الگوی بیان ژن های OSBP، CAT و BZIP در ارقام حساس و متحمل به خشکی سویا با استفاده از PCR در زمان واقعی

احمدی, جعفر; سلیمانی, ولی اله

doi:10.22103/jab.2014.1323

تعداد نشریات	26
تعداد شماره‌ها	447
تعداد مقالات	4,557
تعداد مشاهده مقاله	5,379,992
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	3,580,057

الگوی بیان ژن های OSBP، CAT و BZIP در ارقام حساس و متحمل به خشکی سویا با استفاده از PCR در زمان واقعی

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 1، دوره 6، شماره 3، آذر 1393، صفحه 1-16 اصل مقاله (354.73 K)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2014.1323

نویسندگان

جعفر احمدی؛ ولی اله سلیمانی

چکیده

در شرایط تنش خشکی، سیستم ‏علامت دهنده موجب القای ژن‏های مشخصی در مقابل اثرات زیان‏آور تنش‏های محیطی می‏شود. ژن BZIP از فاکتورهای رونویسی در سیگنالرسانی تنشهای غیرزنده بوده و در تنظیم پاسخ به تنشهای مختلف در گیاهان نقش دارد. این ژن با ABA فعال شده و باعث بسته شدن روزنهها می‌شود. ژن OSBP دارای نقش کلیدی در سیگنالدهی برخی واکنشهای فیزیولوژیکی در پاسخ به تنش میباشد. کاتالاز (CAT) از سری آنزیمهای احیاکننده است که تبدیل پراکسید هیدروژن به آب و مولکول اکسیژن را کاتالیز و از سلول در برابر اثرات سمی پراکسید هیدروژن حمایت میکند. در این تحقیق دو رقم سویا Williams (متحمل) و L17 (حساس) در شرایط گلخانهای کشت شدند. تیمار تنش خشکی از مرحله دو برگی به مدت 7 روز اعمال شد. استخراج RNA کل از برگ و ریشه در دو سطح شاهد و تنش صورت گرفت و سپس ساخت cDNA جهت استفاده در Real Time PCR انجام شد. از ژن خانهدار 18SrRNA برای نرمال کردن دادهها استفاده شد. تجزیه دادهها با استفاده از منحنیهای Ct نشان دهنده افزایش بیان ژن BZIP در تنش خشکی بود و این افزایش در رقم متحمل Williams حدود دو برابر رقم حساس L17 و در ریشه بیشتر از برگ بود. اختلاف بیان ژن OSBP تحت تنش خشکی بین دو رقم Williams و L17 معنیدار نگردید. بیان ژن کاتالاز در تنش خشکی در رقم Williams حدود دو برابر رقم L17 و همچنین در ریشه بیشتر از برگ بود. با توجه به اینکه افزایش بیان این ژنها منجر به افزایش تحمل خشکی میشود، انتقال این ژنها در راستای افزایش تحمل به خشکی در ژنوتیپهای پرعملکرد سویا مناسب و موثر ارزیابی گردید.

کلیدواژه‌ها

QRT-PCR؛ تنش؛ OSBP؛ CAT؛ BZIP؛ سویا

اصل مقاله

الگوی بیان ژنهای OSBP، CAT و BZIP در ارقام حساس و متحمل به خشکی سویا با استفاده از PCR در زمان واقعی

جعفر احمدی*¹، ولی اله سلیمانی²

¹ دانشیار، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران.

² کارشناس ارشد، آزمایشگاه ژنومیکس دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران.

تاریخ دریافت: 13/03/1392، تاریخ پذیرش: 10/07/1392

چکیده

کلمات کلیدی: qRT-PCR، تنش، OSBP، CAT، BZIP، سویا

مقدمه

تنش خشکی از محدودیتهای اساسی بهرهوری و عملکرد محصول و تنش عمده محیط زیست در کشاورزی جهان است (Ashraf, 2009; Cattivelli et al., 2007; Ashraf et al., 2011). کمبود آب میتواند بر جنبههای گوناگون فرآیندهای فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مورفولوژیکی گیاه سویا تاثیر منفی بگذارد و این به نوبه خود بر گرهبندی، تثبیت نیتروژن، رشد و عملکرد سویا اثر گذار بوده و منجر به کاهش رشد و عملکرد محصول میشود (Ashraf et al., 2011). بنابراین، بهبود ژنتیکی برای تحمل خشکی یکی از راهکارهای اقتصادی برای افزایش ثبات در تولید محصولات از جمله سویا است (Nevo and Chen, 2010). در شرایط پسابیدگی گیاهان پس از بروز تنش در سطح مولکولی، سیستم ‏علامت دهنده موجب القای ژن‏های مشخصی در مقابل اثرات زیان‏آور تنش‏های محیطی می‏شود که محصولات برخی از این ژن‏ها در محافظت از گیاه شرکت کرده و موجب حفظ ساختار سلولی می‏شوند (Bartels and Sunkars, 2005; Suprunova et al., 2004). بدین لحاظ گیاهان از طریق فرآیندهای فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و سلولی و مولکولی به این تنشها پاسخ داده و خود را با شرایط محیطی منطبق و یا متحمل میسازند(Thomashow, 1999; Bray et al., 2000; Shinozaki et al., 2003) به محض بروز تغییرات درون سلولی، مسیرهای پیام رسانی[1] مختلفی به منظور تبدیل تنش فیزیکی به یک پاسخ بیوشیمیایی مناسب شروع شده و هر یک از آنها بیان دستهای از ژنهای پاسخ دهنده به تنش را سبب میشوند (Xiong & Zhu, 2001; Leonardis et al., 2007) فرآوردههای این ژنها نه تنها در حفاظت سلول از تنش عمل مینمایند، بلکه در تنظیم ژنهای درگیر در پیام رسانی پاسخ به تنش نیز وارد عمل میشوند .(Maruyama et al., 2004) فرآوردههای این ژنها را میتوان براساس نوع عملکرد آنها به دو گروه طبقهبندی نمود. گروه اول شامل پروتئینهایی نظیر چاپرونها، پروتئینهای کانال آبی، پروتئینهای اواخر دوره جینینزایی[2](LEA)، آنزیمهای بیوسنتز اسمولیتها، آنزیمهای سمزدایی و آنزیمهای تغییر دهندهی لیپیدهای غشایی است که در تحمل به تنش نقش دارند. گروه دوم شامل عوامل پروتئینی درگیر در تنظیم بیان ژن و پیام رسانی در پاسخ به تنش غیرزنده میباشند که از این دسته میتوان کینازها، آنزیمهای درگیر در متابولیسم فسفولیپیدها و عوامل رونویسی[3] (TF) را نام برد (Yamaguchi and Shinozaki, 2005; Maruyama et al., 2004) عوامل رونویسی، پروتئینهایی (trans acting) هستند که بیان ژن را از طریق اتصال به توالیهای خاصی از DNA (cis acting) واقع در ناحیه پروموتر ژنهای هدف، آنها را تقویت یا باز میدارند. ژنهای عوامل رونویسی، بخش قابل توجهی از ژنومهای همه یوکاریوتها و از جمله گیاهان آلی را تشکیل میدهند (Riechmann et al., 2000) مشخص شده است که در گیاهان، یک عامل رونویسی میتواند بیان بسیاری از ژنها را از طریق اتصال اختصاصی به عنصر cis-acting در ناحیه پروموتر ژنهای هدف، کنترل کند (Nakashima and Shinozaki, 2005). خانوادههای زیادی از این عوامل، تحت تأثیر تنش قرار میگیرند که از جمله مهمترین آنها، پروتئینهای (Uno et al., 2000) BZIP، WRKY (Martin and Paz-Ares, 1997)، DREB (Sakuma et al., 2006)، NAC (Xue et al., 2006)، MYC و MYB (Yamaguchi and Shinozaki, 2005) را میتوان نام برد.

ژن BZIP از فاکتورهای رونویسی در سیگنالرسانی تنشهای غیرزنده بوده و در تنظیم پاسخ به تنشهای مختلف در گیاهان نقش دارد. این ژن با ABA فعال شده و باعث بسته شدن روزنهها میشود، لذا افزایش بیان این ژن منجر به افزایش تحمل به تنش خشکی میشود. در مطالعهای انتقال عامل رونویسی BZIP جدا شده از Poncirus trifoliata به توتون و تنباکو باعث افزایش بیان ژن PtrABF تحت تنش خشکی نسبت به نوع وحشی گردید، بطوری که این ژن از طریق مهار گونههای فعال اکسیژن[4] (ROS) و بیان ژنهای پاسخ به تنش و آنزیمهای آنتی اکسیدانت در سطوح بالا، تحمل کم آبی در توتون و تنباکو را افزایش داد (Huang et al., 2010). در مطالعهای با تکنیک لکهگذاری سادرن مشخص شد که تنها یک نسخه از BZIP در ژنوم سویا موجود است (Gao et al., 2011). تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی نشان داد که GmBZIP1 متعلق به زیرخانوادههای AREB از خانواده BZIP است و بیشتر با AtABF2 و OsTRAB1 مرتبط است (Gao et al., 2011). بیان ژن GmBZIP1 به شدت توسط ABA، تنش خشکی، نمک بالا و دمای پایین القا شده و مشخص شده GmBZIP1 در ریشه، ساقه و برگ سویا تحت شرایط تنشهای مختلف مذکور بیان می شود (Gao et al., 2011). آنزیم کاتالاز که هم در پروکاریوتها و هم در یوکاریوتها وجود دارد، در حفاظت سلولها از اثرات سمی پراکسید نقش داشته و باعث کاتالیز تبدیل پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن میشود. در آزمایشی با اعمال تنش خشکی بر گیاه سویا در مرحله گلدهی، نتیجه گرفتند که میزان بیان ژن کاتالاز افزایش یافت، همچنین میزان کلروفیل برگ با میزان بیان ژن کاتالاز همبستگی منفی و معنیداری نشان داد (Mazandarani et al., 2012). ژن OSBP نقش کلیدی در سیگنالدهی در برخی واکنشهای فیزیولوژیک برای پاسخ به تنش دارد. طبق بررسیها، ژن GmOSBP ممکن است در برخی از واکنشهای فیزیولوژیکی برای پاسخ به تنش در سویا درگیر و نقش داشته باشد. در آزمایشی پس از 6 ساعت از شروع تنش شوری با کلرید سدیم 300 میلی مولار به گیاهچه سویا، مشاهده کردند که بیان ژن OSBP در ریشه و ساقه به طور قابل ملاحظهای افزایش یافت، در حالی که بعد از 24 ساعت سطح بیان در ساقه بیشتر از ریشه بود. همچنین بیان ژن OSBP در برگ بسیار افزایش نشان داد (Li et al., 2007).

هدف از این تحقیق، بررسی الگوی بیان سه ژن OSBP، CAT و BZIP در شرایط تنش خشکی در گیاهچه سویا با استفاده از PCR در زمان واقعی بود.

مواد و روشها

بذور رقم Williams (متحمل به خشکی) و لاین L17 (حساس به خشکی) از موسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه گردید. بذور تحت شرایط دمایی 2± 30 درجه سانتیگراد و 16 ساعت روشنایی و 2± 20 درجه سانتیگراد و 8 ساعت تاریکی در دو سطح نرمال و تنش خشکی، در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) کشت گردید. مدت زمان اعمال تنش خشکی از مرحله دو برگی به مدت 7 روز بود و با مشاهده لولهای شدن برگها در روز هفتم، جهت بررسی الگوی بیان ژنهای OSBP، CAT و BZIP از اندام برگ و ریشه نمونهبرداری صورت گرفت. پس از جمع آوری نمونهها بلافاصله آنها را در نیتروژن مایع قرار داده و برای استخراج RNA کل در مرحله بعد، در دمای 80- نگهداری شدند.

جهت سنجش محتوی آب نسبی برگ، نمونه برگ در هر تکرار برداشت و بلافاصله وزن تر برگ‏ها اندازهگیری شد. به منظور تعیین وزن تورژسانسی، برگها به مدت 12 ساعت در شدت نور کم (برای آنکه کاهش وزنی در اثر فعالیت تنفسی رخ ندهد) در داخل آب مقطر قرار داده شدند و پس از اندازهگیری وزن برگها در این شرایط، برگها به مدت 48 ساعت در آون 70 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و وزن خشک آن‏ها اندازهگیری شد. مقدار RWC از رابطه زیر بدست آمد. در این رابطه Wf وزن تازه برگ، Wt وزن تورژسانس برگ و Wd وزن خشک برگ می‏باشد (Ritchie and Nguyen, 1990).

%RWC = [(Wf – Wd) / (Wt – Wd)] ´100

با استفاده از کیت استخراج RNX-Plus Solution (شرکت سیناکلون)، RNA استخراج و جهت تعیین غلظت RNA با استفاده از نانودراپ (NanoDrop 1000 spectrophotometer) جذب هر نمونه در طول موج 230، 260 و 280 نانومتر خوانده شد. برای حذف DNA ژنومی و سنتز رشته اول cDNA از کیت (Quanti Tect, Reverse Transcription Kit, Cat. No. 205311) کمپانی کیاژن استفاده گردید. برای حذف DNA ژنومی ابتدا یک میکروگرم از محلول RNA کل به درون یک میکروتیوب ml2/0 DEPC و اتوکلاو شده اضافه شد. این مرحله با استفاده از ترکیب (gDNA Wipeout µl2، Template RNA µg1 و رسانیدن حجم نهائی به µl14 (با RNAas-free water) انجام شد. سپس تیوبها به مدت 2 دقیقه در بنماری در دمای 42 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. در ادامه مخلوط واکنش لازم برای مرحله رونویسی معکوس به صورت ترکیب (Quantiscript Reverse Transcriptase µl1، Quantiscript RT Buffer 5x µl4، RT Primer mix µl1) تهیه شد. سپس RNA الگو از مرحله حذف DNA ژنومی (با حجم 14 میکرولیتر) به هر تیوب که شامل مخلوط واکنش رونویسی معکوس بود، اضافه شد تا به حجم نهایی 20 میکرولیتر رسید. تیوبها به مدت 15 دقیقه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد و بعد به مدت 3 دقیقه در بن ماری 95 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. برای انجام PCR در زمان واقعی از cDNA تهیه شده به عنوان استوک 10 برابر رقیق شده، تهیه شد. واکنش Real time PCR با استفاده از کیت ] , Bulk. Cod. RR820L(Tli RNaseH Plus) SYBR [Premix Ex TagII کمپانی تک آرا و با استفاده از دستگاه RT-PCR BIO-RAD- مدل CFD-3120 ساخت کشور آمریکا انجام گردید. از ژن خانهدار 18SrRNA برای نرمال کردن دادهها استفاده شد.

توالی آغازگرها با استفاده از نرم افزار SoftBerry و Primer designing tool به صورت جدول 1 طراحی شدند. آغازگرها جهت سنتز به شرکت سیناکلون (سیناژن)، سفارش داده شد. به منظور اطمینان از کارایی و عملکرد اختصاصی آغازگرها، واکنش PCR انجام شد. نهایتاً واکنش PCR در زمان واقعی در دو اندام ریشه و برگ در 2 تکرار تکنیکی و با استفاده از تکنیک سایبرگرین انجام گردید. واکنش PCR در زمان واقعی با استفاده از کیت , Bulk. Cod. RR820L](Tli RNaseH Plus) Ex TagII SYBR [Premix به شرح زیر انجام گرفت. برای هر واکنش PCR، سایبرگرین به مقدار 10 میکرولیتر، آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت 10 پیکومول از هر یک به مقدار 5/0 میکرولیتر، cDNA رقیق شده به مقدار2 میکرولیتر و در نهایت با آب استریل و دوبار تقطیر شده به حجم 20 میکرولیتر رسانده شد. به منظور اجتناب از بروز هر گونه اختلاف در تهیه واکنش بین تیمارهای مختلف، همواره محلول مادری با حجم متناسب با تعداد واکنشها تهیه شد و در چاهکهای پلیت مخصوص PCR در زمان واقعی تقسیم گردید و بعد از اضافه کردن cDNA از تیمارهای مختلف به آنها، روی پلیت با چسب شفاف مخصوص پوشانده شد. پس از آن پلیت با استفاده از میکروسانتریفیوژ مدل Lab Net ساخت کره، رسوب داده شده و در دستگاه PCR در زمان واقعی قرار گرفت.

جدول1- مشخصات آغازگرهای استفاده شده جهت qRT-PCR.

Table 1- List of primers used for qRT-PCR.

اندازه قطعه Fragment Size (bp)	تعداد نوکلئوتید Number of nucleotide	توالی آغازگر ( َ3 َ5) Primer Sequence	نام آغازگر Primer Name
120	20	CAGTGGCGAGGCGCGGGGCC	GM-BZIP F
120	20	GAACCTCTCGAACTCGTTGT	GM-BZIP R
130	20	GTCAACCATCGCCGCAAGCC	OSBP F
130	20	CCATGCCACTCGATCCTCCC	OSBP R
188	21	GCCAACCACAGCCATGCCACT	CAT F
188	21	AGGACCAAGCGACCAACAGGC	CAT R
148	19	TTTCGTCTACGTCGCATTT	18SrRNA F
148	19	CGTGGAGCAAGTCGTGTAA	18SrRNA R

واکنش PCR با واسرشت سازی اولیه در دمای ^oC 94 و به مدت 3 دقیقه آغاز و با 40 چرخه دو مرحلهای واسرشتسازی در دمای ^oC 94 به مدت 10 ثانیه، اتصال آغازگر و طویل شدن رشته در دمای ^oC 60 به مدت 50 ثانیه ادامه یافت. در نهایت به منظور رسم منحنی ذوب میزان دما از 50 درجه سانتیگراد طی 90 چرخهی 10 ثانیهای به 95 درجه سانتیگراد رسید. سپس میزان بیان ژن با روش تصحیح کارایی ΔΔCt[5](Pfaffi, 2001) محاسبه شد. داده‌های حاصل با استفاده از داده‏های ژن خانه‏دار 18SrRNA به عنوان کنترل داخلی نرمال شده و سپس میزان تغییرات بیان ژن در تنش‏های مختلف نسبت به شاهد سنجیده شد. پس از بدست آوردن حد آستانه (CT) مربوط به هر ژنوتیپ بیان‌های مربوط به هر نمونه محاسبه گردید. پس از اطمینان از نرمال بودن دادهها، تجزیه واریانس و مقایسه میانگینها به روش دانکن با استفاده از نرم افزارSPSS انجام گرفت. میزان همبستگی بین میزان بیان ژنها نیز به کمک نرم افزار SPSS محاسبه شد. در نهایت رسم نمودارها با نرم افزار EXCEL انجام گرفت.

نتایج و بحث

اثر تنش خشکی بر روابط آبی گیاه

نتایج تجزیه واریانس محتوای نسبی آب برگ[6] (RWC)، نشان داد، که میزان RWC بین دو رقم Williams و L17 بعد از 7 روز تنش خشکی در سطح 5% اختلاف معنی‏داری دارند. در شرایط تنش رقم Williams محتوای نسبی آب برگ (70 درصد) خود را در سطح بالاتری نسبت به ژنوتیپ L17 (68 درصد) نگه داشت و از این لحاظ محتملتر بودن این رقم نسبت به لاین L17 در برابر تنش خشکی منطقی بود. RWC در واقع به عنوان شاخصی برای نشان دادن آسیب‏های ناشی از تنش خشکی معرفی شده است (Farooq et al., 2009) و ارتباط مستقیم و معنی‏داری بین شاخص RWC با میزان عملکرد گندم تحت تنش خشکی در شرایط گلخانه‏ای گزارش شده است (Khakwani et al., 2011)، لذا از این صفت می‏توان به عنوان یکی از بهترین شاخص‏های ترازمندی آب در گیاه جهت گزینش ژنوتیپ‏ها در شرایط تنش بهره برد (Vaezi et al., 2010). نتایج بدست آمده از این تحقیق با نتایج گزارش‏های اخیر در مورد کاهش محتوای نسبی آب برگ در شرایط تنش مطابقت دارد (Dedio, 1975; Altinkut et al., 2001; Vaezi et al., 2010 ) همچنین نتایج مطالعات والنتوویچ و همکاران (Valentovic et al., 2006) بر روی دو رقم حساس و متحمل ذرت نشان داد که رقم متحمل قدرت حفظ آب بیشتری در مقایسه با رقم حساس به خشکی دارا می‏باشد.

استخراج RNA از برگ و ریشه ژنوتیپ‏های Williams و L17 انجام گرفت و بعد از غلظت‏سنجی نمونه‏های RNA با دستگاه نانودراپ، کیفیت نمونه‏ها با ژل آگارز 5/1 درصد مورد بررسی قرار گرفت (شکل1). وجود احتمالی آلودگی DNA ژنومی در نمونه‏های RNA استخراج شده در انجام واکنش PCR در زمان واقعی اختلال ایجاد می‏کند، زیرا آنزیم DNA- پلیمراز می‏تواند DNA ژنومی را نیز علاوه بر محصول رونویسی معکوس الگو قرار داده و تکثیر نماید. لذا حذف آلودگی DNA ژنومی به وسیله تیمار نمونه‏ها با آنزیم DNaseI انجام گرفت. سپس سنتز cDNA انجام شده و برای مقایسه الگوی بیان ژن‏های مورد نظر مورد استفاده قرار گرفت.

5 4 3 2 1

1000

500

1500

18S

28S

شکل1- تصویر الکتروفورز ژل آگارز 5/1% برای کیفیت RNA استخراج شده. 1: خط کش وزن مولکولی DNA، Kb1؛ 4: RNA برگ و 5: RNA ریشه.

Figure 1- Image of %1.5 agarose gel electrophoresis for the quality of extracted RNA.

تجزیه واریانس داده‌های مربوط به میزان بیان ژن BZIP (جدول2) اختلاف معنی‌داری را در سطح احتمال 01/0≥P در منابع تغییر ژنوتیپ، اندام، تنش، ژنوتیپ × تنش، اندام × تنش و ژنوتیپ × اندام × تنش نشان داد. اما اثر متقابل ژنوتیپ × اندام اختلاف معنی‌داری را نشان نداد. معنیدار بودن اثر متقابل ژنوتیپ × تنش و اندام × تنش دلالت بر عدم پاسخ یکسان دو ژنوتیپ Williams و L17 و نیز دو اندام برگ و ریشه نسبت به شرایط تنش خشکی دارد. مقایسه میانگین بیان نسبی ژن BZIP در دو رقم Williams و L17 (شکل 2-a) نشان داد که در مجموع دو شرایط تنش و عدم تنش میزان بیان این ژن در رقم Williams با مقدار برابر با 099/3 بیشتر از لاین L17 (946/1) میباشد و اختلاف در سطح احتمال 01/0≥P بین دو رقم معنیدار بود.

جدول2- تجزیه واریانس میزان بیان ژنهای BZIP, CAT, OSBP در شرایط تنش خشکی مربوط به دو اندام ریشه و برگ در دو رقم Williams (متحمل) و L17 (حساس) سویا.

Table 2- Variance analysis of the expression OSBP, CAT and BZIP genes in drought condition for root and leaf in two soybean cultivars Williams (tolerant) and L17 (susceptible).

منابع تغییر Source of Variation			میانگین مربعات Mean Square
منابع تغییر Source of Variation	درجه آزادی Degree of freedom	BZIP		CAT	OSBP
ژنوتیپ (Genotype)	1	5.322**		0.778**	0.023^ns
اندام (Organs)	1	2.081**		15.224**	^ns 0.005
تنش (Stress)	1	33.942**		55.149**	32.234**
ژنوتیپ × اندام (Genotype×Organs)	1	^ns 0.103		3.813**	33.843**
ژنوتیپ × تنش (Genotype×Stress)	1	5.719**		6.122**	^ns 0.027
اندام × تنش (Organs×Stress)	1	2.053**		15.573**	^ns 0.004
ژنوتیپ × اندام× تنش (Gen.×Org.×Str.) (Genotype × Organs × Stress )	1	** 1.095		3.718**	33.588**
خطا (Error)	8	0.052		0.047	0.083
C.V%		9.06		7.50	11.66

^ns و** : به ترتیب نشان دهنده غیرمعنی‏دار و معنی‏دار در سطح احتمال یک درصد می‏باشد.

میانگین بیان نسبی این ژن در دو اندام برگ و ریشه (شکل 2-b) مقایسه شد و مشخص شد که بیان این ژن در اندام ریشه بیشتر از برگ بوده و اختلاف بیان ژن بین ریشه (گروه a) و برگ (گروه b) در سطح احتمال 01/0≥P معنیدار شد. همان طوری که از نتایج مشخص است (شکل 2-c) در مجموع اندامها و هر دو رقم میزان بیان نسبی ژن BZIP در سطح تنش خشکی چهار برابر سطح بدون تنش افزایش داشته است و در سطح احتمال یک درصد اختلاف معنیدار بود. با توجه به نتایج مقایسه میانگین دانکن (شکل 2-d) برای اثر متقابل رقم × تنش، میزان بیان نسبی ژن BZIP در شرایط تنش خشکی در رقم Williams دو برابر لاین L17 بود. بطوری که بیان ژن رقم Williams در گروه a و لاین L17 در گروه b قرار گرفت، در حالی که در شرایط بدون تنش میزان بیان ژن بین دو رقم تقریباً برابر بوده و در یک گروه آماری (گروه c) قرار گرفتند. در مقایسه میانگین اثر متقابل تنش × اندام (شکل 1-e) در شرایط تنش خشکی میزان بیان ژن BZIP در هر دو اندام ریشه و برگ نسبت به شرایط نرمال افزایش نشان داد و اندام ریشه و برگ تحت تنش نسبت به شرایط نرمال به ترتیب با بیشترین مقدار بیان به ترتیب در گروه a و b قرار گرفتند. در حالی که در شرایط نرمال میزان بیان ژن در هر دو اندام تقریباً برابر بود. بر اساس مقایسه میانگین اثر متقابل ژنوتیپ × اندام × تنش (شکل 1-f)، اندام ریشه رقم Williams در شرایط تنش دارای بالاترین (گروه a) میزان بیان ژن BZIP بوده و پس از آن بیان ژن اندام برگ رقم Williams در شرایط تنش در گروه دوم (b) قرار گرفت. با توجه به افزایش بیان ژن BZIP در تنش خشکی در رقم متحمل Williams نسبت به رقم حساس L17 (دو برابر) و نیز افزایش بیان در اندام ریشه نسبت به برگ، نتایج این تحقیق با نتایج هوانگ و همکاران (2010) در مطالعه بر روی توتون و تنباکوی تراریخت با ژن BZIP که در تنش خشکی افزایش بیان داشت و نیز با نتایج گائو و همکاران (2011) که GmBZIP به شدت توسط ABA، تنشهای خشکی، نمک بالا و دمای پایین القا شده و نیز در ریشه، ساقه و برگ تحت شرایط تنشهای مذکور افزایش بیان داشت، مطابقت دارد. نتایج تجزیه واریانس ژن کاتالاز در جدول (2) ارائه شده است و همانطور که مشاهده میشود هم اثرات اصلی و هم اثرات متقابل دوگانه و سه گانه این ژن در سطح احتمال 01/0≥P معنیدار شد. بر اساس مقایسه میانگینها، در مجموع دو شرایط تنش و عدم تنش بیان ژن کاتالاز در رقم Williams نسبت به لاین L17 بیشتر بوده و در دو گروه آماری مختلف قرار گرفتند (شکل 3-a). مقایسه میانگین بیان ژن کاتالاز در دو اندام برگ و ریشه (شکل 3-b) در سطح احتمال یک درصد معنیدار شد به طوری که در اندام ریشه نسبت به برگ افزایش بیان دو برابر بود.

همچنین در مجموع اندامها و ارقام در سطح تنش خشکی نسبت به سطح نرمال، ژن کاتالاز حدوداً 5/4 برابر افزایش بیان نشان داد (شکل 3-c). با معنیداری اثر متقابل رقم × اندام و مقایسه میانگین بیان ژن کاتالاز، سه کلاس a، b و c بدست آمد (شکل 3-d). بیان این ژن در مجموع دو شرایط تنش و عدم تنش در ریشه رقم Williams نسبت به لاین L17 افزایش بیشتری یافته و در کلاس a قرار گرفت و این افزایش بیان حدود بیش از دو برابر نسبت به اندام برگ رقم Williams بود. در حالی که افزایش بیان این ژن در ریشه لاین L17 نسبت به برگ کمتر بوده و در کلاس b قرار گرفت. در مقایسه میانگین اثر متقابل ژنوتیپ × تنش سه کلاس a، b و c بدست آمد (شکل 3-e). در این مقایسه میزان بیان نسبی ژن کاتالاز در تنش خشکی در رقم Williams (گروه a)، 5/1 برابر بیشتر از رقم L17 (گروه b) مشاهده گردید. در حالی که در شرایط بدون تنش هر دو رقم بیان حدوداً یکسانی نشان داده و در گروه آماری c قرار گرفتند. مقایسه میانگین اثر متقابل تنش × اندام (شکل 3-f) در مجموع دو رقم نشان داد که اندام ریشه نسبت به برگ افزایش بیان 5/2 برابری با مقدار 705/6 در ریشه نسبت به برگ در شرایط تنش داشته و در کلاس a قرار گرفت و اندام برگ با مقدار 781/2 در کلاس b قرار گرفت. در صورتی که بیان این ژن در شرایط بدون تنش در ریشه و برگ یکسان بوده و در کلاس c قرار گرفتند. مقایسه میانگین اثر متقابل رقم × اندام × تنش در سطح احتمال یک درصد انجام شد (شکل 3-g) و چهار کلاس بدست آمد. افزایش بیان در ریشه رقم Williams در شرایط تنش دو برابر ریشه رقم L17 بوده و در کلاس a و میزان بیان در ریشه L17 در کلاس b قرار گرفت. همچنین افزایش بیان تحت تنش خشکی در برگ رقم Williams بیشتر از لاین L17 بود، ولیکن هر دو بدون اختلاف آماری معنیدار در گروه c قرار گرفتند. نتایج حاصل از این آزمایش با نتایج مازندرانی و همکاران در سال 2012 که تنش خشکی باعث افزایش فعالیت کاتالاز در سویا شده بود، مطابقت دارد. تجزیه واریانس ژن OSBP در آزمایش تنش خشکی در جدول (2) ارائه شده است و همانطور که مشاهده می شود فقط اثر اصلی تنش و اثرات متقابل ژنوتیپ × اندام و ژنوتیپ × اندام × تنش در سطح احتمال 01/0≥P معنیدار شد. بر این اساس مقایسه میانگینها انجام رفت. نتایج حاصل از میزان بیان ژن OSBP در مجموع ارقام و اندامها نشان داد که در شرایط تنش خشکی افزایش بیان حدوداً چهار برابر شرایط بدون تنش (شکل 4-a) بود. در مقایسه میانگین بیان ژن OSBP برای اثر متقابل رقم × اندام (شکل 4-b)، اندام ریشه لاین L17 چهار برابر اندام ریشه رقم Williams و برعکس اندام برگ رقم Williams نسبت به لاین L17 چهار برابر بیان داشتند.

در مقایسه میانگین اثر متقابل سه گانه ژنوتیپ × اندام × تنش خشکی دو کلاس بدست آمد (شکل 4-c)، به طوری که کلاس a مربوط به مقدار بیان یکسان برگ رقم Williams و ریشه رقم L17 در شرایط تنش خشکی بود. در این شرایط میزان بیان ژن OSBP در برگ رقم Williams تقریباً با مقدار بیان این ژن در ریشه رقم L17 برابری داشت. در توافق با نتایج این آزمایش، لی و همکاران (2007) نیز در آزمایش تنش شوری بر روی گیاهچه سویا گزارش کردهاند که بیان ژن OSBP در ریشه و برگ به طور قابل ملاحظهای افزایش یافت.

سپاسگزاری

هزینه اجرای این تحقیق از محل اعتبارات طرحهای پژوهشی دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) با شماره طرح 11446 پرداخت شده است که بدینوسیله تشکرو قدردانی میگردد.

شکل2- مقایسه میزان بیان ژن BZIP در (a) دو رقم Williams و L17 ، (b) دو اندام ریشه و برگ، (c) دو سطح تنش و عدم تنش خشکی، (d) اثر متقابل ژنوتیپ × تنش، (e) اثر متقابل اندام × تنش و (f) اثر متقابل ژنوتیپ × اندام × تنش.

Figure 2- The comparison of BZIP gene expression in (a) two cultivars Williams and L17, (b) two organs root and leaf, (c) stress and non-drought stress, (d) genotype × stress, (e) stress × organs, (f) genotype × organs × stress.

شکل3- مقایسه میزان بیان ژن کاتالاز (CAT) در (a) دو رقم Williams و L17 ، (b) دو اندام ریشه و برگ، (c) دو سطح تنش و عدم تنش خشکی، (d) اثر متقابل ژنوتیپ × اندام، (e) اثر متقابل ژنوتیپ × تنش، (f) اثر متقابل اندام × تنش و (g) اثر متقابل ژنوتیپ × اندام × تنش.

Figure 3- The comparison of CAT gene expression in (a) two cultivars Williams and L17, (b) two organs root and leaf, (c) stress and non-drought stress, (d) genotype × organs, (e) genotype × stress, (f) organs × stress, (g) genotype × organs × stress.

شکل4- میزان بیان ژن OSBP در (a) دو رقم Williams و L17 ، (b) اثر متقابل ژنوتیپ × اندام، (c) ژنوتیپ × اندام × تنش.

Figure 4- The OSBP gene expression in (a) two cultivars Williams and L17, (b) genotype × organs, (c) genotype × organs × stress.

منابع

Altinkut A, Kazan K, Ipekci Z, Gozukirmizi N (2001). Tolerance to paraquat is correlated with the traits associated with water stress tolerance in segregating F2 populations of barley and wheat. Euphytica 121: 81-86.

Ashraf M, Akram NA, Al-Qurainy F, Foolad MR (2011). Chapter five – Drought Tolerance: Roles of Organic Osmolytes, Growth Regulators, and Mineral Nutrients. Advances in Agronomy 111: 249-296.

Ashraf M (2009). Inducing drought tolerance in plants: Recent advances. Biotechnology Advances 28: 169-183.

Bartels D, Sunkars R (2005). Drought and salt tolerance in plants. Critical Reviews in Plant Science 24: 23–58.

Bray EA, Bailey-Serres J, Weretilnyk E (2000). Responses to abiotic stresses. In: Biochemistry and Molecular Biology of Plants (B. B. Buchanan, W. Gruissem, and R. L. Jones, eds) pp. 1158-1203.

Cattivelli L, Rizza F, Badeck FW, Mazzucotelli E, Mastrangelo AM, Francia E, Mare, Tondelli A, Stanca AM (2007). Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to genomics. Field Crops Research 105: 1-14.

Dedio W (1975). Water relations in wheat leaves as screening tests for drought resistance. Canadian Journal of Plant Science 55: 369-378.

Farooq MWA, Kobayashi N, Fujita D and Basra SM (2009). Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development 29: 185-212.

Gao SQ, Chen M, Xu ZS, Zhao CP, Li L, Xu HJ, Tang YM, Zhao X, Ma YZ (2011). The soybean GmbZIP1 transcription factor enhances multiple abiotic stress tolerances in transgenic plants. Plant Molecular Biology 75: 537-553.

Huang XS, Liu JH, Chen XJ (2010). Over expression of PtrABF gene, a bzip transcription factor isolated from Poncirus trifoliata, enhances dehydration and drought tolerance in tobacco via scavenging ROS and modulating expression of stress-responsive genes. BMC Plant Biology 10: 230.

Khakwani AA, Dennett MD, Munir M (2011). Drought tolerance screening of wheat varieties by inducing water stress conditions. Songklanakarin Journal of Science and Technology 33: 135-142.

Leonardis A M D, Marone D, Mazzucotelli E, Neffar F, Rizza F, Fonzo N D, Cattivelli L& Mastrangelo A M (2007). Durum wheat genes up-regulated in the early phases of cold stress are modulated by drought in a developmental and genotype dependent manner. Plant Science 172: 1005–1016.

Li DY, Inoue H, Takahashi M, Shiraiwa TK, Takahara H (2007). Molecular characterization of a novel salt-inducible gene for an OSBP (oxysterol-binding protein)-homologue from soybean. Gene 407: 12-20.

Martin C & Paz-Ares MYB (1997). Transcription factors in plants. Trends in Genetics 13: 67–73.

Maruyama K, Sakuma Y, Kasuga M, Ito Y, Seki M, Goda H, Shimada Y, Yoshida S, Shinozaki K & Yamaguchi-Shinozaki K (2004). Identification of cold-inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems. Plant Journal 38: 982–993.

Mazandarani A, Rahim Malek M, Navvabpur S, Ramazanpur SS (2012). Catalase gene expression under drought stress at flowering stage in soybean cultivars. 3^rd Iranian Agricultural Biotechnology Congress. Sept. 3-5, 2012. Ferdowsi University Mashhad, Iran. pp. 312.

Nakashima K & Yamaguchi-Shinozaki K (2005). Molecular studies on stress-responsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerance in crop plants by regulon biotechnology. Japan Agricultural Research Quarterly 39: 221–229.

Nevo E, Chen G (2010). Drought and salt tolerances in wild relatives for wheat and barley improvement. Plant Cell & Environment 33: 670-685.

Novillo F, Alonso JM, Ecker J R & Salinas J (2004). CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 3985–3990.

Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang C Z, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha R R & et al (2000). Arabidopsis transcription factors: Genome wide comparative analysis among eukaryotes. Science 290: 2105-2110.

Ritchie SW, and Nguyen HT (1990). Leaf water content and gas exchange parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Science 30: 105-111.

Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Qin F, Seki M, Shinozaki K & Yamaguchi-Shinozaki K (2006). Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor. DREB2A, involved in drought-responsive gene expression. Plant Cell 18: 1292–1309.

Shinozaki K & et al (2003). Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses. Current Opinion in Plant Biology 6: 410–417.

Suprunova A, Krugman T, Fahima T, Chen G, Shams I, Korol A & Nevo E (2004). Differential expression of dehydrin genes in wild barley, Hordeum spontaneum, associated with resistance to water deficit. Plant, Cell and Environment 27: 1297-1308.

Thomashow WF (1999). Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Plant Molecular Biology 50: 571–599.

Uno Y, Furihata T, Abe H, Yoshida R, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2000). Arabidopsis basic leucine zipper transcription factors involved in an absisic acid-dependent signal transduction pathway under drought and high-salinity conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 11632-11637.

Vaezi B, Bavei V, Shiran B (2010). Screening of barley genotypes for drought tolerance by agro-physiological traits in field condition. African Journal of Agricultural Research 5: 881-892.

Valentovic P, Luxova M, Kolarovic L, Gasparikova O (2006). Effect of osmotic stress on compatible solutes content, membrane stability and water relations in two maize cultivars. Plant Soil 4: 186–191.

Xiong, L. & Zhu, J. K. (2001). Abiotic stress signaling transduction in plants: molecular and genetic perspectives. Physiology Plant 112: 152–166.

Xue GP, Bower NI, McIntyre CL, Riding GA, Kazan K & Shorter R (2006). TaNAC69 from the NAC super family of transcription factors is up-regulated by abiotic stresses in wheat and recognizes two consensus DNA-binding sequences. Functional Plant Biology 33: 43–57.

Yamaguchi-Shinazaki K. & Shinozaki K. (2005). Organization of cis-acting regulatory elements in osmotic-and cold-stress-responsive promoters. Trends in Plant Science 10: 88–94.

The Expression Profile of OSBP, CAT and BZIP Genes in Drought Tolerant and Susceptible Soybean Cultivars Using Real Time PCR

Ahmadi J.*¹, Soleimani V.²

¹ Associate Professor of Imam Khomeini International university, Qazvin, Iran.

² M. Sc., Genomics Laboratory of Imam Khomeini International university, Qazvin, Iran.

Abstract

Under drought stress, a signaling system induces expression of specific genes to alleviate the harmful effects of drought stress. BZIP gene is a transcription factor in the signaling of abiotic stress and plays a role in the regulation responses to different stresses in plants and activated by ABA and closing the stomata. OSBP gene plays a key role in the signaling in several physiological reactions in response to stress. Catalase enzyme is series of anti-oxidant, which catalyzes the conversion of hydrogen peroxide to water and oxygen molecules. Two soybean cultivars, Williams (tolerant to drought) and L17 (susceptible to drought) were cultured in the greenhouse conditions. Drought stress treatment was performed at two-leaf stage for 7 days. Total RNA was extracted from leaves and roots of both control and stressed plants. Then cDNA was synthesized and used for Real time PCR. To normalize data the housekeeping gene 18SrRNA was used. Data analysis based on Ct curves showed that the expression of BZIP gene increased under drought stress in both leaf and root. The BZIP gene expression in Williams was two-fold greater than L17 cultivar. Also its expression was higher in root than leaf. OSBP gene expression differences were not significant between Williams and L17. The expression of CAT gene in Williams was two-fold greater than L17, and its expression was higher in root than leaf. According to increasing of drought tolerance through the expression of these genes, it can be concluded that transferring of these genes may enhance drought tolerance in high yield soybean genotypes.

Keywords: qRT-PCR, Stress, OSBP, CAT, BZIP, soybean.

* نویسنده مسئول: جعفر احمدی تلفن: 09123128278 Email: njahmadi910@yahoo.com

[1] - Signal Transduction

[2] - Late embryogenesis abundant

[3] - Transcription Factor

[4]- Reactive oxygen species

1-Efficiency adjusted ΔΔCt

[6]-Relative water contant

* Corresponding Author: Ahmadi J. Tel: 09123128278 Email: njahmadi910@yahoo.com

مراجع