مطالعه اثر ژن Rf3 برای بازگردانندگی باروری به برنج در زمینه ژنتیکی لاین ندا-A

علی صادقی¹، اسدالله احمدی‌خواه*²، محمد فارسی³

¹دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

²عضو هیئت علمی دانشگاه شهید بهشتی تهران، دانشکده مهندسی انرژی و فناوری­های نوین، گروه بیوتکنولوژی

³عضو هیئت علمی دانشگاه فردوسی مشهد, دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 20/08/1391، تاریخ پذیرش: 2/05/1392

چکیده

در برنامه تولید بذر هیبرید در سیستم سه لاینی، استفاده از لاین با قابلیت ترکیب‌پذیری خصوصی مطلوب حامل ژن‌های بازگرداننده باروری (Rf) ضرورت دارد. در این تحقیق، جایگاه ژنی بازگرداننده باروری Rf3 واقع بر روی کروموزوم شماره یک برنج با روش تلاقی برگشتی به کمک نشانگر، به پس‌زمینه ژنتیکی لاین نرعقیم ندا-A انتقال داده شد و همزمان اثر آن در هر نسل بر باروری دانه گرده و خوشه لاین گیرنده، مورد بررسی قرار گرفت. جهت انتقال، یک گیاه از جمعیت نسل F₂ (حاصل از تلاقی میان ندا-A و IR36) بر اساس نشانگرهای پیوسته به جایگاه ژنی Rf3 (RM1، RM3873 و RM3233) انتخاب و با لاین ندا-A (به عنوان والد تکراری) تلاقی برگشتی داده شد. نتاج نسل اول تلاقی برگشتی (BC₁) از نظر وجود نشانگرهای پیوسته به ژن و همچنین از نظر فنوتیپی و به دنبال آن برای 15 نشانگر ریز ماهواره پس‌زمینه، مورد بررسی قرار گرفتند. تنها دو بوته نسل BC₁ که در هر سه جایگاه نشانگری دارای آلل غالب از والد بخشنده بودند باروری بالای خوشه (55% و 65%) را نشان دادند. نتاج نسل دوم تلاقی برگشتی (BC₂) از تلاقی دو بوته فوق با والد تکراری حاصل شد. در بین نتاج BC₂ یک گیاه با باروری بالاتر خودگشن شده و 170 بوته از نسل BC₂F₂ از نظر 3 نشانگر RM1، RM3873 و RM3233 و همچنین دانه­بندی خوشه مورد بررسی قرار گرفتند. هفت بوته با میزان بالاتری از ژنوم والد تکراری (از 1/91 % تا 5/98%) و در وضعیت هموزیگوتی کامل از نظر سه نشانگر پیوسته به Rf3 (RM1، RM3873 و RM3233) شناسایی شدند که دارای باروری بالای دانه گرده و همچنین خوشه (75%تا 97%) بودند که نشان می‌دهد هر چه هموزیگوسیتی جایگاه ژنی Rf3 بیشتر شد، بازگرداندن باروری به نرعقیمی نوع وحشی (WA) در پس‌زمینه ژنتیکی لاین گیرنده نرعقیم، بیشتر تقویت گردید. بنابراین، می­توان نتیجه­گیری نمود که جایگاه ژنی Rf3 تاثیر متقابلی با نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع WA در جهت افزایش باروری دانه گرده و خوشه برنج دارد و از اینرو، می‌تواند همراه با سایر ژن‌های بازگرداننده باروری در برنامه تولید بذر هیبرید برنج به کار گرفته شود.

واژه های کلیدی: بازگرداننده باروری- نرعقیمی WA- نشانگر مولکولی- هیبرید-  Rf3.

مقدمه

در میان روش‌های متفاوت برای بهبود راندمان عملکرد در برنج، استفاده از سیستم تولید بذرهای هیبرید به خاطر سادگی و نیاز به زحمت کم، مورد توجه قرار گرفته است. چندین لاین نرعقیم سیتوپلاسمی (CMS[1]) به طور گسترده برای تولید برنج هیبرید اصلاح شده است و صدها واریته هیبرید سه لاینی تولید و برای کشت آزاد شده‌اند (Virmani et al., 2003). در این سیستم، عامل نرعقیمی سیتوپلاسمی S در DNA میتوکندریایی (در خارج از هسته) مشخص شده است. لاین A به عنوان لاین نرعقیم حامل عامل S در سیتوپلاسم و آلل rf به صورت مغلوب در هسته می­باشد. لاین B که به عنوان لاین نگهدارنده[2] شناخته می‌شود مشابه لاین A می‌باشد، اما به جای سیتوپلاسم نرعقیم دارای سیتوپلاسم بارور (N) است و قابلیت خودگشنی دارد (Virmani et al., 2003). وقتی لاین B با لاین A تلاقی می‌یابد، نتاج حاصله همگی نرعقیم (A لاین) خواهند بود. اما لاین دیگری که در برنامه تولید بذر هیبرید مورد استفاده واقع می‌شود، لاین R یا لاین بازگرداننده باروری برای لاین A است که دارای ژن‌های بازگرداننده باروری به صورت غالب (RfRf) می‌باشد. زمانی که لاین R با لاین A تلاقی می‌یابد، بذرهای F₁ حاصل بارور می­باشند. ژن‌های بازگرداننده باروری به صورت هموزیگوس (RfRf) یا به صورت هتروزیگوس (Rfrf) صرف نظر از عقیم بودن یا طبیعی بودن سیتوپلاسم، باعث باروری هیبریدهای F₁ می‌شوند (Schnable & Wise, 1998). نرعقیمی سیتوپلاسمی (CMS)، صفتی با وراثت مادری است که گیاه نرعقیم قادر به تولید گرده فعال نیست و در میان گیاهان عالی شایع است. سیستم‌های نرعقیمی سیتوپلاسمی موجود ابزاری با ارزش در تولید بذر هیبرید در گونه‌های زراعی خودگرده‌افشان، مثل برنج، کتان و بعضی از سبزیجات زراعی می‌باشند. هیبریدها دارای هتروزیس هستند که بعنوان قدرت هیبرید شناخته شده است و نتاج هیبرید هتروتیک، خصوصیات رشدی بهتری نسبت به والدین خود نشان می‌دهند. سیستم‌های نرعقیمی سیتوپلاسمی می‌توانند عامل قابل توجهی در تولید کارآمد بذر هیبرید باشند (Eckardt, 2006). در برنج تقریباً 20 منبع نرعقیمی سیتوپلاسمی شناسایی شده است. البته در بین سیستم‌های نرعقیمی سیتوپلاسمی مختلف، فراوانی سیستم نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع وحشی (WA[3]) بیشتر از همه می‌باشد و تقریباً برای تولید 90 درصد بذور هیبرید به کار می‌رود. این سیستم پایدار بوده و لاین‌های بازگرداننده باروری برای آن به اندازه کافی وجود دارد (Yao et al., 1997). ژن‌های Rf مختلفی برای بازگرداندن‌ باروری در سیستم‌های مختلف نرعقیمی سیتوپلاسمی شناسایی و نقشه‌یابی شده‌اند (Komori et al., 2003). دو ژن Rf3 و Rf4 به وسیله‌ی تکنیک‌های RFLP/RAPD به ترتیب بر روی کروموزوم‌های شماره 1 و 10 مکان‌یابی شده‌اند (Yao et al., 1997). ژن Rf4 بین دونشانگر ریز ماهواره، RM171 و RM228 به ترتیب با فواصل 7/3 و 4/3 سانتی‌مورگان نقشه‌یابی گردید (Jing et al., 2001). Ahmadikhah & Karlov (2006) ژن Rf4 را بر روی بازوی بلند کروموزوم 10 بین دو نشانگر RM171 و RM206 مکان‌یابی کردند. Alavi et al. (2009) نشانگر RM1 در فاصله 5/6 سانتی‌مورگان، نشانگر RG140 در فاصله 5/12 سانتی‌مورگان، نشانگر RM3873 در فاصله 8/15 سانتی‌مورگان و نشانگر RM3233 را در فاصله 17 سانتی‌مورگان از جایگاه ژنی Rf3 بر روی کروموزوم 1 برنج مکان‌یابی کردند. همچنین Nematzadeh & Kiani (2010) نشانگرهای RM171 و RM258 را برای Rf4 و نشانگر RM3148 را برای Rf3 در ارقام ایرانی نقشه‌یابی کردند. مشخص شده که علاوه بر این دو ژن (Rf3 و Rf4) برای سیستم نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع وحشی، ژن‌های دیگری نیز در کنترل برگرداندن باروری نرعقیمی سیتوپلاسمی نقش دارند. از جمله می‌توان به ژن RfWA2 بر روی بازوی بلند کروموزوم شماره 7 و ژن Rf5(t) بر روی بازوی کوتاه کروموزوم 10 ( Liu et al., 2001؛Ahmadikhah et al., 2007) اشاره نمود.

یکی از روش‌های انتقال قطعات کوچک ژنومی از لاین بخشنده به لاین گیرنده (والد تکراری یا دوره‌ای)، روش تلاقی برگشتی مکرر می‌باشد و هدف از تکرار تلاقی برگشتی افزایش سهم ژنومی والد گیرنده در نتاج نهایی انتخاب شده می‌باشد. انتظار می‌رود مقدار بازیابی ریخته ارثی والد تکراری برای نسل اول تلاقی برگشتی، معادل 75 درصد و پس از 6 نسل تلاقی برگشتی، حدود 2/99 درصد باشد. اما در واقع، هر یک از نتاج تلاقی برگشتی، از این نسبت نظری انحراف دارند که دلیل آن شانس (تصادفی بودن موقعیت کیاسما) و یا وجود پیوستگی میان ژن مورد نظر در والد بخشنده و ژن‌های نزدیک به آن می‌باشد. بنابراین اگر بتوان افرادی را که دارای مقدار بیشتری از ژنوم والد تکراری می‌باشند شناسایی نمود و با آن تلاقی برگشتی داد، با تعداد کمی تلاقی برگشتی می‌توان ژنوم والد تکراری را با کارایی بالا بازیابی نمود. برای نیل به این هدف روش تلاقی برگشتی به کمک نشانگر[4] پیشنهاد شده است (Semagan et al., 2006) که در آن علاوه بر ردیابی ژن هدف با نشانگرهای پیوسته (گزینش پیش‌زمینه[5])، از نشانگرهای توزیع یافته بر روی سایر کروموزوم‌ها نیز برای شناسایی افراد حامل درصد بالاتری از ژنوم والد گیرنده استفاده می‌شود (گزینش پس‌زمینه[6]) و بدین وسیله بازیابی سریع والد تکراری با تعداد کمی تلاقی برگشتی میسر می‌گردد (Ahmadikhah, 2010).

استفاده از یک ژن نقشه‌یابی شده و یا جدا شده در برنامه‌های اصلاحی، خصوصاً در برنامه تلاقی برگشتی مستلزم شناخت اثر متقابل آن ژن با زمینه ژنتیکی ارقام گیرنده بوده و بررسی تغییرات بیان آن در زمینه ژنتیکی جدید اهمیت بالایی دارد. بدین منظور، در این تحقیق جایگاه ژنی Rf3 واقع بر روی کروموزوم شماره یک به وسیله روش تلاقی برگشتی به کمک نشانگرها به رقم برنج نرعقیم ندا-A حامل نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع WA انتقال داده شد و اثر متقابل آن با CMS از حیث تأثیر بر باروری دانه گرده و خوشه نتاج حاصل مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‌ها

این تحقیق طی سال‌های 1386 تا 1390 در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شد.‌ لاین نرعقیم سیتوپلاسمی ندا-A در سال 1386با لاین بازگرداننده باروری IR36 (Ahmadikhah et al., 2002) تلاقی داده شد و در سال بعد از خودباروری هیبرید F₁ جمعیت F₂ ایجاد گردید. لازم به ذکر است که جمعیت F₂ مورد اشاره تفرق دو ژنی با نسبت 15:1 برای دو ژن مضاعف غالب را نشان داده بود و لاین IR36 دارای دو ژن برای برگرداندن باروری به لاین‌های نرعقیم سیتوپلاسمی تشخیص داده شد (Alavi et al., 2009). در سال 1388 یک بوته با باروری بالا از جمعیت F₂ انتخاب و با لاین ندا-A (به عنوان والد تکراری) تلاقی برگشتی داده شد تا جمعیت نسل اول تلاقی برگشتی (BC₁) ایجاد گردد. بذور نسل اول تلاقی برگشتی خزانه‌گیری و سپس به زمین اصلی انتقال داده شدند که در نهایت 27 بوته در مزرعه مستقر گردید. بر اساس گزینش پیش‌زمینه با نشانگرهای پیوسته به لوکوس باروری Rf3 (که شرح آن در بخش‌های بعدی خواهد آمد) و نیز بر اساس گزینش پس‌زمینه با نشانگرهای SSR توزیع یافته در نواحی غیر هدف در ژنوم برنج، دو بوته انتخاب شد و با والد تکراری تلاقی برگشتی داده شد تا بذرهای نسل دوم تلاقی برگشتی (BC₂) حاصل شود. این بذرها در شهریور 1389 خزانه‌گیری و برای خودباروری در شرایط آب و هوایی اهواز کاشته شدند. بر اساس گزینش فنوتیپی برای میزان باروری، یک بوته انتخاب و بذرهای آن جهت تشکیل نسل BC₂F₂ برداشت گردید. در بهار 1390 بذرهای این نسل کشت گردید که در نهایت منجر به استقرار 170 بوته در مزرعه شد.

استخراج DNA از برگ‌های جوان هر نمونه به روش CTAB طبق دستورالعمل (Ahmadikhah, 2009) انجام شد.  نشانگر RM1 در فاصله 6/5، نشانگر RM3873 در فاصله 14 و نشانگر RM3233 در فاصله 17 سانتی مورگان از لوکوس Rf3 که توسط Alavi et al. (2009) مورد مکان‌یابی قرار گرفته است به عنوان نشانگرهای مورد استفاده در گزینش پیش‌زمینه انتخاب شدند (جدول 1).

جدول 1- آغازگرهای SSR استفاده شده برای گزینش جایگاه ژنی هدف (Rf3) و موقعیت آنها در ژنوم برنج.

Table 1- SSR primers used in selection of target locus (Rf3) and their locations in rice genome.

برای آزمون باروری دانه گرده، 6-5 بساک از هر خوشه انتخاب شد و در استوکارمن یا یدید پتاسیم یک درصد له شد و میزان رنگ‌پذیری دانه‌های گرده در زیر میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی قرار گرفت. درصد باروری خوشه با تقسیم تعداد دانه‌های پر به تعداد کل دانه در خوشه محاسبه ‌شد. گیاهان با باروری بالای 70% بعنوان کاملاً بارور و گیاهان با باروری بین 50 تا 70 درصد بعنوان بارور نسبی در نظر گرفته شدند.

در گزینش پس‌زمینه برای بررسی منشأ والدینی آلل‌ها از نشانگرهای مولکولی توزیع یافته در سرتاسر ژنوم طبق روش Hospital (2002) استفاده شد. برای این منظور، 96 جفت آغازگر SSR برای آشکارسازی چندشکلی میان دو لاین والدینی استفاده گردید. بر اساس الگوی بانددهی، در هر نسل ژنوتیپ والد بخشنده به صورت BB، ژنوتیپ والد دوره‌ای به صورت AA و افراد هتروزیگوت به صورت AB امتیازدهی شدند. میزان شباهت افراد نسل‌های BC به والد تکراری با فرمول  (Hospital et al., 1992) محاسبه گردید که در آن N_t تعداد کل مکان‌های SSR مورد بررسی، N_AB تعداد مکان‌های هتروزیگوت و N_AA تعداد مکان‌های هموزیگوت از نظر آلل‌های والد تکراری می‌باشد.

نتایج

برای آشکارسازی چندشکلی بین والدین، از 96 جفت آغازگر ریز ماهواره توزیع یافته در سراسر ژنوم استفاده شد که تنها 15 نشانگر (6/15 درصد) توانستند چندشکلی بین والدین را آشکار نمایند (جدول 2). تعداد 27 گیاه نسل BC₁ در شرایط آب و هوایی گرگان، مورد ارزیابی دانه گرده قرار گرفتند که در کل 7 بوته دارای باروری متوسط به بالا ( بالای50%) شناسایی شدند (جدول 3). این گیاهان با نشانگرهای RM1، RM3873 و RM3233 که با ژن Rf3 پیوستگی دارند مورد آزمون قرار گرفتند که همه آنها حداقل در یک جایگاه SSR دارای آللی از والد بخشنده بودند (BB یا AB). آنالیز بیشتر نشان داد که رابطه‌ای قوی (ضریب تبیین=689/0) بین تعداد آلل‌های نشانگرهای پیوسته با جایگاه ژنی باروری Rf3 و میزان دانه‌بندی نتاج BC₁ وجود داشت (شکل 1).

جدول 2-‌ آغازگرهای SSR دارای چندشکلی بین والدین و موقعیت آنها در ژنوم برنج.

Table 2- SSR primers showing polymorphism between parents and their locations in rice genome.

جدول3- خصوصیات پیش زمینه و پس زمینه گیاهان انتخاب شده در نسل BC_1.

Table 3- Characters of foreground and background of selected plants in BC₁ generation.

شکل 1- رابطه بین تعداد آلل نشانگرهای پیوسته با جایگاه ژنی Rf3 و میزان باروی خوشه (دانه‌بندی) در نتاج نسل BC_1.

Figure 1- Relationship between allele numbers of the markers linked with Rf3 locus and rate of panicle fertility (seed setting) in BC₁ progenies.

بوته‌های شماره BC₁-1 و BC₁-16 که هر سه لوکوس فوق را در وضعیت هتروزیگوت حمل می‌نمودند و درصد باروری مناسبی نیز داشتند، انتخاب و با والد تکراری تلاقی برگشتی داده شدند تا نسل BC₂ ایجاد گردد.

جهت افزایش سهم ژنوم والد تکراری و بازیابی بیشتر ژنوم این والد، در شهریور 1389 اقدام به گزینش پیش‌زمینه روی نشاهای نسل BC₂ با استفاده از 3 نشانگر پیوسته با جایگاه ژنی Rf3 گردید. نتیجه این آزمون مشخص نمود که تنها دو نشاء حامل هر سه نشانگر جایگاه باروری در حالت هتروزیگوت (AB) بودند. از طرفی آزمون پس‌زمینه با 13 نشانگر SSR، مشخص نمود که بوته 1# دارای میزان بالاتری از ژنوم والد تکراری ندا-A بود (4/95 درصد در مقابل 8/94 درصد برای بوته 2#). دانه‌بندی برای بوته 1# حدود 70% و برای بوته 2# حدود 50% بود. بنابراین، بذور خودگشنی بوته شماره 1# برداشت و در سال بعد کشت گردید.

تعداد 170 بوته نسل BC₂F₂ از خودگشنی بوته 1# در مزرعه مستقر گردید. از این جمعیت، 78 بوته دارای ساقه سبز و 92 بوته دارای ساقه ارغوانی بودند که یک صفت فنوتیپی اختصاصی برای رقم ندا به عنوان والد تکراری است. بوته‌های ساقه سبز حذف شدند و بررسی برای بلوک ژنی بازگرداننده باروریRf3 بر روی 92 بوته ساقه ارغوانی انجام شد.‌

تعداد 92 گیاه نسل BC₂F₂ در تیر تا مرداد 1390 به وسیله نشانگرهای پیوسته با ژن Rf3 (شامل RM1، RM3873‌ و RM3233)، مورد آزمون قرار گرفتند. از بین گیاهان فوق تنها هفت بوته در این سه جایگاه نشانگری برای آلل‌های والد بخشنده هموزیگوت (BB) بودند. ارزیابی درصد دانه‌های بارور در بوته‌های نسل BC₂F₂ نشان داد که باروری خوشه در تمامی هفت بوته فوق بالای 75 درصد (75%-97%) بوده است. تجزیه رگرسیون بر روی بوته‌های نسل BC₂F₂ نشان داد که میان تعداد آلل‌های والد بخشنده در جایگاه نشانگرهای پیوسته به Rf3 و درصد دانه‌های پر در خوشه رابطه معنی‌داری وجود داشت (ضریب تبین=591/0؛ شکل 2).

بحث

در این تحقیق برای جایگزین کردن بخش کوچکی از کروموزوم شماره یک برنج (حامل مکان بازگرداننده باروری Rf3) در لاین نرعقیم ندا-A از روش تلاقی برگشتی به کمک نشانگرها (MAB) استفاده شد که در آن برای انتقال مکان هدف سه نشانگر پیوسته با این جایگاه ژنی (گزینش پیش‌زمینه) و برای بازیابی سریع ژنوم والد تکراری، 15 نشانگر ریز ماهواره غیر پیوسته با مکان هدف (گزینش پس‌زمینه) به کار رفتند و در هر نسل اثر متقابل میان مکان انتقال یافته با سیتوپلاسم نرعقیم لاین گیرنده (ندا-A) از حیث باروری دانه گرده و خوشه مورد بررسی قرار گرفت. Benchimol et al. (2005) نشان دادند که نشانگرهای ریزماهواره می‌توانند به طور موثری برای اینتروگروسیون یک آلل خاص یا یک خصوصیت مونوژنیک استفاده شوند و در همین راستا محققین مختلف با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره کارایی انتقال خصوصیات مختلف را با این نشانگرها به اثبات رسانده‌اند که نمونه آن تحقیقات Neeraja et al. (2007) برای انتقال QTLهای مقاومت به غرقابی و Steele et al. (2006) برای انتقال QTLهای خصوصیات ریشه در برنج می‌باشد. همچنین در سال‌های اخیر از روش MAB در موارد زیادی برای جایگزین کردن بخش کوچکی از یک قطعه کروموزومی حامل لوکوس هدف در زمینه ژنومی لاین گیرنده استفاده شده است (Lang et al., 2011; Cuc et al., 2012؛ Suh et al., 2011؛ Huyen et al., 2012).

شکل 2- رابطه میان تعداد آلل والد بخشنده در جایگاه‌های نشانگری پیوسته به Rf3 و درصد دانه‌های پر در خوشه در نتاج BC₂F_2.

Figure 2- Relationship between allele number of the markers linked with Rf3 locus and rate of panicle fertility (seed setting) in BC₂F₂ progenies.

بررسی چند شکلی بین والدین نشان داد که از 96 نشانگر ریز ماهواره تنها 6/15 درصد از نشانگرها توانستند چندشکلی بین والدین را آشکار نمایند (جدول 2) که این نتیجه نشان دهنده‌ این است که والدین از خزانه‌ی ژنتیکی بسیار مشابهی (نزدیک به هم) منشاء گرفته‌اند و این باعث می‌شود تا بازیابی ژنوم والد تکراری در زمان کمتری و با تعداد کمتری تلاقی برگشتی حاصل شود (Prigge et al., 2008). همانطور که مشاهده شد سهم ژنوم والد تکراری در تک بوته انتخاب شده نسل BC₁ 7/92% بود و برای تک بوته انتخابی در نسل BC₂ به 4/95% رسید. یکی از دلایل افزایش در دانه‌بندی خوشه (از 65 درصد در نسل BC₁ به 70 درصد در نسل BC₂ و تا 97 درصد در برخی بوته‌های نسل BC₂F₂) احتمالاً می‌تواند ناشی از انتقال ژن‌های کوچک اثری باشد که به رغم افزایش سهم ژنوم والد تکراری به وسیله گزینش پس‌زمینه حذف نشده‌اند و هنوز در برخی نتاج پیشرفته تلاقی برگشتی باقی مانده‌اند، زیرا به نظر Podolsky (1992) بیان ‌ژن‌های Rf در شرایط مختلف وابسته به ژنوتیپ لاین بازگرداننده باروری و همچنین ژنوتیپ لاین‌های CMS می‌باشد و ژن‌های کوچک اثر نیز در این رابطه نقش ایفاء می‌کنند (Podolsky, 1992).

نتایج نشان داد که رابطه‌ای قوی (ضریب تبیین=689/0) بین تعداد آلل‌های نشانگرهای پیوسته با جایگاه ژنی باروری Rf3 و میزان دانه‌بندی نتاج BC₁ وجود داشت (شکل 1). از آنجا که اثر افزایشی در جایگاه ژنی Rf3 عامل عمده ژنتیکی تعیین کننده میزان باروری می‌باشد (Ahmadikhah et al., 2007; Alavi et al., 2009)، بنابراین می‌توان نتیجه‌گیری نمود که این بلوک ژنی بسته به اینکه در چه تعداد جایگاه نشانگری دارای آلل والد بخشنده باشد، توانسته باعث ایجاد باروری در نتاج BC₁ شود. اما، همانگونه که نتایج تجزیه رگرسیون نشان داد تعداد آلل‌های موجود در جایگاه ژن هدف، با میزان باروری خوشه در نسل BC₁ نسبت به نسل BC₂F₂ رابطه قوی‌تری داشته است (به ترتیب با ضریب تبین 9/68 و 1/59 درصد). دلیل این امر می‌تواند حذف تعداد بیشتری از ژن‌های کوچک اثر والد بخشنده در نسل BC₂F₂ نسبت به نسل BC₁ باشد، زیرا هر چه میزان بازیابی ژنوم والد تکراری افزایش پیدا می‌کند از سهم ژنوم والد بخشنده حامل ژن‌های کوچک اثر در خارج از ناحیه لوکوس هدف در نتاج BC₂F₂ بیشتر کاسته می‌شود (Semgan et al., 2006; Hospital, 2009). بنابراین چنانچه هدف بیان بالای صفت مورد نظر باشد، باید توجه نمود که عمل گزینش برای مکان هدف و در عین حال بازیابی ژنوم والد تکراری با دقت فراوان انجام شود تا ضمن انتقال ژن هدف و بازیابی حداکثر درصد ژنوم والد تکراری، افرادی با بالاترین میزان بیان صفت مورد نظر نیز انتخاب شوند. لذا نباید تنها بر نتایج نشانگرهای پیوسته به ژن هدف و نشانگرهای به کار رفته برای بازیابی ژنوم والد تکراری تمرکز کرد، بلکه انجام ارزیابی‌های فنوتیپی که معیاری از بیان ژن‌های مورد انتقال در زمینه ژنتیکی لاین گیرنده می‌باشد، ضروری است. همچنین برای ردیابی ژن هدف در نتاج تلاقی برگشتی بهتر است از چند نشانگر پیوسته با آن و در صورت امکان احاطه کننده ژن هدف، استفاده نمود. برای مثال، Huyen et al. (2012) از سه نشانگر پیوسته و احاطه کننده ژن Saltol برای ردیابی نتاج متحمل به شوری استفاده کردند و ضمن انتقال دقیق قطعه کروموزومی تحمل به شوری با انجام گزینش پس‌زمینه و متعاقباً ارزیابی‌های فنوتیپی توانستند تحمل به شوری رقم مورد نظر را بهبود دهند. البته، Tada (2007) تنها از یک نشانگر پیوسته به جایگاه Rf3 برای بررسی تاثیر این جایگاه بر باروری خوشه برنج استفاده کرد و بر این اساس نتیجه‌گیری کرد که جایگاه ژنی Rf3 به تنهایی نمی‌تواند باروری خوشه را در نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع WA ایجاد کند، ولی با توجه به اینکه در تحقیقات قبلی (Alavi et al., 2009; Ahmadikhah et al., 2007) مشخص شده بود که بلوک ژنومی بزرگتری از RM322 تا RM3873 بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره یک با اثر افزایشی در برگرداندن باروری به لاین نرعقیم سیتوپلاسمی نقش ایفاء می‌کند، در تحقیق حاضر به کمک سه نشانگر پیوسته به این جایگاه ژنی قطعه بزرگتری از کروموزوم شماره یک حامل Rf3، به لاین نرعقیم سیتوپلاسمی ندا-A انتقال داده شد و به همین سبب باروری به طور موثرتری به لاین نرعقیم ندا-A برگردانده شد و این جایگاه ژنی توانست باروری خوشه را تا بیش از 75 درصد به لاین‌های CMS نهایی برگرداند. طبق برخی گزارشات دو ژن Rf3 و Rf4 به صورت اپیستازی مضاعف غالب (با نسبت تفکیک فنوتیپی 15:1) باعث برگرداندن باروری به نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع WA می‌شوند (Yao et al., 1997; Nematzadeh and Kiani, 2010; Ahmadikhah et al., 2007)، ولی اثر Rf3 در برگرداندن باروری پایین‌تر از Rf4 ذکر شده است (Yao et al., 1997). بنابراین هر چند جایگاه ژنی Rf3 دارای اثر متقابل نسبتاً بالایی با CMS در جهت افزایش باروری هیبریدهای حاصل می‌باشد، اما برای اطمینان و افزایش احتمال باروری بذرهای هیبرید می‌توان از سایر ژن‌های شناخته شده دیگر مانند Rf4 در کنار آن در برنامه تولید بذر هیبرید برنج استفاده نمود.