مطالعه اثر ناحیه ژنومی حامل ژن Hd1 بر زمان خوشه­دهی در برنج

اسدالله احمدی­خواه¹*، لیلا نیری­پسند²

¹ عضو هیات علمی، گروه زیست­فناوری، دانشکده مهندسی انرژی و فناوری­های نوین، دانشگاه شهید بهشتی تهران.

² دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری.

تاریخ دریافت: 01/12/1391، تاریخ پذیرش: 20/07/1392

چکیده

عبور از مرحله رویشی به مرحله زایشی موجب تنظیم زمان خوشه­دهی در برنج می­گردد که از صفات مرتبط با سازگاری این گیاه به نواحی کاشت مختلف یا فصول متفاوت، می­باشد. چندین ژن مرتبط با زمان خوشه­دهی در برنج شناسایی شده است که یکی از مهمترین آنها ژن Hd1 بر روی کروموزوم شماره 6 برنج می­باشد. در این مطالعه دو رقم برنج شامل ارقام صدری (به عنوان والد بخشنده زودرس) و ندا (به عنوان والد دوره­ای دیر­رس)، به منظور بررسی اثر ناحیه ژنومی حامل ژن Hd1 بر زمان خوشه­دهی در برنج، تلاقی داده شدند و با دو بار تلاقی برگشتی نسل BC₂ ایجاد گردید. سپس یک بوته هتروزیگوت از نسل BC₂ خودگشن گردید تا جمعیت BC₂F₂ جهت انجام مطالعات فنوتیپی و مولکولی به دست آید. جمعیت مورد مطالعه از نظر زمان خوشه­دهی دارای توزیع فنوتیپی پیوسته بوده و برخی افراد جمعیت تفکیک متجاوز نسبت به والد دیررس نشان دادند. بر اساس ناحیه InDel موجود در اگزون شماره یک ژن Hd1 یک نشانگر کارکردی اختصاصی طراحی شد که تفاوت باندی واضحی بین والدین تلاقی ایجاد نمود. از اینرو، این نشانگر جهت ارزیابی الگوی آللی Hd1 در جمعیت BC₂F₂ استفاده گردید. بررسی نحوه تفکیک آللی نشان داد که مکان ژنی Hd1 در جمعیت مورد مطالعه از الگوی تفرق مورد انتظار مندلی (با نسبت 1:2:1) پیروی نمود. نقشه­یابی فاصله­ای مرکب (CIM) با نشانگرهای ریزماهواره نشان داد که ناحیه ژنومی در حد فاصل نشانگرهای Hd1-RM527 ارتباط زیادی (5/7<LOD) با زمان خوشه­دهی داشت و حدود 28 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه نمود. اثر افزایشی آلل والد بخشنده، منفی و در حدود 4/3- روز برآورد گردید. نتایج این بررسی بیانگر اثر معنی­دار ژن Hd1 بر زمان خوشه­دهی در برنج می­باشد و از نشانگر کارکردی توسعه یافته در این تحقیق می­توان برای ردیابی ژن Hd1 در جمعیت­های در حال تفرق و گزینش به کمک نشانگر (MAS) برای زودرسی استفاده کرد.

کلمات کلیدی: زودرسی، نشانگر کارکردی، نقشه­یابی.

مقدمه

زمان گلدهی یا تاریخ خوشه­دهی عامل مهمی نه تنها از حیث کمّیت محصول، بلکه از نظر کیفیت دانه در برنج به شمار می­رود (Fan et al., 2005). از طرفی عبور از مرحله رویشی به مرحله زایشی جهت تکثیر جنسی موفق گیاهان از اهمیت به سزایی برخوردار می­باشد که به وسیله عوامل داخلی و بیرونی تنظیم می­گردد (Kojima et al., 2002). در برنج، روزهای کوتاه موجب تحریک و القای انتقال به مرحله گلدهی می­شود. در اغلب واریته­های برنج دوره رشد رویشی متغیر است در حالی که دوره رشد زایشی نسبتاً پایدار می­باشد. بنابراین زمان خوشه­دهی (روز از کاشت تا خوشه­دهی) عموماً بیانگر دوره رشد می­باشد. حساسیت به فتوپریود، حساسیت به دما و دوره رشد رویشی تعیین­کننده زمان خوشه­دهی در برنج هستند (You-long et al., 2009). مطالعات پیشین نشان داده اند که چندین ژن در پاسخ به فتوپریود در برنج نقش دارند (Yokoo et al., 1980؛ Sano, 1992؛Tsai, 1995; ؛ Lu et al., 1997؛Lin et al., 1998؛ Maheswaran et al., 2000 ؛ Yu et al., 2002؛ Brondani et al., 2002؛ Zhou et al., 2001؛ Hittalmani et al., 2002؛ Rabiei, 2007). تعداد زیادی مکان صفت کمّی (QTL) مرتبط با زمان خوشه­دهی در برنج شناسایی شده­اند. در مطالعه­ای، Lin et al (2000) با استفاده از لاین­های ایزوژن نزدیک (NIL) نشان دادند که سه ژن Hd1، Hd2 و Hd3 در بروز حساسیت به فتوپریود دخالت دارند. اخیراً نشان داده شد که QTLهای معینی به طور مستقیم موجب اثرات متقابل پیچیده برای زمان خوشه­دهی و یا پاسخ به فتوپریود می­شوند (Ordonez et al., 2010). برای مثال، یک QTL بزرگ اثر بر روی بازوی کوتاه کروموزوم 6 (با نماد Hd1) باعث القای گلدهی در شرایط روزکوتاه و ممانعت از گلدهی در شرایط روز بلند می­گردد (Yano et al., 2000). مشخص گردیده که Hd1 در شرایط روز کوتاه باعث تنظیم عمل QTL بزرگ­اثر دیگری موسوم به Hd3a واقع بر کروموزوم 6 می­شود (Kojima et al., 2002). RFT1 مشابه Hd3a توسط Hd1 در روزهای کوتاه تنظیم می­شود و بیان آن در طی روز اتفاق افتاده و در غروب به اوج می­رسد (Komiya et al., 2008). همچنین، Yano et al (1997) نیز نشان دادند که Hd1 اثر زیادی بر روی تاریخ خوشه­دهی دارد. شبکه ژنی که گل­دهی را تحت پوشش قرار می­دهد شامل گیرنده­های نوری، اجزای مولکولی دخیل در تنظیم ساعت بیولوژیک و ژن­های ایجادکننده گل­دهی می­باشند (Kojima et al., 2002; Yano et al., 2000). مطالعات ژنتیک مولکولی نشان می­دهد ژن­های ارتولوگ[1] (شامل Hd1/CO و Hd3a/FT) در برنج به عنوان یک گیاه روز کوتاه و آرابیدوپسیس به عنوان یک گیاه روز بلند، در گل­دهی فتوپریودی برنج نقش دارند. ژن Ehd1 گل­دهی را در شرایط روزکوتاهی در حضور آلل عملکردی Hd1 سرعت می­بخشد (Tsuji et al., 2008). ژن Hd1 از دو اگزون و یک اینترون ساخته شده که پروتئینی با 395 اسید آمینه را رمز می­کند و جزو خانواده ژنی CO (آرابیدوپسیس) با یک ناحیه زینک فینگر[2] می­باشد (Yano et al., 2000). به نظر می­رسد که Hd1 به واسطه داشتن همین ناحیه، بر رونویسی ژن­هایی که بیان آنها به وسیله تغییر در فتوپریود کنترل می­شود، تأثیر می­گذارد (Yano et al., 2000).

در دو دهه گذشته،‌ امکان انتقال نواحی ژنومی مورد نظر با استفاده از نشانگرهای مولکولی فراهم شده است که منتج به طراحی و اجرای تعداد زیادی آزمایشات نقشه­یابی ژنتیکی با هدف توسعه نشانگرهای مولکولی قابل کاربرد در گزینش به کمک نشانگر[3] (MAS) و یا به طور خاص،‌ قابل کاربرد در برنامه تلاقی برگشتی به کمک نشانگر[4] (MABC) شده است (Semgan et al., 2006). استراتژی MAS مبتنی بر عدم تعادل لینکاژ بین نشانگر و QTLها می­باشد و در صورت وجود آن،‌ گزینش به کمک نشانگر ساده،‌ سریع،‌ ارزان و بسیار مؤثرتر از روش گزینش فنوتیپی می­باشد (Hospital, 2009). روش تلاقی برگشتی به کمک نشانگر برای گزینش پس­زمینه[5] و تسریع در بازیابی ژنوم والد دوره­ای[6] به کار می­رود (Hospital et al., 1992؛ Wang et al., 2007). در همین راستا نشانگرهای مولکولی شناسایی شده­اند که با خصوصیات مهم زراعی- اقتصادی پیوستگی داشته و از آن­ها در برنامه MABC در چندین گونه گیاهی نظیر ذرت،‌ برنج،‌ گندم و جو استفاده شده است (Semgan et al., 2006). هدف از اجرای این تحقیق، شناسایی فرم­های آللی مختلف ژن Hd1 در برنج و مشخص نمودن اثرات ژنتیکی آن­ها در تغییرات فنوتیپی صفت تعداد روز تا خوشه دهی در برنج می­باشد تا بتوان از آن در برنامه­های گزینش به کمک نشانگر برای زودرسی استفاده نمود.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی

در این تحقیق از دو رقم والدینی ایرانی ندا و صدری استفاده شد. رقم ندا از ارقام اصلاح شده الیت منطقه شمال کشور با عملکرد بالا و میان­رس می­باشد، در حالی که رقم صدری از ارقام محلی کیفی با عملکرد متوسط و زودرس به حساب می­آید. این دو رقم در سال 1386 در شرایط آب و هوایی گرگان در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان تلاقی داده شدند و در سال 1388 جمعیت نسل اول تلاقی برگشتی (BC₁) از تلاقی رقم ندا به عنوان والد دوره­ای با گیاهان F₁ و در سال 1389 جمعیت نسل دوم تلاقی برگشتی (BC₂) از تلاقی رقم ندا با گیاهان BC₁ ایجاد شد. پس از انگشت­نگاری گیاهان BC₂ با نشانگر اختصاصی ژن Hd1 یک بوته هتروزیگوت شناسایی گردید و در پاییز همان سال در اهواز از خودگشنی این بوته BC₂، جمعیت نسل BC₂F₂ به دست آمد. جهت ارزیابی فنوتیپی زمان خوشه­دهی، در سال 1390 تعداد 118 بوته از جمعیت نسل BC₂F₂ در مزرعه مستقر گردید. فاصله بوته­ها 25×25 سانتی­متر در نظر گرفته شد. در مورد والدین تلاقی، از هر کدام 20 بوته در دو ردیف کشت گردید. زمان خوشه­دهی بوته­های BC₂F₂ به همراه والدین به صورت تعداد روز از زمان بذرپاشی تا زمان خروج اولین خوشه در هر بوته یادداشت گردید.

تهیه نمونه برگی، استخراج DNA و واکنش زنجیره­ای پلی­مراز

نمونه­گیری از برگ­های جوان هر بوته در مزرعه انجام شد و نمونه­های برگی پس از برچسب­زنی در داخل کیسه فریزر بر روی یخ به آزمایشگاه منتقل گردید. استخراج دی ان ای از برگ­های جوان هر بوته به روش CTAB با اندکی تغییرات (Ahmadikhah, 2009) انجام شد. کیفیت DNA به وسیله الکتروفورز با استفاده از ژل آگارز یک درصد تعیین شد. کمّیت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر اندازه­گیری شد و غلظت هر نمونه در حد 100 نانوگرم بر میکرولیتر تنظیم گردید. سپس نمونه­ها تا زمان استفاده در واکنش PCR در فریزر 20- ذخیره شدند. برای تهیه مخلوط واکنش­های PCR از کیت شرکت سیناکلون (PCR master mix kit) استفاده شد. مواد مورد استفاده در یک واکنش PCR شامل 6 میکرولیتر PCR Master Mix، 1 میکرولیتر از هر کدام از آغازگرهای مستقیم و معکوس (10 نانو مولار)، 8/4 میکرولیتر  آب دوبار تقطیر بود که پس از تقسیط به هر تیوب، 1 میکرولیتر DNA الگو (10 نانوگرم) اضافه گردید. واکنش­های تکثیر در دستگاه ترمال سایکلر شرکت PeqLab و با چرخه­های دمایی شامل ºC94 به مدت 5 دقیقه؛ 35 چرخه در ºC94 به مدت 30 ثانیه، ºC35 به مدت 45 ثانیه، ºC72 به مدت 90 ثانیه؛ و سرانجام ºC72 به مدت 7 دقیقه انجام گردید. پس از تکثیر، فرآورده­های PCR بر روی ژل آگارز 5/2 درصد با ولتاژ 110 ولت الکتروفورز گردید. پس از پایان الکتروفورز عکس برداری از ژل­ها با دستگاه UV trans-illuminator انجام شد.

تجزیه­ و تحلیل داده­ها

داده های فنوتیپی

مقادیر آماره­های مختلف از قبیل میانگین، انحراف معیار (SD)، خطای معیار (S.E.)، حداقل و حداکثر به همراه شاخص­های شکل نوزیع داده­ها شامل چولگی و کشیدگی با استفاده از نرم افزارver. 11  SPSS (Kinnear & Colin, 2000) محاسبه گردید. به منظور آزمون برازش مقادیر مشاهده شده با مقادیر مورد انتظار، از آزمون مربع کای استفاده شد.

داده های­مولکولی

طراحی آغازگرهای مورد نیاز برای واکنش زنجیره ای پلیمراز با نرم­افزاز Primer3.0 (frodo.wi.mit.edu) انجام شد. انتخاب آغازگرهای اختصاصی ژن Hd1 به شرحی که در نتایج آمده است انجام گرفت. سه جفت آغازگر ریزماهواره در اطراف ژن Hd1 جهت آشکارسازی چندشکلی بین والدین تلاقی به کار رفت (جدول 1). جهت تعیین ارتباط مکان ژن Hd1 با صفت مورد مطالعه، از روش نقشه­یابی فاصله­ای مرکب (CIM) در نرم­افزار QTL Cartographer 2.5 (Wang et al., 2005) استفاده شد.

جدول 1- آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده در این تحقیق.

Table 1- Microsatellite primes used in the study.

آستانه معنی­داری (LOD) با انجام آزمون جایگشت[7] (با 500 تکرار) تعیین گردید. برآورد پارامترهایی مانند اثر افزایشی، اثر غالبیت، سهم ژن در توجیه تغییرات فنوتیپی (R²) و رسم گراف مربوطه در محیط این نرم­افزار انجام شد.

نتایج

بررسی­های فنوتیپی

والد بخشنده (صدری) و دوره­ای (ندا) دارای زمان خوشه­دهی بسیار متفاوتی (به ترتیب 85 و 103 روز) بودند، در حالیکه حداقل و حداکثر زمان خوشه­دهی جمعیت BC₂F₂، به ترتیب 90 و 106 روز به دست آمد و برخی بوته­های جمعیت BC₂F₂ تفکیک متجاوز نسبت به والد دیررس­تر (ندا) نشان دادند که این می­تواند دلیلی بر کمّی بودن صفت مورد مطالعه باشد. در این مطالعه جمعیت در حال تفرق تهیه شده دارای توزیع فنوتیپی پیوسته و نرمال بوده و از این­رو جهت مطالعات بعدی مناسب تشخیص داده شد (جدول 2؛ شکل 1).

تجزیه­های بیوانفورماتیک و انتخاب آغازگرهای اختصاصی ژن Hd1

اکسشن­های مربوط به ژن Hd1 از وبگاه NCBI (www.ncbi.nlim.nih.gov) (شامل 23 اکسشن از AB474759.1 تا AB474781.1) دانلود گردید و برای مقایسه و همردیف کردن آنها از نرم­افزار Bioedit2007 استفاده شد. نتیجه همردیف­سازی توالی­های نوکلئوتیدی نشان داد که علاوه بر جایگزینی­های متعدد در موقعیت­های مختلف، یک ناحیه بزرگ InDel (حذف/اضافه) در اگزون اول این ژن بین اکسشن­های مختلف وجود دارد. این InDel دارای سه فرم آللی متفاوت است (شکل 2). فرم اول (A) فاقد اضافه شدگی، فرم دوم (B) دارای یک اضافه شدگی به اندازه 36 نوکلئوتید و فرم سوم (C) دارای یک اضافه شدگی به اندازه 152 نوکلئوتید بود. بنابراین امکان طراحی آغازگرهایی در دو طرف این ناحیه InDel برای آشکارسازی پلی­مورفیسم وجود داشت.

 (آغازگر مستقیم: 5`-ACAACAACAACAACAATAACAAC-3`؛ آغازگر معکوس: 5`-TGTTCATGCATCCCATACTG-3`).

با توجه به موقعیت آغازگرهای طراحی شده (شکل 2) اندازه باند مربوط به فرم­های آللی مختلف به ترتیب معادل 303، 187 و 151 جفت باز پیش­بینی گردید. بنابراین می­توان انتظار داشت که بتوان سه فرم آللی فوق را بر روی ژل آگارز به راحتی از همدیگر جدا نمود.

جدول 2- پارامترهای مرتبط با زمان خوشه­دهی والدین تلاقی و جمعیت BC₂F_2.

Table 2- heading date related parameters in parents of the cross and BC₂F₂ population.

* در مورد پارامترهای ردیف 1 تا 3 انحراف معیار و در مورد پارامترهای ردیف 4 و 5 خطای معیار منظور گردید.

* SD was considered in the case of rows 1-3 and SE was considered in the case of rows 4 and 5.

شکل 1- توزیع فنوتیپی زمان خوشه­دهی در جمعیت BC₂F_2. موقعیت والدین با پیکان نشان داده شده است.

Figure 1- Phenotypic distribution of heading date in BC₂F₂ population. Position of parents was shown with arrowheads.

مطالعه جمعیت BC₂F₂ با نشانگر کارکردی ژن Hd1

تکثیر DNA والد دوره­ای ندا و بخشنده صدری با نشانگر طراحی شده بر اساس InDel موجود در اگزون اول ژن Hd1 نشان دهنده تفاوت باندی واضحی بین دو والد بود (شکل 3). رقم ندا دارای اندازه باند 187 جفت باز و رقم صدری دارای اندازه باند 151 جفت باز طبق انتظار بود. بنابراین جهت مشاهده تفکیک آللی در این مکان InDel، انگشت نگاری 118 بوته از جمعیت BC₂F₂ با نشانگر اختصاصی انجام شد که نتایج حاکی از تفرق مندلی در این مکان ژنی بود (جدول 3). همانگونه که ملاحظه می­شود، 27 بوته (9/22 درصد) دارای آلل والد بخشنده، 35 بوته (7/29 درصد) دارای آلل والد دوره­ای و 56 بوته (5/47 درصد) دارای آلل­های هر دو والد می­باشند. میانگین زمان خوشه­دهی بوته­های هموزیگوس مغلوب 3/102 روز و میانگین زمان خوشه­دهی بوته­های هموزیگوس غالب 5/95 روز برآورد گردید.

بررسی اثر ژن Hd1 با روش نقشه­یابی فاصله­ای مرکب

جهت بررسی اثر ژن Hd1 بر زمان خوشه­دهی از مکان­یابی QTL با روش نقشه­یابی فاصله­ای مرکب (CIM) استفاده شد. به این منظور چندین نشانگر ریزماهواره در اطراف مکان ژنی Hd1 انتخاب و جهت آشکارسازی چندشکلی بین والدین تلاقی به کار رفتند که سه نشانگر ریزماهواره (شامل RM19744، RM527 و RM19930) در دو طرف ژن Hd1 بین والدین تلاقی چندشکلی نشان دادند. پس از انگشت­نگاری کل جمعیت نقشه­یابی با این نشانگرها به همراه نشانگر مبتنی بر InDel موجود در ژن Hd1 و انجام تجزیه با روش نقشه­یابی فاصله­ای مرکب (CIM) مشخص شد که ناحیه­ ژنومی در حد فاصل Hd1-RM527 با زمان خوشه­دهی در ارتباط می­باشد (5/7LOD>). این مکان ژنی حدود 28 درصد از تغییرات فنوتیپی صفت زمان خوشه­دهی را توجیه نمود. اثر افزایشی آلل صدری بر زمان خوشه­دهی منفی و معادل 4/3- روز برآورد گردید، در حالیکه اثر غالبیت مثبت ولی ناچیز بوده است (شکل 4).

شکل 2- طرحی از ساختار ژن Hd1 و سه فرم آللی در اگزون شماره یک آن: فرم A فاقد اضافه شدگی، فرم B دارای اضافه شدگی 36 نوکلئوتیدی و فرم C دارای اضافه شدگی 152 نوکلئوتیدی. موقعیت آغازگرهای PCR بر اساس اکسشن مرجع (AB474759.1) می­باشد و محل آنها با پیکان نشان داده شده است.

Figure 2- A scheme of Hd1 structure and three allelic forms in its first exon: form A absents insertion, form B has a 36 n.t insertion and form C has a 152 n.t insertion. Positions of PCR primers are shown with the reference to AB474759.1 accession (Nipponbare) and arrowheads show their location.

شکل 3- نمونه­ای از الگوی الکتروفورزی محصول تکثیر PCR با نشانگر مبتنی بر InDel در اگزون شماره یک ژن Hd1 بر روی ژل آگارز 5/2 درصد. والدین تلاقی شامل ندا (N) و صدری (S) و تعدادی از افراد نسل BC₂F₂ نشان داده شده­اند. M: نشانگر اندازه مولکولی 100 جفت باز.

Figure 3- A sample of electrophoretic pattern of PCR products obtained with InDel- based marker in first exon of Hd1 on 2.5% agarose gel. Parents of the cross included Neda (N) and Sadri (S) and some of BC₂F₂ individuals are shown. M: 100 bp size marker.

جدول 3- میانگین زمان خوشه­دهی، فراوانی ژنوتیپی و آزمون تفکیک مندلی.

Table 3- Average of heading date, genotypic frequencies and Mendelian segregation test.

n.s- غیر معنی­دار [با توجه به 82/7= _(df=2;α=5%)²χ]                                    n.s- non-significant [χ²_{(df=2, α=0.05)}=7.82]

شکل 4- نقشه­یابی فاصله­ای مرکب (CIM) برای صفت روز تا خوشه­دهی در برنج.

Figure 4- Composite interval mapping (CIM) analysis for heading date in rice.

بحث

در این تحقیق جهت بررسی اثر ژن Hd1 بر زمان خوشه­دهی در برنج ابتدا یک جمعیت BC₂F₂ از تلاقی بین ارقام ایرانی صدری و ندا با روش تلاقی برگشتی ایجاد گردید و بررسی­های فنوتیپی در شرایط مزرعه و مطالعات مولکولی به همراه والدین تلاقی صورت گرفت. از آنجا که نتاج خودگشن شده تلاقی برگشتی قابلیت تکرار دارند، نسبت به تک گیاهان والدینی‌ خود، از خطای محیطی کمتری برخوردار هستند. بنابراین استفاده از آن‌ها برای شناسایی QTLهای با وراثت‌پذیری پایین مناسب‌تر است (Ahmadikhah, 2011). نتایج نشان داد که آغازگرهای مبتنی بر ناحیه InDel در اگزون شماره 1 ژن Hd1 توانستند به طور اختصاصی منطقه هدف را تکثیر نموده و چندشکلی بین والدین تلاقی را آشکار نمایند. بنابراین نشانگر توسعه یافته را می­توان یک نشانگر تکثیر آلل اختصاصی[8] (ASA) کارکردی تلقی کرد. مطالعات زیادی در گذشته با استفاده از چنین نشانگرهایی هم در جانوران و هم در گیاهان جهت اهداف خاص توسعه یافته است (Soleimani et al., 2003؛ Liu and Sommer, 2004؛ LaFramboise et al., 2005؛ Ahmadikhah et al., 2010؛ Ahmadikhah and Irannejad, 2010; Kiani, 2011;؛ Gaafar, 2010؛ Hirotsu et al., 2010؛ Nayyeripasand et al., 2013). با توجه به اتمام پروژه تعیین توالی ژنوم برنج (Goff et al., 2002) و همچنین با ثبت شکل­های آللی جدید از ژن­های مختلف در بانک ژن جهانی در سراسر دنیا (www.ncbi.nlm.nih.gov)، استفاده از نشانگرهای ASA تبدیل به ابزار مفیدی جهت تجزیه فراوانی­های آللی ژن­های کاندید و بررسی اثر آنها بر تغییرات فنوتیپی صفات مورد مطالعه و همچنین استفاده از آنها در مطالعات ارتباط[9] شده است (Nayyeripasand et al., 2013). نتایج این تحقیق نشان داد که انتقال ژن Hd1 از طریق تلاقی برگشتی به زمینه ژنتیکی رقم ندا (از ارقام الیت منطقه شمال کشور) می­تواند زمان خوشه­دهی را تسریع نماید، به طوری که در نسل BC₂F₂ تفاوت زمان خوشه­دهی بوته­های دارای ژنوتیپ Hd1Hd1 با زمان خوشه­دهی بوته­های دارای ژنوتیپ مغلوب معادل 8/6 روز است.  نتایج نقشه­یابی فاصله­ای مرکب (CIM) با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره تأیید نمود که ژن Hd1 ارتباط معنی­داری (5/7LOD>) با زمان خوشه­دهی در برنج دارد (شکل 4) و آلل کاهنده از والد بخشنده دارای اثر افزایشی منفی معادل 4/3- روز بود که این نتیجه با نتایج سایر تحقیقات مبنی بر دخالت آلل غیر کارکردی Hd1 در تسریع زمان خوشه­دهی در برنج مطابقت دارد (Hayama et al., 2003; Gaafar, 2010؛ Kim et al., 2007)؛ در حالی که در گیاه آرابیدوپسیس روزهای بلند سبب بیان ژن CO در غروب می­شود و لذا پروتئین مربوطه سبب زودرسی در شرایط روزبلندی می­شود. بنابراین می­توان بیان نمود که تنظیم ژن­های گروه FT توسط ژن­های CO (در آرابیدوپسیس) و Hd1 (در برنج) به ترتیب نقش مرکزی در فتوپریودیسم گیاهان روزبلند و روزکوتاه دارد (Doi et al., 2004). همانگونه که در بالا ذکر شد، به کمک نشانگر کارکردی اختصاصی Hd1، آلل کاهنده زمان خوشه­دهی در والد بخشنده صدری شناسایی گردید. شناخت آلل کاهنده زمان خوشه­دهی می­تواند اهمیت اصلاحی داشته باشد، زیرا هنگامی که بهنژادگر قصد بهبود و اصلاح لاین­های زودرس از طریق استراتژی گزینش به کمک نشانگر (MAS) را دارد، دانستن اینکه کدام آلل موجب زودرسی می­شود، انتخاب والد بخشنده­ای که باید با لاین(های) گیرنده تلاقی یابد را تسهیل می­نماید. نتایج نقشه­یابی فاصله­ای مرکب همچنین نشان داد که ژن Hd1 حدود 28 درصد از تغییرات فنوتیپی صفت زمان خوشه­دهی را در جمعیت BC₂F₂ تبیین کرد. در مطالعات پیشین نیز نشان داده شد که این ژن بسته به نوع جمعیت نقشه­یابی به کار رفته بین 18 تا 31 درصد از تغییرات فنوتیپی زمان خوشه­دهی را در برنج توجیه می نماید (Park et al., 1995؛ Yamamoto et al., 1998؛ Lin et al., 2000؛ Yano et al., 1997).

نتیجه گیری

ژن Hd1 تاثیر معنی­داری بر زمان خوشه­دهی در برنج دارد و نشانگر کارکردی اختصاصی ژن Hd1 که بر اساس یک ناحیه InDel بزرگ در اگزون شماره 1 ژن مزبور طراحی شد، می­تواند به طور موثری در گزینش به کمک نشانگر برای اصلاح ارقام زودرس در برنج به کار رود.