میکرولیتر (10پیکومول)، نمونه cDNA 2 میکرولیتر (100 نانوگرم برمیکرولیتر) و آب دوبار تقطیر شده 2/10 میکرولیتر در حجم کل 25 میکرولیتر.می باشد.

آنالیز کمی دادهها و بیان ژنها

در پایان انجام واکنش PCR، نرم افزار دستگاه به طور اتوماتیک خط آستانه را ترسیم نمود. تحلیل و تجزیه اطلاعات با استفاده از نرم افراز ABI 7300 sequence Detection system و نرم افزارBiosystems) SDS Ver. 1.4 Applied آمریکا) انجام شد. پردازش دادهها با نرم افزار Excel انجام گرفت. برای تعیین میزان بیان ژنهای NPY، PNOC و GAPDH از روش لیواک استفاده شد. در این روش فرض بر این است که بازده نمونه و کنترل داخلی برابر و 100 درصد است و از فرمول مفدار هدف استفاده شد در این روش فرض بر این است که بازده نمونه و کنترل داخلی برابر و 100 درصد است (Livak et al., 1995; Livak & Schmittgen.,2001; Gentle et al.,2001; Yuan et al., 2006 ).

جدول 2- سیکل های حرارتی واکنش PCR.

Table 2- PCR Cycles.

	سیکل ها Cycles	درجه حرارت C⁰ Target Temperature	مرحله Segment	زمان نگهداری Hold Time
قبل از تکثیر Pre-Incubation	1	95	---	10min
تکثیر Amplification	45	95	واسرشت سازی Denaturation	15 s
		60	اتصال Annealing	30 s
		72	بسط Extension	30 s
منحنی ذوب Melting Curve	1	95	واسرشت سازی Denaturation	15 s
		60	اتصال Annealing	1min
		95	بسط Extension	15 s
		60	ذوب Melting	15 s

مقدارهدف

R = 2^{- [}^rCT^{نمونه -}^rCT^کنترل]

rCT_هدف= (CT_نمونه- CT _مرجع)

rCT_کنترل = (CT_کنترل- CT _مرجع)

rrCT = rCT_هدف- rCT_کنترل

تجزیه آماری rrCT نمونههای تیمار شده و شاهد با برنامه Excle آنالیز انجام گرفت. معنیداری تفاوت بین rrCT نمونهها توسط آزمون t-استیودنت در سطح 01/0α= آزمون شد.

نتایج و بحث

تعیین کمیت و کیفیت RNA های استخراج شده

با اندازهگیری مقدار جذب نور فرابنفش در سه طول موج 260، 280 و 230 نانومتر، توسط دستگاه نانودراپ مشخص شد که کمیت و کیفیت RNA استخراج شده خلوص بالا و مطلوب داشته و عاری از آلودگیهای پروتئین، بقایای فنلی و الکلی بود (شکل 1).

بهینهسازی واکنشReal-Time PCR

- دمای مناسب اتصال پرایمر در واکنش و بهینه سازی غلظت آغازگرها

یکی از راههای کاهش میزان پرایمر دایمر بهینه نمودن اتصال و غلظت آغازگرها میباشد. لذا پس از بررسیهای صورت گرفته، بهترین دمای اتصال آغازگر 60 درجه سانتیگراد و مناسبترین غلظت آغازگر 15/0 میکرولیتر به دست آمد.

رسم منحنی ذوب

همانطور که در شکل 2 دیده میشود پیک اضافی کوچکتر از پیک محصولات که نشانگر وجود پرایمر دایمر میباشد وجود ندارد و این نشانگر این موضوع است که آغازگرها تقابلی با هم ندارند منحنی ذوب مناسب دارای ویژگیهایی نظیر کشیده و نوک تیز بودن می باشد و همچنین منحنی ذوب تکرارهای یک نمونه کاملا بر روی هم قرار میگیرند که در تصویر زیر این ویژگیها به خوبی مشاهده میشود (Wang&Brown,2001;Gibson, et al., 1996).

واکنش Real time PCRکمی نسبی

بعد از بهینهسازی دمای اتصال آغازگرها و بهینهسازی غلظت آغازگرها و سایر اجزاء واکنش نسبت به تکثیر قطعات اختصاصی ژنهای GAPDH, PNOC , NPY اقدام شد. همان طور که در شکل 3 دیده می‌شود محل تلاقی خط آستانه و منحنی های تکثیر نشان دهنده چرخه آستانه (ct) میباشد (Heid et al., 1996; Glulietti et al., 2001; Wong& Medrano, 2005)

نتایج بیان ژن PNOC

سطح بیان ژن PNOC در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر از سایر تیمارهای حاوی نسبتهای مختلف گیاه بود (P<0.01) و باعث افزایش اشتها در جوجه های گوشتی شد (شکل 4). تزریق درون بطنی مغزی Nociceptin/OrphaninFQ به عنوان لیگاند آندوژن گیرنده‌های شبه گیرنده‌های اپیوئیدی، مانند اپیوئیدهای کلاسیک، موجب افزایش اخذ غذا در جوجه‌های گوشتی میگردد (Abbasnejad, et al., 2005).

شکل 4- نتایج بیان ژن PNOC به صورت نسبی.

Figure 4- Relative gene expression of PNOC.

نتایج بیان ژنNPY

بررسی بیان ژن NPY در تیمارهای حاوی خرفه نسبت به شاهد تفاوت معنیداری نداشت و در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر بود اگرچه از نظر آماری معنیدار نبود (شکل 5). اگرچه به نظر می‏رسد که NPY یک سیگنال مهم افزایش دهندهی اشتها است، اما احتمالاً در صورت فقدان این سیستم به علت وجود مکانیسم‏های جبرانی و یا دیگر مسیرهای افزایش دهنده اشتها مانند سیگنال‏های پپتید مرتبط با آگوتی AgRP ، وزن بدن و میزان چاقی دستخوش تغییر چندانی نمی‏شود. گیرنده‏های Y₄ , Y₂ , Y₁ و Y₅ نوروپپتید Y همگی در هیپوتالاموس وجود دارند و اثرات تغذیهای NPY را وساطت می‏کنند (Wayne et al., 2005). مشخص شده AgRP آنتاگونیست اندوژن رسپتورهای ملانوکورتین-3 (MC3) و ملانوکورتین-4 (MC4) است و تزریق مرکزی AgRP دریافت غذا را به طور چشمگیری افزایش میدهد (آنتاگونیست رسپتور را مهار میکند). همچنین NPY یک عامل ارکسیژنیک (افزاینده اشتها) قوی است، اگرچه اثراتش کمتر از AgRP باقی میماند. NPY احتمالا غذا خوردن را از طریق رسپتورهای Y1 و Y5 تحریک میکند (Kelley et al., 2002 Kiris et al., 2007;).

شکل 5- نتایج بیان ژن NPY به طور نسبی.

Figure 5- Relative gene expression of NPY.

نتیجه گیری

درتحقیق حاضر بیان ژن prepronociceptin در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر بود که نشان میدهد عصاره خرفه میتواند باعث افزایش اشتها در جوجههای گوشتی شود. همچنین بیان ژن NPY در تیمارهای حاوی خرفه نسبت به شاهد تفاوت معنیداری نداشت، اگرچه در تیمار حاوی200 میلی گرم خرفه بیان ژن بیشتر بود. مطالعات زیادی در مورد اثر NPY بر اشتها انجام شده است. افزایش نوروپپتید (NPY) Y در هسته کمانی (Actuate nucleus) هیپوتالاموس سبب پرخوری حیوان میشود. یک منبع مهمNPY در مغز هسته کمانی میباشد. به نظر میرسد که این نوروترانمسمیتر اثرات افزاینده اشتهای خود را با اثر بر ناحیه هسته کمانی در هیپوتلاموس اعمال نموده است. بنابراین عصاره خرفه را می توان موثر بر بیان ژن های نوروپپتید های افزاینده اشتها و در نتیجه افزایش دریافت خوراک دانست.

منابع

Abbasnejad M, Jonaidi H, Denbow DM, Pour Rahimi AM (2005). Feeding and locomotion responses to centerally injected nociceptin/ orphan FQ In chicks. Physiology Behavior 85:383-386.

Barber RD, Harmer DW, Coleman RA, Clark BJ (2005). GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiol. Genomics. 21(3):389-95.

Bungo T, Shiraishi J, Kawakami S (2011). Hypothalamic Melanocortin System and Feeding Regulation in birds:A Review.Journal of Poultry Science 48:1-13.

Gentle AF, Anastasopoulos Mc, Brien NA (2001). High resolution semi quantitative real time PCR without the use of a standard curve. BioTechniques 31: 502-508.

Gibson U, Heid ECA, Williams PM (1996). A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Reserarch 6: 995-1001.

Giulietti, A, Overbergh D, Valckx, Decallonne B, R. Bouillon, Mathieu C (2001). An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods 25: 386-401.

Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996). Real time quantitative PCR. Genome Research 6: 986-994.

Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. (2005). Real-time RT-PCR normalization; strategies and considerations. Genes and Immunity 6: 279–284.

Kelley A, Swanson CJ, Stratford TR (2002). Leptin Differentially Regulates NPY and POMC Neurons Projecting to the Lateral Hypothalamic Area. Behavior Brain Research. 93: 43-50.

Kiris GA , Kumlu M, Dikel S (2007). Timulatory effects of neuropeptide Y on food intake and growth of Oreochromis niloticus. Aquaculture 264 383–389.

Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J, Giusti W (1995). Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Applications journal 4: 357-362.

Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 25: 402-408.

Malinen E, Kassinen A, Rinttila T, Palva A (2003). Comparison of real time PCR with SYBR green I and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology 149: 269-277.

Mollereau C, Simons MJ, Soularue P, Liners F, Vassart G, Meunier JC, Parmentier M (1996). Structure, tissue distribution, and chromosomal localization of the prepronociceptin gene. Proc Natl Acad Sci USA 93:8666 –70.

Pawel K. Olszewski (2010). Central nociceptin/orphanin FQ system elevates food consumption by both increasing energy intake and reducing aversive responsiveness. Amrican Journal Physiology Regulation Integrated Comparative Physiology 299: R655–R663

Tricarico C, Pinzani P, Bianchi S, Paglierani M, Distante V, Pazzagli M, Bustin SA, Orlando C (2002). Quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Analytical Biochemistry 309: 293-300.

Radhakrishnan MN, Zakaria MW, Islam H.B Chen , Kamil M , Chan K , Al-Attas A (2001). Neuropharmacological actions of Portulaca oleraceae L v. sativa (Hawk). Journal of Ethnopharmacology. Volume 76, Issue 2, July 2001, Pages 171–176

Vandesompele J, De Paepe A, Speleman F (2002). Elimination of primerdimer artifacts and genomic coamplification using a two-step SYBR green I real-time RT-PCR. Analytical Biochemistry 303: 95-98.

Wang T, Brown MJ (1999). mRNA quantification by real-time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection. Analytical Biochem, 269: 198-201.

Wynne K, Stanley S, McGowan B, Bloom S (2005). Appetite control. Journal of Endocrinology 184:291–318.

Wong ML, Medrano JF (2005). Real-Time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques, 39: 63-68.

Yuan JS, Reed A, Chen F, Stewart CN (2006). Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioin.

Comparison the mRNA Expression Levels of PNOC and NPY Genes in Broilers fed Purslane Seed Extract

Vakili R.*¹ Zakizadeh S.²

¹Assistant Professor,Department of Animal Science, Islamic Azad University, Kashmar Branch

²Assistant Professor,Department of Animal Science, Higher Education Center of Jihad and Agriculture, Mashhad, Iran

Abstract

This experiment was conducted to investigate the PNOC and NPY mRNA expression levels in broiler chicks fed with purslane seed extracts. Two-hundred-fifty day-old broiler chicks were used and randomly allotted equally into five experimental groups with five replications comprised 10 chicks in each replication.The effect of various levels of purslane seed extract investigated on mRNA expression levels of PNOC and NPY genes during a 42-day period, Dietary treatments included a control basal diet (without adding purslane seed), basal diet + 50, 100,150 and 200 mg/kg purslane seed. Livak method was used to determine mRNA expression levels of PNOC and NPY genes. At 42 days of age two bird of each replicate were randomly selected, slaughtered and their brain stem tissue were used to assess the effect of treatments on PNOC and NPY mRNA expression levels. The mRNA expression of NPY in treatments containing purslane seed extract was not significant in compare with control treatment, although it was higher in treatment containing 200 mg/kg purslane seed. The mRNA expression of PNOC in treatment containing 200 mg/kg purslane seed extract was significantly higher than the control treatment (p>0.01); meanwhile the other treatments had no effect in compare with control. The results showed that use of 200 mg/kg levels portulaca oleracea extract led to the significant increase of PNOC mRNA expression and non significant increase of NPY mRNA expression. Therefore, portulaca oleracea extract could be effective on the mRNA level expression of accelerated neuropeptides of appetite in broiler chicks.

Keywords: Purslane seed extract, Prepronociceptin (PNOC), Neuropeptide Y (NPY), broiler, gene expression

* نویسنده مسئول: رضا وکیلی تلفن: 09153168510 rezavakili2010@yahoo.com Email:

[1] - Intracerebroventricular

* Corresponding Author: Reza Vakili Tel: 09153168510 Email: rezavakili2010@yahoo.com

مراجع