شناسایی نشانگرهای AFLP مرتبط با صفات تحمل به تنش غرقابی در جو

حیدری, راویه; صبوری, عاطفه; صبوری, حسین; فلاحی, حسین علی; دادرس, احمدرضا

doi:10.22103/jab.2014.1311

تعداد نشریات	26
تعداد شماره‌ها	447
تعداد مقالات	4,557
تعداد مشاهده مقاله	5,379,997
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	3,580,061

شناسایی نشانگرهای AFLP مرتبط با صفات تحمل به تنش غرقابی در جو

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 4، دوره 6، شماره 2، شهریور 1393، صفحه 41-60 اصل مقاله (863.98 K)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2014.1311

نویسندگان

راویه حیدری؛ عاطفه صبوری؛ حسین صبوری؛ حسین علی فلاحی؛ احمدرضا دادرس

چکیده

با توجه به اهمیت پژوهشهای مرتبط با تنشهای غیرزیستی، پژوهش حاضر در راستای شناسایی نشانگرهای مولکولی که ارتباط معنیداری با صفات مرتبط با تحمل به تنش غرقابی در جو دارند، انجام گرفت. این بررسی با استفاده از نشانگرهای AFLP و 40 ژنوتیپ جو صورت پذیرفت. به طور کلی 22 متغیر شامل هشت صفت در هر دو شرایط نرمال و تنش غرقابی از جمله وزن خشک اندام هوایی، طول، حجم، وزن تر، وزن خشک، سطح، قطر و چگالی سطح ریشه به همراه شش شاخص تحمل به تنش (SSI، STI، GMP، TOL، YI و YSI) ارزیابی شد. هفت ترکیب آغازگری EcoRI و MseI در کل تعداد 245 نوار تولید نمودند که از این تعداد، 227 نوار چندشکل بودند و به طور متوسط 37/92 درصد چندشکلی داشتند. سه ترکیب E90-M160، E100-M160 و E90-M150 نسبت به سایر ترکیبات مقادیر بالاتری از شاخصهای تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص دادند و در تمایز ژنوتیپها مؤثرتر بودند. تجزیه ارتباط با استفاده از ماتریس ساختار جمعیت و با مدلهای آماری GLM و MLM ، با استفاده از نرمافزار TASSEL برای 22 متغیر انجام شد. مدل MLM در سطح احتمال پنج درصد، 87 نشانگر را مرتبط با صفات ارزیابی شده شناسایی نمود. مطابق نتایج تجزیه ارتباط در شرایط نرمال بالاترین ضریب تبیین به نشانگر E100-M160-27 با توجیه 32 درصد از تغییرات قطر ریشه و برای شاخصهای تحمل و تحت تنش غرقابی به ترتیب به نشانگر E80-M150-1 با 24 درصد توجیه تغییرات شاخص GMP و نشانگر E100-M150-22 با تبیین 24 درصد از تغییرات فنوتیپی وزن خشک اندام هوایی اختصاص داشت.

کلیدواژه‌ها

تجزیه ارتباط؛ ساختار جمعیت؛ تنش غرقابی؛ نشانگرهای AFLP

اصل مقاله

شناسایی نشانگرهای AFLP مرتبط با صفات تحمل به تنش غرقابی در جو

راویه حیدری¹، عاطفه صبوری*¹، حسین صبوری²، حسین علی فلاحی³، احمدرضا دادرس⁴

¹ به ترتیب دانشجوی کارشناسی ارشد و استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان.

² دانشیار گروه تولیدات گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه گنبدکاووس.

³ عضو هئیت علمی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی گلستان.

⁴ دانشجوی دکتری اصلاح نباتات گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان.

تاریخ دریافت: 20/01/1392، تاریخ پذیرش: 30/03/1392

چکیده

واژههای کلیدی: تجزیه ارتباط، ساختار جمعیت، تنش غرقابی، نشانگرهای AFLP.

مقدمه

جو (Hordeum vulgare L.) بعد از گندم، برنج و ذرت جزء مهمترین غلات در تأمین غذای مردم جهان میباشد. بیشترین اهمیت گیاه جو به خاطر توانایی رشد و تولید آن در محیطهای خشک، دمای پایین و شور میباشد (Baum et al., 2003). از سوی دیگر جو به عنوان یک گیاه مدل در پژوهشهای ژنتیکی و فیزیولوژیکی محسوب میشود که این قابلیت آن به خصوصیاتی از جمله داشتن تنوع ژنتیکی و مورفو-فیزیولوژیکی بالا، در دسترس بودن نقشه ژنتیکی قابل استناد، یکساله بودن، چرخه زندگی کوتاه و قابلیت تلاقی با گونههای درون خزانههای ژنی اولیه بر میگردد (Tomas, 2002). جو (Hordeum vulgare L.) بهعنوان چهارمین غله مهم دنیا علیرغم تحمل نسبتاً مطلوب به تنش خشکی و شوری، نسبت به تنش غرقابی به ویژه در استانهای مستعد بارندگی، مقاومت چندانی نداشته و مورد خسارت جدی قرار میگیرد (Emam, 2007). با توجه به اینکه مشکل تنش غرقابی، تقریباً یک میلیون هکتار از اراضی زیر کشت ایران را تهدید میکند (Ghobadi et al., 2006) لذا مطالعه در زمینه بهنژادی تنش غرقابی در جو از جایگاه ویژهای برخوردار است. عامل اصلی تنش برای گیاه در خاکهای غرقاب، کمبود اکسیژن است (Brisson et al., 2002; Malekahmadi et al., 2005 ). کاهش اکسیژن قابل دسترس در شرایط غرقابی باعث کاهش توسعه ریشه و بخش هوایی گیاه میگردد (Brisson et al., 2002). بنابراین مطالعه بر روی خصوصیات ریشه میتواند در شناسایی ارقام مقاومتر جو و همچنین جایگاههای کنترل کننده صفات درگیر در تحمل ارقام جو به تنش غرقابی بسیار کارا باشد. شناسایی جایگاههای کنترل کننده صفات کمی پس از توسعه فناوری نشانگرهای مولکولی DNA، در بسیاری از گیاهان تاکنون توانسته اطلاعات ژنتیکی بسیار ارزشمندی در ارتباط با عوامل دخیل در کنترل صفات پیچیده در اختیار محققین قرار دهد (Gomez et al., 2011). اما در بسیاری از این مطالعات، QTLهای شناسایی شده فاصله ژنتیکی زیادی با نشانگرهای همجوار خود داشتهاند که این موضوع به عوامل زیادی از جمله اشباع نبودن نقشه پیوستگی و تفرق پایین افراد در جمعیتهای مصنوعی مورد مطالعه بر میگردد و در نتیجه این امر برنامههای ژنتیکی و اصلاحی بعدی همانند انتخاب به کمک نشانگر یا همسانهسازی ژن بر اساس نقشه را دچار مشکل میکند (Breseghello and Sorells, 2006). از سوی دیگر در مطالعات مبتنی بر تجزیه پیوستگی، اغلب از جمعیتهای مصنوعی حاصل از تلاقی دو والد هموزیگوت استفاده میشود و نوترکیبی در چرخههای میوزی طی فرآیند تولید جمعیتهای در حال تفرق مانند F2، هاپلوﺋیدهای مضاعف، تلاقی برگشتی و لاینهای اینبرد نوترکیب، درجه ارتباط یک QTL معین و نشانگرهای دور از آن کاهش مییابد و بنابراین، با توجه به وجود فقط یک چرخه میوزی در تولید جمعیتهایی مانند F2، هاپلوﺋیدهای مضاعف، تلاقی برگشتی، احتمال خطای نوع اول در آنها در شناسایی مکانهای کنترل کننده صفات بالا خواهد رفت. هر چند که در جمعیت لاینهای اینبرد نوترکیب وجود چرخه میوزی کافی، میزان عدم تعادل بین مکانهایی با پیوستگی ضعیف و خطای نوع اول را کاهش میدهد ولی میزان کاهش، به اندازه تلاقی تصادفی نیست. همچنین برای تولید چنین جمعیتهایی نیاز به زمان طولانی در مقایسه F2، هاپلوﺋیدهای مضاعف و تلاقی برگشتی است. از طرفی دیگر، تولید جمعیتهای مصنوعی به علت عدم امکان انجام تلاقی لازم در تعدادی از گونهها مثل انسان و یا گیاهان دگرگشن مثل درختان عملی نیست یا بسیار مشکل است (Gupta et al., 2005). برای غلبه بر این محدودیتها در سالهای اخیر روش مکانیابی ارتباط یا تجزیه ارتباط معرفی شده است که نه تنها امکان مکانیابی دقیق ژنها و مکانهای کنترلکننده صفات کمی را فراهم میکند، بلکه امکان شناسایی نواحی کروموزومی دیگری که در مطالعات مبتنی بر پیوستگی امکانپذیر نیستند را نیز میسر می سازد. در این روش نیازی به تهیه جمعیت در حال تفرق که نیاز به زمان زیادی دارد نمیباشد، ولی بهتر است از دادههای فنوتیپی چندساله استفاده شود (Breseghello and Sorells, 2006). در علوم گیاهی این روش همچنان رو به گسترش است. در این ارتباط میتوان به مطالعاتی بر روی جو در شرایط شور و یخ زدگی اشاره نمود. دستاورد این پژوهشها شناسایی 175 و 177 آلل نشانگر Bmag749 از مجموع نشانگرهای SSR استفاده شده در این پژوهش و دارای ارتباط معنیدار آماری با صفت عملکرد دانه در شرایط شور و شاهد (Eleuch et al., 2008) و همچنین ردیابی 62 آلل از 38 جفت نشانگر ریزماهواره پیوسته به 12 صفت مرتبط با یخ زدگی از جمله درصد آب طوقه، LT50، وزن تر و خشک گیاهچه و میزان اتلاف آب نسبی (Gangkhanlou et al., 2012) بود. علاوه بر این میتوان به پژوهشی بر روی 55 ژنوتیپ گندم با استفاده از 20 جفت آغازگر ریزماهواره، دو جفت آغازگر SAMPL و 8 جفت ترکیب آغازگر AFLP که جمعا 519 نشانگر چندشکل تولید کرده بودند، اشاره نمود که منجر به شناسایی 131 آلل ریزماهواره، 43 نشانگر SAMPL و 166 نشانگر AFLP شد که دارای ارتباط معنی دار با 14 صفت زراعی بودند (Roy et al., 2006). نظر به اهمیت تحقیقات ژنتیکی در ارتباط با تنش غرقابی در جو پژوهش حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی 40 ژنوتیپ جو با استفاده از نشانگرهای AFLP و تجزیه ارتباط آنها به منظور شناسایی نشانگرهای پیوسته به صفات مرتبط با تنش غرقابی طراحی شد و به انجام رسید.

مواد و روشها

مواد گیاهی پژوهش حاضر شامل 40 ژنوتیپ جو بود که از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان گلستان تهیه شد. در جدول 1 نام یا شجره آنها آورده شده است.

جدول 1- نام و شجره ژنوتیپهای جو مورد مطالعه در پژوهش حاضر.

Table 1- Name and pedigree of barley genotypes in this study.

نام یا شجره Name or pedigree	شماره ژنوتیپ Number Genotype	نام یا شجره Name or pedigree	شماره ژنوتیپ Number Genotype
EB-86-6	21	Youssef	1
EB-86-4	22	Izeh	2
EB-86-3	23	N B 17	3
EB-85-5	24	N B 5	4
EB-87-20	25	L4 Shori	5
EB-88-1	26	Nimroz	6
EB-88-3	27	Kavir	7
EB-88-4	28	Prodogtive	8
EB-88-5	29	Bahman	9
EB-88-7	30	36 Motadel	10
EB-88-10	31	31 Motadel	11
EB-88-14	32	28 Garm	12
EB-88-16	33	24 Garm	13
EB-88-19	34	21 Garm	14
Bomi	35	EC-84-10	15
Rihane	36	45 Motadel	16
Arass	37	EC-82-11	17
Goharjow	38	EC-81-13	18
Karoon	39	MB-82-12	19
EB-88-2	40	EB-86-14	20

این آزمایش به صورت اسپلیت پلات در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با دو عامل ژنوتیپ و تنش غرقابی (صفر، 10، 20 روز) با سه تکرار (هر تکرار شامل 3 گلدان و هر گلدان شامل سه گیاه بود) در دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان با عرض جغرافیایی 37 درجه و 16 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 51 درجه و 3 دقیقه ی شرقی از نصف النهار گرینویچ به صورت گلدانی اجرا شد. به منظور اعمال تیمارهای غرقابی، حوضچههایی به ابعاد 90 در 250 سانتیمتر با استفاده از دیوارهای بلوکی به ارتفاع 25 سانتیمتر و پوشش پلاستیکی ضخیم ایجاد شد و در زمان اعمال تنش یعنی زمانیکه 90 درصد گیاهان به مرحله سه برگی رسیدند، حوضچهها به میزانیکه سطح خاک گلدانها در حالت غرقاب قرار گیرد، از آب اشباع گردید. پس از به پایان رسیدن مدت تنش، صفات مربوط به ریشه شامل طول ریشه اصلی [1](TL)، حجم ریشه [2](RV)؛ وزن تر ریشه [3](RFW) و وزن خشک ریشه [4](RDW) (پس از قرار دادن ریشهها به مدت 48 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتیگراد) اندازهگیری شد. به علاوه سطح ریشه [5](RA) (Alizadeh, 2006) و قطر ریشه [6](RD) (Schenk and Barber, 1979)و چگالی سطح ریشه [7](RSD) (Hajabbasi, 2001) با استفاده از روابط زیر محاسبه شدند:

^5/0(حجم ریشه×π×طول ریشه)2=سطح ریشه

^5/0((طول ریشه× π) / وزن تر ریشه×4)= قطر ریشه

(طول ریشه× قطر ریشه× π) = چگالی سطح ریشه

استخراج DNA و انجام AFLP

پس از اندازهگیری صفات ، نمونههای برگی از گیاهان در شرایط نرمال به منظور استخراج DNA تهیه شد. استخراج DNA به روش CTAB (Saghai Maroof et al., 1994) انجام شد و کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 1 درصد و به همراه فاژ لامبدا تعیین شد.

روش AFLP مطابق روش وس و همکاران (Vos et al., 1995) با استفاده از آنزیمهای محدودگر EcoRI و MseI انجام شد. در مرحله پیش تکثیر، نمونهها با آغازگرهای EcoRI و MseI دارای یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای '3 تکثیر یافتند و محصولات پس از رقیقسازی به نسبت 5:1 با هفت ترکیب آغازگری (جدول 2) دارای 2 نوکلئوتید انتخابی دیگر در انتهای '3، تحت چرخه حرارتی Touch down شامل سه مرحله دمایی مختلف تکثیر شدند. فراوردههای PCR با استفاده از الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید شش درصد تفکیک و به روش نیترات نقره رنگ آمیزی شدند. در نهایت هم امتیازدهی نوارها به صورت صفر و یک به ترتیب برای عدم حضور و حضور نوارها انجام گرفت.

تجزیههای آماری

بعد از امتیازدهی نوارها، آمارههای تنوع ژنتیکی شامل محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) با استفاده از رابطه

که در آن PICi، PIC نشانگر iام، fi فراوانی قطعه نشانگر iام هنگام وجود و (1-fi) فراوانی قطعه نشانگر iام در حالت عدم وجود نوار است (Roldain-Ruiz et al., 2000)، با استفاده از نرم افزار Excel و سایر آمارهها مانند تعداد آللهای موثر، شاخص تنوع ژنتیکی نی و شاخص شانون (Shannon and Weaver, 1963) با استفاده از نرم افزار PopGene (Yeh et al., 1997) محاسبه گردیدند.

جدول2- ترکیبات آغازگری مورد استفاده در تجزیه AFLP.

Table2- Primer combination used for AFLP analysis.

آغازگرهای MseI MseI Primer		آغازگرهای EcoRI EcoRI Primer
توالی DNA Sequencing DNA	نام Name	توالی DNA Sequencing DNA	نام Name
GATGAGTCCTGAGTAAAGA	M150	GACTGCGTACCAATTCAAG	E060
GATGAGTCCTGAGTAAAGT	M160	GACTGCGTACCAATTCAAT	E070
		GACTGCGTACCAATTCACG	E080
		GACTGCGTACCAATTCACT	E090
		GACTGCGTACCAATTCAGT	E100
		GACTGCGTACCAATTCATC	E110

برای انجام تجزیه ساختار و تفکیک کل جمعیت به زیر جمعیتهای متمایز از لحاظ ساختار ژنتیکی از نرم افزار2.3.4 STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) استفاده شد و ماتریس صفر و یک حاصل از نشانگرهای AFLP وارد نرمافزار شد. از آنجائیکه در مورد ساختار جمعیت اطلاعات قبلی در دست نبود تعداد بهینه K با شبیهسازی محاسبه گردید. K تعداد زیر جمعیتهای مورد مطالعه در جمعیت مورد نظر با استفاده از نرم افزار STRUCTURE میباشد. در حقیقت تعیین تعداد زیر جمعیتهای ساختار ژنتیکی برای انجام تجزیههای آماری مهم مثل تجزیه ارتباط برای تعیین نشانگرهای معنیدار واقعی مرتبط با صفات اهمیت زیادی دارد. برای این منظور برای جمعیت مورد استفاده تعداد K از 2 تا 10 درنظر گرفته شد و برای محاسبه تعداد زیرجمعیت (K) از روش (Evanno et al., 2005) استفاده شد. بدین صورت که از دو ستون خلاصه شده K و LnP(D) برای محاسبات استفاده گردید و برای هرK، میانگین L(K) و انحراف معیار (Stdev) تکرارها محاسبه گردید. بعد از آن تفاضل میانگین تکرارها برای گروههای مجاور به صورت گروه بالاتر منهای گروه پایینتر و بهنام L'(K) تعیین و سپس تفاضل L'(K) برای گروههای مجاور و بهنام L''(K) محاسبه گردید که در نهایت از این محاسبات K∆ تعیین شد. در صورتی که نمودار دو طرفه K و K∆ رسم گردد، نقطه اوج منحنی همان تعداد بهینه K خواهد بود. جدول 5 آمارههای محاسبه شده برای تعیین مقدار K برای ژنوتیپهای جو را نشان میدهد و شکل 1 نمودار دو طرفه برای تعیین بهینه K را نشان میدهد. در این شکل مقدارK و ∆K از نتایج مربوط به شبیه سازی در نرمافزار STRUCTURE استخراج گردید. مقدار بهینه K نقطه اوج منحنی است که با توجه به نمودار، بهترین K در این مطالعه 3 میباشد. در واقع تجزیه ساختار نشان داد که تعداد خوشههایی که پارامتر K∆ را به حداکثر خود میرساند برابر 3 میباشد. انتساب افراد به زیرجمیتها نیز مطابق روش (Spataro et al. 2011) انجام شد و برای هر فرد در هر گروه درصد عضویت محاسبه شد. مطابق این روش یک ژنوتیپ هنگامی میتواند به انتساب یک گروه درآید که درصد عضویت آن 7/0 یا بیشتر از آن باشد و در صورتی که درصد عضویت کمتر از 69/0 باشد به عنوان ژنوتیپ مخلوط در نظر گرفته میشود. در بررسی حاضر پس از تعیین تعداد K، ماتریس دودمان افراد یا Q بر اساس آن تشکیل گردید و برای انجام تجزیه ارتباط وارد نرمافزار TASSEL 4.1.32 (Bradbury et al., 2007) گردید. تجزیه ارتباط با نرمافزار TASSEL با استفاده از سه مدل (جدول 3) انجام گرفت.

این نرمافزار امکان انجام تمام آزمونهای مرتبط با مدلها و رویههایی مانند [8]GLM و MLM[9] را فراهم میکند. رویه GLMرویهای است که بدون دخالت ساختار جمعیت، ارتباط بین نشانگر و صفات اندازهگیری شده را به ما میدهد نمیتواند خیلی مورد اعتماد باشد و کمتر مورد استفاده قرار میگیرد. اخیراً بیشتر از رویه MLM برای درک ارتباط بین نشانگر و صفت استفاده میشود چون در پیدا کردن ارتباط، هم ماتریسهای ساختار جمعیت و هم خویشاوندی بین افراد را دخالت میدهد و اثرات ناشی از این عوامل را کم میکند و ارتباطات معنیدار شناسایی شده بین نشانگر و صفت از اطمینان و اعتبار بیشتری برخوردارند (Agrama et al., 2007).

نتایج و بحث

آمارههای تنوع ژنتیکی برای ترکیبات آغازگری بکاررفته در جدول 4 آورده شده است. نشانگرهای AFLP در کل تعداد 245 نوار تولید نمودند که از این تعداد، 227 نوار چندشکل بودند. متوسط درصد چندشکلی ترکیبات آغاگری 37/92 درصد بود. با توجه به درصد بالای چندشکلی بدست آمده در پژوهش حاضر میتوان انتظار داشت این نشانگرها بتوانند به عنوان یک ابزار قدرتمند در شناسایی و تفکیک ژنوتیپهای جو عمل نمایند. Zhang et al., (2006) اظهار داشتند که دسترسی به نرخ بالایی از چندشکلی، ارزیابی کارا و سودمندی را در بررسیهای مربوط به تنوع ژنتیکی به دست میدهد. بنابراین میتوان از نشانگر AFLP به عنوان یک ابزار قدرتمند در برنامههای اصلاحی گیاهان زراعی بمانند جو استفاده نمود.

جدول 3- سه مدل آماری استفاده شده برای انجام تجزیه ارتباط نشانگرهای AFLP و صفات فنوتیپی.

Table 3: The three used statistical models for doing of association analysis of AFLP markers and phenotypic traits.

مدل Model	مجموعه داده مورد استفاده Used data set
1: GLM^a	Phenotype + AFLP
2: GLM	Phenotype + AFLP + Q^b
5: MLM^c	Phenotype + AFLP + K^d+ Q

a: GLM: General linear model= مدل خطی عمومی،

b: Q: Population structure data or Inferred ancestry of individuals دادههای ساختار جمعیت یا اصل و نسب استنباط شده ازافراد،

c: MLM: Mixed linear model= مدل خطی مخلوط،

d: K: Kinship data derived from general similarity in genetic background arising from shared kinship دادههای خویشاوندی حاصل از مشابهت کلی افراد از لحاظ زمینه ژنتیکی ناشی از خویشاوندی

از معیارهای دیگر برای ارزیابی کارایی نشانگر در تعیین چندشکلی، شاخص شانون است که مقدار آن برای ترکیبات E90-M150،E90-M160 و E100-M160 به ترتیب 56/0، 59/0 و 59/0 بدست آمد که با نتایج PIC همخوانی داشت. تعداد آللهای مؤثر در بین نشانگرهای مطالعه شده متفاوت بود. میانگین تعداد آللهای مؤثر در کل 58/1 بدست آمد و از 35/1 تا 74/1 متغیر بود. بیشترین تعداد آلل موثر برای ترکیبات E90-M160 و E100-M160 شناسایی شد. یکی از مهمترین شاخصها برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در بین کل ژنوتیپها، شاخص ژنتیکی نی است. برآورد شاخص نی نشان داد میزان تنوع از 25/0 تا 40/0 متغیر است و ترکیبات آغازگری E90-M160 و E100-M160 به ترتیب بیشترین میزان تنوع نی را دارا بودند. ترکیب E80-M160 کمترین میزان تنوع نی را در بین کلیه ترکیبات نشان داد. میانگین تنوع نی نیز 35/0 برآورد گردید. بررسی کلی آمارههای تنوع ژنتیکی نشان داد که از بین هفت ترکیب آغازگری AFLP، سه ترکیب E90-M160، E100-M160 و E90-M150 نسبت به سایر ترکیبات AFLP مقادیر بالاتری را به خود اختصاص دادند و در حقیقت میتوان اذعان داشت در تمایز ژنوتیپها نقش بارزتری ایفا نمودند.

جدول4- آمارههای تنوع ژنتیکی برای 7 ترکیب آغازگری AFLP.

Table 4- Statistical of genetic diversity for 7 primer combination in this study.

شاخص شانون Shannon index	ضریب تنوع نی Nei gene diversity	تعداد آلل های موثر Effective Allel Number	محتوای اطلاعات چندشکلی PIC	درصد چندشکلی (%) Poly. Percentag	کل نوارها Total. Bands	نوارهای چندشکل Poly. Bands	ترکیب آغازگری Primer combination
0.52	0.34	1.56	0.29	93.33	30	28	E80-M150
0.56	0.38	1.68	0.42	95	40	38	E90-M150
0.50	0.33	1.56	0.31	91.42	35	32	E100-M150
0.53	0.33	1 58	0.41	84.37	32	27	E110-M150
0.42	0.25	1.35	0.30	87.87	33	29	E80-M160
0.59	0.40	1.74	0.40	97.36	38	37	E90-M160
0.59	0.40	1.71	0.42	97.29	37	36	E100-M160
3.71	2.45	11.08	2.55	646.46	245	227	کل
0.53	0.35	1.58	0.36	92.37	35	32.42	میانگین

تجزیه ساختار ژنتیکی

تجزیه ساختار جمعیت با استفاده از نرم افزار STRUCTURE، امکان شکستن کل جمعیت به زیرجمعیتهایی با ساختارهای متفاوت محتمل را فراهم میسازد. زیرجمعیتهای تشکیل شده از لحاظ ژنتیکی متمایز از هم میباشند و چنانچه ژنوتیپهایی به صورت اختلاطیافته باشند، پس از انجام این تجزیه قابل تشخیص خواهند بود (Dadras, 2012). بر طبق نتایج نرمافزار STRUCTURE،K و K∆ که بترتیب تعداد زیرگروهها و میزان تغییرات آنها با توجه به شبیه سازی های انجام شده در نرمافزار میباشد، استخراج و نمودار دو بعدی آن رسم شد. شکل 1 نمودار دو طرفه برای تعیین بهینه K را نشان میدهد که با توجه به نمودار بهترین K در این مطالعه که در واقع نقطه اوج منحنی است، 3 میباشد. در واقع تجزیه ساختار نشان داد که تعداد خوشههایی که پارامتر K∆ را به حداکثر خود میرساند برابر 3 میباشد. جدول 6 درصد عضویت 40 ژنوتیپ جو را نشان میدهد. براین اساس 13 ژنوتیپ شامل 4، 5، 8، 6، 7، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15 و 16 منتسب به گروه 1 شدند و تعداد 17 ژنوتیپ شامل 1، 2، 35، 36، 17، 19، 23، 25، 26، 27، 28، 29، 30، 31، 32، 33 و 34 به عضویت گروه 2 و 4 ژنوتیپ 37، 38، 39 و 40 به عضویت گروه 3 درآمدند. 6 ژنوتیپ 3، 18، 20، 21، 22 و 24 هم جزو ژنوتیپهای مخلوط بودند. بدین معنی که چون درصد عضویت کمتراز 69/0 داشتند بنابراین نتوانستند به هیچ کدام از گروهها منتسب گردند. بار پلات ساختار جمعیت مستخرج از STRUCTURE در شکل 2 آورده شده است.

جدول5- آمارههای محاسبه شده برای مقدار بهینه K با استفاده از نرم افزار STRUCTURE.

Table 5- statistics calculated for optimum K using the software STRUCTURE.

K	L(K)^a	Stdev	L'(K)^b	L''(K)^c	∆ K^d
1	-4790.5	12.34	-	-	0
2	-4475.07	73.91	315.42	-1.6	0.02
3	-4161.24	46.19	313.82	-202.9	4.39
4	-4050.31	120.44	110.92	-8.4	0.06
5	-3947.79	113.28	102.52	-90.75	0.80
6	-3936.01	87.74	11.77	28.4	0.32
7	-3895.84	53.60	40.17	-92.57	1.72
8	-3948.24	151.51	-52.4	-137.25	0.90
9	-4137.9	466.65	-189.65	417.74	0.89
10	-3909.81	73.21	228.08	-228.08	3.11

a میانگین LnP(D) تکرارها برای هر K، b ، c و d

شکل1- نمودار دو طرفه برای تعیین تعداد بهینه K.

Figure 1- Bilateral chart to determine the optimal number K.

شکل 2- بار پلات ساختار جمعیت مستخرج از STRUCTURE و 227 نشانگر AFLP که در سه بخش رنگی تقسیم شده است. نام ژنوتیپها با شماره آنها در جدول 1 آورده شده است.

Fig 2: Bar plot of population structure as inferred by STRUCTURE and 227 AFLP markers data set, partitioned into K coloured segments (K=3). The genotypes names with their numbers exist in the table 1.

جدول 6- درصد عضویت ژنوتیپها براساس نتایج مستخرج از نرم افزار STRUCTURE.

Table6- Member percentage of genotype taken based on the results of STRUCTURE software.

درصد عضویت گروه 3 Member percentage of group 3	درصد عضویت گروه 2 Member percentage of group 2	درصد عضویت گروه 1 Member percentage of group 1	ژنوتیپ Genotype	شماره Number	درصد عضویت گروه 3 Member percentage of group 3	درصد عضویت گروه 2 Member percentage of group 2	درصد عضویت گروه 1 Member percentage of group 1	ژنوتیپ Genotype	شماره Number
0.001	0.632	0.367	EB-86-6	21	0.143	0.854	0.003	Youssef	1
0.029	0.478	0.494	EB-86-4	22	0.002	0.992	0.005	Izeh	2
0	0.902	0.098	EB-86-3	23	0.004	0.511	0.485	N B 17	3
0.001	0.507	0.492	EB-85-5	24	0.213	0.007	0.78	N B 5	4
0.02	0.972	0.008	EB-87-20	25	0.001	0.043	0.954	L4 Shori	5
0	0.996	0.003	EB-88-1	26	0.001	0.001	0.998	Nimroz	6
0.001	0.995	0.004	EB-88-3	27	0.156	0.041	0.803	Kavir	7
0	0.821	0.179	EB-88-4	28	0.001	0.031	0.968	Prodogtive	8
0.008	0.937	0.059	EB-88-5	29	0.001	0.001	0.998	Bahman	9
0.018	0.942	0.04	EB-88-7	30	0.012	0.001	0.987	36 Motadel	10
0.022	0.968	0.01	EB-88-10	31	0.003	0	0.996	31 Motadel	11
0.023	0.96	0.018	EB-88-14	32	0.001	0.001	0.997	28 Garm	12
0.012	0.983	0.006	EB-88-16	33	0.007	0.008	0.985	24 Garm	13
0.003	0.994	0.003	EB-88-19	34	0.002	0.005	0.993	21 Garm	14
0.2	0.789	0.012	Bomi	35	0.001	0.018	0.981	EC-84-10	15
0.001	0.999	0.001	Rihane	36	0	0.152	0.847	45 Motadel	16
0.827	0.171	0.001	Arass	37	0.009	0.986	0.005	EC-82-11	17
0.995	0	0.004	Goharjow	38	0.007	0.671	0.322	EC-81-13	18
0.999	0.001	0	Karoon	39	0.004	0.832	0.164	MB-82-12	19
0.72	0.297	0	EB-88-2	40	0.002	0.523	0.475	EB-86-14	20

در مطالعهای که بر روی 225 توده جو (شامل 175 توده SBCC) با استفاده از 73 نشانگر SSR در طول ژنوم جو انجام شد، تجزیه ساختار جمعیت با نرم افزار STRUCTURE با استفاده از دادههای 64 نشانگر SSR توانست تودههای اسپانیایی را بهخوبی از سایر تودههای اروپایی تفکیک کند. پژوهش آنها نشان داد که اعمال اثر ساختار جمعیت در تجزیه ارتباط باعث کاهش تعداد ارتباط معنیدار میشود یعنی بخشی از ارتباطات واقعی بین صفت و نشانگر که ناشی از ساختار جمعیت نیست را نشان میدهد. اگر چه تعداد نشانگرهای معنیدار در این پژوهش کم بود، اما باز هم تعدادی نشانگر قوی پیوسته به QTLهای ممکن وجود داشت و این نشانگرها شناسایی شدند (Casas et al., 2006).

تجزیه ارتباط

تجزیه ارتباط با استفاده از نرم افزار TASSEL اجرا شد. در این بررسی، از سه مدل آماری برای تجزیه ارتباط استفاده شد که در جدول 3 نشان داده شده است. در کل برای 22 متغیر که شامل هشت صفت اندازهگیری شده در شرایط نرمال و متوسط شرایط تنش و همچنین شش شاخص تحمل به تنش، تعداد 91 نشانگر ارتباط معنیداری را با این صفات در سطح یک درصد نشان دادند (جدول 7).

از این تعداد 15 و 55 نشانگر بترتیب به صفات اندازه گیری شده در شرایط نرمال و متوسط شرایط تنش و 21 نشانگر به شاخصهای تحمل اختصاص داشت. در این جدول نشانگرهای دارای ارتباط معنیدار شناسایی شده با استفاده از مدل MLM در سطح پنج درصد نیز آورده شده است. مدل MLM در این سطح توانست 87 نشانگر معنیدار را مرتبط با 22 متغیر مورد بررسی شناسایی نماید. بدیهی است تعداد زیادی از این نشانگرها با استفاده از مدلهای GLM نیز تعیین شده بودند. در جدول 7 برای نشانگرهای معنیدار سطح معنیداری به همراه ضریب تبیین نشانگر آورده شده است.

در شرایط نرمال بالاترین ضریب تبیین به نشانگر E100M16027 با توجیه 32 درصد از تغییرات قطر ریشه با مدل MLM در سطح پنج درصد اختصاص داشت.

نشانگر E80-M150-1 نیز مرتبط با سه صفت حجم ریشه، وزن تر و وزن خشک ریشه شناسایی شد. باید خاطر نشان نمود شناسایی نشانگرهای مرتبط با چندین صفت مهم میتواند در برنامههای اصلاحی بسیار کاربردی باشد.

مدل MLM در سطح پنج درصد برای شش شاخص تحمل مورد بررسی، 18 نشانگر معنیدار را شناسایی نمود. بالاترین درصد توجیه تغییرات فنوتیپی به نشانگر E80-M150-1 با 24 درصد توجیه تغییرات GMP اختصاص داشت.

جدول 7- نتایج تجزیه ارتباط بین نشانگرهای AFLP و صفات مختلف در شرایط نرمال، تنش غرقابی و شاخصهای تحمل با سه مدل آماری.

Table 7- The results of association analysis between AFLP markers and different traits in normal and flooding stress with tolerance index using three statistical models.

		نشانگرهای معنیدار در سطح احتمال یک درصد Significant markers in 1% probability level				نشانگرهای معنیدار در سطح احتمال پنج درصد Significant markers in 5% probability level
صفت Trait	نشانگر Marker	مدل 1 Model 1		مدل 2 Model 2		مدل 3 Model 3
صفت Trait	نشانگر Marker	سطح احتمال Prob	R²	سطح احتمال Prob	R²	نشانگر Marker	سطح احتمال Prob	R²
YN1*	E80M15022	0.0011	0.55	0.0023	0.42	E100M15011	0.01625	0.23
	E90M16037	0.0024	0.41	0.0018	0.36	E90M16037	0.00898	0.27
	E100M16024			0.0084	0.27
YN2	E100M15028	0.0044	0.37	0.004	0.40	E100M15026	0.02824	0.21
YN2	E100M15032	0.0044	0.37	0.004	0.40	E80M1501	0.04552	0.18
YN3						E80M16014	0.04977	0.11
						E100M16022	0.0233	0.22
						E80M1501	0.02761	0.21
YN4	E90M16035	0.0041	0.37	0.0084	0.35	E90M16035	0.01978	0.23
	E90M16037	0.0032	0.39	0.0054	0.38	E90M16037	0.00582	0.32
						E80M1501	0.018	0.24
						E90M15020	0.03851	0.12
						E80M1608	0.01253	0.18
						E110M1501	0.04361	0.11
						E80M1601	0.01622	0.17
						E80M16016	0.01964	0.16
						E80M16017	0.01622	0.17
YN5	E90M16023	0.002	0.42	0.0059	0.31	E90M16023	0.02285	0.22
						E100M15011	0.043	0.18
						E100M15028	0.04595	0.18
						E110M1505	0.0385	0.12
						E110M15013	0.03942	0.12
YN6	E90M1508	0.0039	0.48	0.003	0.52	E110M15022	0.02786	0.14
	E90M15015	0.009	0.42			E100M16012	0.0268	0.26
	E90M15016	0.0067	0.44	0.0091	0.45	E100M16027	0.0126	0.32
	E90M15020			0.0083	0.46	E100M16033	0.0204	0.28
	E100M15010	0.007	0.34			E90M15037	0.0437	0.18
	E90M16023	0.0034	0.39			E100M1609	0.04099	0.18
YN7						E80M1501	0.04245	0.18
						E80M16014	0.03748	0.12
						E100M1506	0.02148	0.22
						E110M15013	0.02608	0.14
YN8	E90M16023	0.0052	0.36			E110M15010	0.02005	0.15
						E90M16023	0.03048	0.19
						E100M15019	0.0337	0.19
						E110M1509	0.03611	0.12
						E110M15019	0.02875	0.13
	E100M15028	0.0000	0.78	0.0000	0.78	E100M15032	0.04428	0.18
SSI	E100M15032	0.0000	0.78	0.0000	0.78	E110M15025	0.04264	0.12
	E90M15013			0.0064	0.44
GMP	E100M15026			0.0032	0.41	E110M15022	0.03727	0.12
						E80M1501	0.01702	0.24
						E90M16013	0.03311	0.20
						E90M16037	0.04414	0.18
						E100M16034	0.0346	0.20

ادامه جدول 7 (continue of Table 7)

STI	E100M15026			0.0028	0.42	E100M15026	0.03278	0.20
						E90M16013	0.02603	0.21
						E90M16037	0.04038	0.19
						E100M16034	0.03688	0.19
	E100M15028	0.0042	0.37	0.0015	0.40	E100M15026	0.04496	0.18
TOL	E100M15032	0.0042	0.37	0.0015	0.40	E100M1602	0.03751	0.198
	E90M16016	0.0076	0.33
	E90M15013			0.0081	0.40

	E110M15014	0.0000	0.55	0.0012	0.35	E110M15014	0.04658	0.11287
	E90M1607	0.0083	0.33			E90M15027	0.03718	0.19247
	E100M1605	0.0056	0.35
	E100M1606	0.0000	0.49	0.0096	0.25
YI	E100M1607	0.0056	0.35
	E100M16015	0.001	0.46
	E110M15015			0.0036	0.30
	E90M16024			0.0043	0.29
	E100M16036			0.0085	0.26
	E100M15028	0.0000	0.78	0.0000	0.78	E100M15032	0.04428	0.18249
YSI	E100M15032	0.0000	0.78	0.0000	0.78	E110M15025	0.04265	0.11812
	E90M15013			0.0064	0.44	E110M15014	0.04858	0.11146
YS1**	E80M15011	0.0049	0.46	0.0000	0.78	E90M16035	0.04863	0.16503
						E80M1502	0.03879	0.17855
						E80M1504	0.0232	0.20996
						E80M1505	0.04411	0.17084
						E80M1506	0.03228	0.18966
YS2	E110M15014	0.0000	0.55	0.0012	0.35	E110M15014	0.04693	0.11247
	E90M1607	0.0084	0.33			E90M15027	0.03706	0.19266
	E100M1605	0.0056	0.35
	E100M1606	0.0000	0.49	0.0096	0.25
	E100M1607	0.0055	0.35
	E100M16015	0.001	0.46
	E110M15015			0.0036	0.30
	E90M16024			0.0043	0.29
	E100M16036			0.0084	0.26
YS3	E90M15036	0.0026	0.50			E110M15014	0.02064	0.15496
	E110M1504	0.0034	0.39			E110M15015	0.0114	0.2477
	E110M15014	0.0000	0.66	0.0000	0.46	E90M15027	0.04307	0.18215
	E90M1607	0.0000	0.48	0.0067	0.28	E90M16016	0.03358	0.19803
	E90M16015	0.0048	0.36
	E100M1604	0.0022	0.41
	E100M1605	0.0036	0.38
	E100M1606	0.0000	0.51	0.0059	0.28
	E100M1607	0.01	0.31
	E100M16015	0.0000	0.49	0.0057	0.28
	E90M16024			0.0048	0.29
YS4	E110M1504	0.0014	0.44			E110M1504	0.01398	0.17775
	E110M15014	0.0027	0.40	0.0082	0.28	E80M16015	0.04782	0.11178
	E90M1607	0.0027	0.40			E90M16030	0.04473	0.18108
	E90M16010	0.0025	0.41			E110M15022	0.02043	0.15667
	E90M16015	0.0012	0.45			E90M16016	0.0252	0.21818
						E90M16018	0.03471	0.19732
						E90M16022	0.03305	0.2005
						E90M16037	0.0357	0.19551

ادامه جدول 7 (continue of Table 7)

YS5	E110M15014	0.0024	0.41			E90M15027	0.02699	0.21461
	E100M1606	0.0079	0.33			E110M15022	0.04087	0.12033
	E80M15011			0.0057	0.42
YS6	E90M15029	0.0036	0.48			E90M15029	0.04066	0.18825
	E90M15032	0.0036	0.48			E110M15014	0.03443	0.12945
	E90M15035	0.006	0.45			E110M15022	0.02868	0.13914
	E90M15036	0.0012	0.54			E100M16034	0.03717	0.19403
	E100M1506	0.0068	0.34			E90M15015	0.04643	0.17975
	E110M1506	0.0059	0.35			E90M16016	0.04124	0.18735
	E110M15014	0.0000	0.64	1.93E-04	0.45	E100M16016	0.02929	0.20954
	E110M15021	0.0052	0.36
	E110M15022	0.0035	0.39
	E90M1604	0.0082	0.33
	E90M1607	0.0019	0.42	0.0043	0.31
	E90M16024	0.0045	0.37	0.0011	0.38
	E100M1604	0.0000	0.52	0.0058	0.29
	E100M1605	0.0000	0.50	0.0094	0.27
	E100M1606	0.0000	0.60	0.0011	0.37
	E100M1607	0.0015	0.44	0.0076	0.28
	E100M16015	0.0000	0.61	0.0000	0.38
	E110M15015			0.0024	0.34
	E90M16020			0.0043	0.31
	E100M16034			0.0039	0.31
	E110M1504	0.0048	0.36
	E110M15014	0.0000	0.50	0.002	0.38
	E90M1607	0.0069	0.34
	E100M1606	0.0061	0.35
	E80M15011			0.0053	0.42
YS7						E110M15022	0.02518	0.14579
YS7						E90M1509	0.03894	0.19055
YS8	E80M16020			0.0045	0.40	E80M16020	0.04679	0.11098
						E100M15019	0.04137	0.18291
						E100M15022	0.01773	0.23745

*: صفات اندازه گیری شده در شرایط نرمال YN1: طول ریشه، YN2: حجم ریشه، YN3: وزن تر ریشه، YN4: وزن خشک ریشه، YN5: سطح ریشه، YN6: قطر ریشه، YN7: چگالی ریشه، YN8: وزن خشک اندام هوایی. **: صفات اندازه گیری شده در متوسط شرایط تنش YS1: طول ریشه، YS2: حجم ریشه، YS3: وزن تر ریشه، YS4: وزن خشک ریشه، YS5: سطح ریشه، YS6: قطر ریشه، YS7: چگالی ریشه، YS8: وزن خشک اندام هوایی.

*: Evaluated traits in normal condition. YN1: Root length, YN2: Root volume, YN3: Root fresh weight, YN4: Root dry weight, YN5: Root surface, YN6: Root diameter, YN7: Root density, YN8: Shoot dry weight.

**: Evaluated traits in stress condition. YS1: Root length, YS2: Root volume, YS3: Root fresh weight, YS4: Root dry weight, YS5: Root surface, YS6: Root diameter, YS7: Root density, YS8: Shoot dry weight.

برخی از نشانگرها مثل E100M15032، E110-M150-25 و E110-M150-14 به بیش از یک شاخص مرتبط بودند که با توجه به وجود همبستگی بین شاخصها، این نتیجه دور از انتظار نبود. برای صفات اندازه گیری شده در متوسط شرایط تنش نیز تعداد 33 نشانگر ارتباط معنیداری را با استفاده از مدل MLM در سطح پنج درصد نشان دادند. نشانگر E100-M150-22 با تبیین 24 درصد از تغییرات فنوتیپی وزن خشک اندام هوایی بالاترین درصد ضریب تبیین را در بین نشانگرها به خود اختصاص داد. نشانگر E110M15014 با سه صفت در شرایط تنش مرتبط بود.

در بررسی که بر روی توتون به منظور شناسایی نواحی ژنومی مرتبط با مقاومت به سه بیماری معمول توتون از نشانگرهای AFLP و 92 نمونه مختلف N. tabacum استفاده شد که در کل هفت نشانگر به ترتیب دو، سه و دو نشانگر مرتبط با مقاومت به بیماری پوسیدگی سیاه ریشه (Black root rot)، کپک آبی (Blue mold) و ویروس Y سیب زمینی (Potato Virus Y) شناسایی شدند. همچنین آنها تعدادی از این نشانگرها را به SCAR تغییر داده و سپس در جمعیت لاینهای اینبرد نوترکیب و هاپلوئید مضاعف به تأیید رساندند. این نشانگرها قادر بودند نمونههای بیمار و سالم را از هم تفکیک نمایند ((Julio et al., 2006.

در مطالعهای که بر روی جو که 14 صفت زراعی بر روی 55 ژنوتیپ الیت انجام شد، تجزیه ارتباط با استفاده از 519 نوار چندشکل مشتق از 20 نشانگر SSR، دو نشانگر SAMPLE و هشت نشانگر AFLP انجام شد و نتایج پژوهش آنها نشان داد در کل بترتیب 131، 43 و 166 نشانگر SSR، SAMPLE و AFLP حداقل با یکی از 14 صفت ارتباط معنیداری دارند. از بین این تعداد، با در نظر گرفتن هر دو مدل GLM و MLM در بررسی آنها، تعداد 51 نشانگر به عنوان نشانگرهای مثبت و آگاهی بخش شناسایی شدند و در نهایت اظهار داشتند این نشانگرهای معنیدار پس از تأیید و اعتبارسنجی میتوانند در برنامههای اصلاحی بسیار کاربردی باشند(Roy et al., 2010) . در بررسی دیگری که به منظور شناسایی نواحی مؤثر در محتوای بتا-گلوکان در دانه 89 توده جو با منشا لاتویان و 22 توده با منشا هالس با استفاده از 1273 نشانگر SNP انجام شد، با استفاده از مدل MLM همراه با ماتریسهای K و Q، تعداد سه نشانگر 1_0673، 2_0880 و 1_1445 بر روی کروموزوم 7H شناسایی شد که ارتباط معنیداری را با محتوای بتا-گلوکان داشتند از آنجاییکه محتوای بتا-گلوکان از مهمترین ترکیبات برای تعیین کیفیت دانه جو است با شناسایی نشانگرهای مرتبط با این ترکیب میتوان در جهت بهبود میزان و افزایش میزان این ترکیب گام برداشت (Mezaka et al., 2011).

در بررسی که به منظور شناسایی جایگاه صفات کمی و تجزیه ارتباط در 155 ذرت اینبرد با 1536 SNP انجام شد، نشان داد که استفاده از مدل MLM 15/1، 15/1 و 66/1 درصد SNPها ارتباط معنیدار با تمامی محتوای توکوفرول در دانه ذرت، ارتفاع گیاه و طول دانه در سطح یک درصد داشتند. همچنین این تحقیق نشان داد که برای تمامی صفات استفاده از مدل مبتنی بر K و مدل مبتنی بر Q به تنهایی عملکرد خوبی ندارند اما استفاده از مدل مبتنی بر K و Q بطور مشترک در مدل MLM نتایج بهتر و مؤثرتری را در بردارد (Yang et al., 2010).

نتیجهگیری کلی

در کل با توجه به بالا بودن آمارههای تنوع ژنتیکی در ترکیبات آغازگری E90-M160، E100-M160 و E90-M150 میتوان به کارایی بالای این ترکیبات اذعان داشت و از آنها در برنامههای اصلاحی دیگر به عنوان ترکیبات مناسب و کارا استفاده نمود. تجزیه ارتباط با استفاده مدل MLM توانست 87 نشانگر معنیدار مرتبط با 22 متغیر مورد بررسی را شناسایی نماید. تشخیص نشانگرهایی مانند E90-M160-37 و E80-M150-1 که مرتبط با چندین صفت بودند، میتوانند مقدمهای بر انجام تحقیقات دقیقتر در نواحی کاندید شناسایی شده در ژنوم باشند. تبدیل نشانگرهای AFLP به نشانگرهای اختصاصی SCAR یا نواحی تکثیری با توالی مشخص پس از تأیید پیوستگی نشانگر AFLP به مکان ژنی کنترل کننده صفت، راهکار عملی و کاربردی است که انتظار میرود که برای نشانگرهای مهم شناسایی شده در این تحقیق نیز مورد استفاده قرار گیرد.

منابع

Alizadeh A (2006). Soil, water-plant relationship. Astane of Ghodse of Razavi. 472 p.

Agrama HA, Eizenga GC, Yan W (2007). Association mapping of yield and its components in rice cultivars. Molecular Breeding 19: 341-356.

Baum M, Grando S, Backes G, Jahoor A, Sabbagh A, Ceccarelli S (2003). QTLs for agronomic traits in the mediterranean environment identiﬁed in recombinant inbred lines of the cross ‘Arta’ x H. spontaneum 41-1. Theoretical and Applied Genetics. 107: 1215-1225.

Bradbury PJ, Zhang Z, Kroon DE, Casstevens TM, Ramdess Y, Buckler ES (2007). TASSEL: Software for association mapping of complex traits in divers samples. Bioinformatics Applications Note. 2633-2635.

Breseghello F, Sorrells ME (2006). Association analysis as a stategy for improvement of quantitative traits in plants. Crop Science. 46: 1323-1330.

Brisson N, Rebiere B, Zimmer D, Renalt D (2002). Response of the root system of winter wheat crop to water logging. Plant and Soil. 243: 43-55.

Casas AM, Kopahnke D, Habekub A, Schwizer G, Gracia MP, Lasa JM, Ciudad FJ, Codesal P, Moralejo MA, Molina-Cano JL, Igartua E, Ordon F (2006). Marker-trait association for disease resistance in the Spanish barley core collection. Eucarpia, Lleida. 141-145.

Dadras AR (2012). Evaluation of genetic diversity of tobacco (Nicotiana tabacum L.) cultivars using AFLP molecular markers. Iran, Shahib Bahonar University of Kerman. M. Sc. Thesis.

Emam Y (2007). Cereal production. Shiraz Univ. Press, third Edition. 190p.

Eleuch L, Jilal A, Grando S, Ceccarelli S, Schmising MK, Tsujimoto H, Hajer A, Daaloul A, Baum M (2008). Genetic diversity and association analysis for salinity tolerance, heading date and plant height of barley germplasm using simple sequence repeat markers. Journal of Integrative Plant Biology. 50(8): 1005-1015.

Evanno G, Reganut E, Goudet J (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology. 14: 2611-2620.

Julio E, Verrier JL, Dorlhac de Borne F (2006). Development of SCAR markers linked to three disease resistances based on AFLP within Nicotiana tabacum L. Theoretical and Applied Genetics. 112: 335-346.

Gangkhanlou A, Mohammadi SA, Moghaddam M, Ghasemi Golazani K, Shakiba M, Yosefi A (2012). Genetic diversity in barley as revealed by microsatellite markers and association of these markers by traits related to freezing tolerance. Seed and Plant Improvement Journal. 28(1): 101-114.

Ghobadi ME, Nadian H, Bakhshandeh A, Fathi Gh, Gharineh MH, Ghobadi M (2006). Study of root growth, biological yield and grain yield of wheat genotypes under waterlogging stress during different growth stages. Seed and Plant Improvement Journal. 22(4): 513-527.

Gupta PK, Rustgi S, Kulwal PL (2005). Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: Present status and future prospects. Plant Molecular Biology. 57: 461-485.

Gomez C, Alvarez M, Mosquera T (2011). Association mapping, a method to detect quantitative trait loci: statistical bases. Agronomia Colombiana. 29(3): 367-376.

Hajabbasi MA (2001). Tillage effects on soil compactness and wheat root morphology. J. Agric. Science and Technology. 3: 67-77.

Malekahmadi F, Kalantari KhM, Torkzadeh M (2005). The effect of flooding stress on induction of oxidative stress and concentration of mineral element in pepper (Caosicum annum) plants. Iranian Journal of Biology. 18 (2): 110-119.

Mezaka L, Bleidere M, Legzdina L, Rostoks N (2011). Whole genome association mapping identifies naked grain locus NUD as determinant of β-glucan content in barley. Zemdirbyste-Agriculture. 98(3): 283-292.

Pritchard JK, Stephens M, Rosenberg NA, Donnelly P (2000). Association mapping in structured populations. The American Society of Human Genetics. 67: 170-181.

Roldain-Ruiz I, Calsyn E, Gilliand TJ, Coll R, Van Eijk MJT, De Loose M (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties, 2 AFLP charscterization. Molecular Breeding. 6: 593-602.

Roy JK, Bandopadhyay R, Rustgi S, Balyan SH, Gupta PK (2006). Association analysis of agronomically important traits using SSR, SAMPL and AFLP markers in bread wheat. Current Science. 5: 683-689.

Roy JK, Smith KP, Muehlbauer GJ, Chao S, Close TJ, Steffenson BJ (2010). Association mapping of spot blotch resistance in wild barley. Molecular Breeding. 26: 243-256.

Saghai Maroof, MA, Biyashev RM, Yang GP, Zhang Q, Allard RW (1994). Extraordinarily polymorphic microsatillate DNA in barely species diversity, choromosomal location, and population dynamics, Proceeding of the National Academy of Sceinces. USA. 91: 5466-5570.

Schenk MK, Barber SA (1979). Root characteristics of corn genotypes as related to P Uptake. Agronomy Journal. 71: 921-927.

Shannon CE, Weaver W (1963). The mathematical theory of communication. University of Illinois Press, Urbana, Ill.

Spataro G, Tiranti B, Arcaleni P, Bellucci E, Attene G, Papa R, Spagnoletti Zeuli P, Negri V (2011). Genetic diversity and structure of a worldwide collection of Phaseolus coccineus L. Theoretical and Applied Genetics. 122: 1281-1291.

Thomas W (2002). Molecular marker-assisted versus conven- tional selection in barley breeding. In: Slafer G, Molina- Cano JL, Savin R, Araus JL, Ramagosa I (eds) Barley science: recent advances from molecular biology to agronomy of yield and quality. Food Products Press, New York, pp 177–203.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee TVD, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 4407-4414.

Yang X, Yan J, Shah T, Warburton ML, Li Q, Li L, Gao Y, Chai Y, Fu Z, Zhou Y, Xu S, Bai G, Meng Y, Zheng Y, Li J ( 2010). Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection. Theoretical and Applied Genetics.

Yeh FC, Yang RC, Boyle TJB, Ye ZH, Mao JX (1997). POPGENE, The user-friendly shareware for population genetic analysis. Edmonton, Molecular Biology and Biotechnology Center, University of Alberta, Canada.

Zhang HY, Liu XZ, Li TS, Yang YM (2006). Genetic diversity among flue-culerd tobacco (Nicotiana tabacum L.) revealed by amplified fragment length polymorphism. Botanical Studies. 47: 223-229.

Identification of AFLP markers related to tolerance to flooding stress in barley

Heydari R.¹, Sabouri A.*¹, Sabouri H.², Fallahi H.A.³, Dadras A.R.⁴

¹ MSc student of Plant Breeding and Assistant professor of Department of Agronomy & Plant Breeding, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran.

² Associate professor Department of Plant Production, College of Agriculture and Natural Resources, Gonbad Kavous University., Golestan, Iran.

³ Assistant professor of Agriculture Research Center of Golestan-Agric. Res. Golestan, Iran.

⁴ PhD student of Plant Breeding of Department of Agronomy & Plant Breeding, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran.

Abstract

According to the importance of studies of abiotic stress, present study was done in order to identify of molecular markers with significant association to flooding stress tolerance in barley. This study carried out using of AFLP markers and 40 barley genotypes. Generally 22 variables in both normal and flooded, eight characters including shoot dry weight, length, volume, wet weight, dry weight, leaf area, root diameter and density tolerance was assessed with six indicators (SSI, STI, GMP, TOL, YI and YSI). Seven primer combinations of EcoRI and MseI a total of 245 bands were produced, of which, 227 bands were polymorphic and had an average of 92.37 percent polymorphism. Three combinations E90-M160, E100-M160 and E90-M150 had higher values of genetic variation compared to other combinations and were more effective in distinguish of genotypes. Association analysis was performed using structure matrix and statistical models of GLM and MLM by using of TASSEL software for 22 variables. The MLM model in 5 percent probability level identified 87 markers related to evaluated traits. According to the results of association analysis in normal condition the highest of coefficient of determination was for E100M16027 with explanation of 32 percent of root diameter variation and for tolerance indices and stress condition the highest coefficient of determination were for E80M1501 and E100M15022 with 24 percent explanation of variation of GMP index and shoot dry weight respectively.

Keywords: Assosiation analysis, Population structure, Flooding stress, AFLP Markers.

* نویسنده مسئول: عاطفه صبوری تلفن: 09113411496 E-mail: a.sabouri@guilan.ac.ir

[1] . Taproot length

[2] . Root volume

[3] . Root fresh weight

[4] . Root dry weight

[5] . Root area

[6] . Root diameter

[7] . Root surface area density

[8]. General Linear Model.

[9] . Mixed Linear Model.

* Corresponding Author: Sabouri A. Tel: 09113411496 E-mail: a.sabouri@guilan.ac.ir

مراجع