تاثیر تغییرات تک نوکلئوتیدی در ژن‌های کاپاکازئین، استئوپونتین وPPARGC1α روی صفات تولید شیر و کیفیت تولید پنیر نژاد براون سوئیس

زکی زاده, سونیا; هاشمی, میر جلال; غلامی, هادی; قدس روحانی, محسن; وکیلی, رضا

doi:10.22103/jab.2014.1327

تعداد نشریات	26
تعداد شماره‌ها	447
تعداد مقالات	4,557
تعداد مشاهده مقاله	5,380,001
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	3,580,066

تاثیر تغییرات تک نوکلئوتیدی در ژن‌های کاپاکازئین، استئوپونتین وPPARGC1α روی صفات تولید شیر و کیفیت تولید پنیر نژاد براون سوئیس

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 5، دوره 6، شماره 3، آذر 1393، صفحه 61-80 اصل مقاله (622.89 K)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2014.1327

نویسندگان

سونیا زکی زاده؛ میر جلال هاشمی؛ هادی غلامی؛ محسن قدس روحانی؛ رضا وکیلی

چکیده

شیر از دیرباز به عنوان غذای کامل و تامین کننده بخشی از نیازهای تغذیهای روزانه انسان مورد توجه بوده است. یکی از ترکیبات مهم شیر پروتئینها میباشند که در صنایع فرآوری شیر و تکنولوژی تولید محصولات شیری مانند پنیرسازی، فاکتور مهمی بشمار میآیند. عوامل متعددی از جمله ژنتیک میتوانند بر مقدار و ترکیبات شیر و نهایتا کمیت و کیفیت پنیر تاثیر گذارند. در این راستا، از طریق تکنیکهای ژنتیک مولکولی نواحی متعددی روی ژنوم گاو از جمله کروموزوم 6 شناسایی شده است. در این پژوهش تاثیر 3 ژن کاپاکازئین، اوستئوپونتین و PPARGC1α از کروموزوم فوق روی صفات تولیدی شیر و راندمان تولید پنیر بررسی شد. استخراج DNA به روش استخراج نمکی از نمونه خون 100 راس گاو براون سوئیس انجام شد. ژنوتیپها به روش PCR-RFLP و با استفاده از آنزیمهای HinfI، BsurI،NheI و BsrI تعیین شدند. ارزشهای اصلاحی با نرم افزار ِDFREML برآورد و چهار فاکتور راندمان، درصد چربی و پروتئین و ماده خشک پنیر اندازهگیری شدند. همچنین، ارتباط چندشکلیها با ارزش اصلاحی صفات و کیفیت محصول پنیر در سطح معنیداری 5% با رویه GLM بررسی گردید. فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی محاسبه شد و نتایج نشان داد که بجز کاپاکازئین بقیه جایگاهها در حالت تعادل هاردی-واینبرگ قرار داشتند. در این تحقیق ژنوتیپ روی محصول پنیر اثر معنیدار نداشت اما تاثیر همزمان ژنوتیپ PPARGC1α -T19C و کاپاکازئین روی ارزشهای اصلاحی تولید شیر معنیدار بود. ارتباط معنیدار بین چندشکلیهای تک نوکلئوتیدی با صفات تولید شیر، راهکار مناسبی جهت بهبود ارزیابیهای گاو شیری است. استفاده از روشهای شناسایی تک نوکلئوتیدهای متراکم در پژوهشهای تکمیلی، توصیه میشود

کلیدواژه‌ها

صفات تولیدی شیر؛ راندمان تولید پنیر؛ کاپاکازئین؛ اوستئوپونتین؛ PPARGC1α

اصل مقاله

تاثیر تغییرات تک نوکلئوتیدی در ژنهای کاپاکازئین، استئوپونتین وPPARGC1α روی صفات تولید شیر و کیفیت تولید پنیر نژاد براون سوئیس

سونیا زکی زاده*¹، میرجلال هاشمی²، هادی غلامی²، محسن قدس روحانی³، رضا وکیلی⁴

^{1 و 3}استادیاران گروه علوم دامی و صنایع غذایی موسسه آموزش عالی علمی کاربردی جهاد کشاورزی

^{2، 4} فارغ التحصیلان کارشناسی ارشد و استادیار گروه علوم دامی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کاشمر

تاریخ دریافت: 29/03/1392، تاریخ پذیرش: 23/09/1392

چکیده

واژههای کلیدی: صفات تولیدی شیر، راندمان تولید پنیر، کاپاکازئین، اوستئوپونتین، PPARGC1α.

مقدمه

امروزه اهمیت وجود شیر و فراورده های آن در سبد غذایی خانوارها بر کسی پوشیده نیست. در نژادهای مختلف، ترکیبات اصلی شیر متفاوت است. بدون شک تمام پدیدههای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی که ترکیب خون را تحت تاثیر قرار میدهند، بر ترکیب شیر نیز موثرند. پروتئینها از ترکیبات مهم شیر هستند که در صنایع فرآوری شیر و تکنولوژی تولید محصولات شیری از جمله پنیرسازی اهمیت به سزایی دارند. پروتئین اصلی شیر کازئین نام دارد که در فرآیند تولید پنیر نقش اساسی دارد. کازئین حدود 80% از پروتئینهای شیر را به خود اختصاص داده و دارای اشکال متفاوتی است. گزارشهای متعددی راجع به تاثیر مشخص تفاوتهای ژنتیکی پروتئینهای شیر بر پایداری حرارتی، ویژگیهای انعقادی و غلظت و توزیع ترکیبات شیر وجود دارد (Kűbarsep et al., 2005; Wdholm et al., 2006; Buchberger and Dovc, 2000; Bonfatti et al., 2010). تاکنون نواحی متعددی روی ژنوم گاو شناسایی شدهاند که روی مقدار و ترکیبات شیر موثرند. از این میان میتوان به ژنهایی روی کروموزوم 6 اشاره نمود. کروموزوم 6 دارای 11 میلیون جفت باز است که ژنهای مربوط به پروتئین شیر در ناحیه غیرقابل ترجمه 3 کروموزوم قرار دارند. مهمترین ژنی که در این خوشه روی مقدار و درصد پروتئین شیر تاثیر میگذارد، ژن کاپاکازئین است. پروتئین کاپاکازئین با 179 اسیدآمینه از مهمترین پروتئینهای شیر میباشد که توسط سلولهای اپی تلیال غدد پستانی سنتز شده و نقش عمدهای در فرآیندهای انعقاد شیر و پنیرسازی دارد. در بررسی کل ژنوم گاو بیان شده است که نقاط عمدهای از کروموزومهای 5، 6، 11 و 14 با صفت درصد پروتئین شیر در ارتباط هستند که در این رابطه کروموزوم 6 به طور معنیداری با هر 6 نوع پروتئین مهم شیر (کازئینها و پروتئینهای آب پنیر) مرتبط است (Schopen et al., 2011). ژن کاپاکازئین در منطقه 3َ مجموعه کازئین و در فاصلهی 6/5 سانتی مورگان از کازئین S1α قرار گرفته و با طول 13 کیلوباز، دارای 5 اگزون و 4 اینترون است. تاثیر معنیدار چندشکلیهای این ژن روی تولید شیر، مقدار و درصد پروتئین و مقدار و درصد چربی گزارش شده است (Tsiaras et al., 2005؛ Schopen et al., 2011).

از طرف دیگر، ژن PPARGC1A نیز روی کروموزوم 6 قرار گرفته و نقش کلیدی در فعالسازی گیرندههای هورمونی هستهای و رونویسی فاکتورهای تنظیم کننده هموستازی انرژی دارد (Weikard et al., 2004). این ژن در تعادل محیط داخلی بدن، متابولیسم اکسیداتیو و سوخت و ساز چربی و گلوکز تاثیر گذار است و در اندامهای فعال متابولیکی به میزان زیادی بیان میشود (Pasandide et al., 2010, a, b; Komisarek et al., 2009). از تعداد 11 چندشکلی که تاکنون برای این ژن شناسایی شده است، مشخص شده که جهش نقطهای T/C در موقعیت 1892 اینترون 9 تاثیر معنیدار روی شیر و ترکیبات آن در نژادهای مختلف گاو دارد (Weikard et al, 2004; Komisarek and Dorynek, 2009; Pasandideh et al., 2011).

اوستئوپونتین (OPN) که قبلا به نامهای سیالوپروتئین استخوانی[1]، فسفوپروتئین ترشحی-1[2] و فعال کننده-1 سلولهای T[3] نامیده میشد، گلیکوپروتئینی اسیدی و فاکتور مهمی در تغییر حالت استخوان و محکم شدن استئوکلاست، چسبیدگی سلولی، تنظیم شیمیایی بدن، حفظ سلولها، تغییر حالت بافتها، تنظیم التهاب، تولیدمثل (Kilian et al., 2010)، لقاح و باروری (Khatib et al.,2009) و رشد و نمو جنین است (Leonard et al.,2009). بیان این ژن در غدد پستانی از هنگام زایمان شروع میشود و در تمام طول شیردهی افزایش پیدا میکند (Cohen-Zinder et al., 2005). ژن اوستئوپونتین روی کروموزوم 6 واقع بوده و با دارا بودن حدود 7000 جفت باز و 6 اگزون، پروتئینی با 278 اسیدآمینه را کد میکند (شماره شناسایی NW_255516). مشخص شده است که چندشکلی تک نوکلئوتیدی درناحیه اینترون 4 و موقعیت باز 8514 روی تولید شیر و شمارش سلولهای بدنی شیر تاثیر دارد (Leonard et al.,2009؛ Nasiri et al., 2010a؛ Schnabel et al., 2005). طبق پژوهشهای انجام شده آلل C بیشتر روی ترکیبات، پروتئین وچربی شیر وآللT غالباٌ روی رشد بدن تأثیرگذار است (Khatib et al., 2007; Pasandideh et al, 2011; Leonard et al.,2009).

ژنهای کاپاکازئین، PPARGC1A و استئوپونتین (OPN) از جمله ژنهای کاندیدا برای صفات مربوط به ترکیبات شیر هستند و به دلیل موقعیت قرارگیری آنها روی کروموزوم 6 گاو (شکل 1) و تاثیری که از آنها روی صفات تولیدی و ترکیب شیر گزارش شده است، هدف از این پژوهش مطالعه تعیین فراوانی ژنی و ژنوتیپی در جایگاههای اگزون 4 کاپاکازئین، اینترون 9 و ناحیه´3 ژن PPARGC1A و اینترون 4 ژن OPN و بررسی تاثیر همزمان هاپلوتیپهای این 3 ژن روی مقدار و ترکیبات شیر و همین طور کیفیت و راندمان تولید پنیر، درصد پروتئین، چربی و ماده خشک پنیر به دست آمده از شیر گاوهای نژاد براون سوئیس است.

مواد و روشها

جمعیت مورد مطالعه و خونگیری

در این آزمایش به صورت تصادفی از تعداد 100 راس گاو شیری نژاد براون سوئیس مجتمع آموزش جهادکشاورزی خراسان رضوی که دارای ثبت مشخصات و شجره، رکورد تولید، چربی و پروتئین شیر بودند، استفاده شد.

نمونه خون کامل ورید دمی، از هر گاو و با استفاده از ونوجکتهای خلادار حاوی ماده ضد انعقاد EDTA جمع آوری شد. نمونهها روی یخ به آزمایشگاه منتقل و سپس در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردیدند. استخراج DNA از 3 میلیلیتر خون کامل و به روش استخراج نمکی تغییر یافته (Javanrouh et al., 2006) انجام گرفت. کیفیت و کمیت نمونههای DNA استخراج شده با روش اسپکتروفتومتر و ژل آگارز 1% تعیین شدند.

اجزای واکنش و شرایطPCR

اجزای واکنش برای تکثیر تمام ژنها شامل 50 نانوگرم بر میکرولیتر DNA ژنومی، بافر 1XPCR، Mgcl₂ 5/2 میلی مولار، 200 میکرومولار dNTP، 5/0 واحد آنزیم Taq پلی مراز، 5 پیکومول بر میکرولیتر از هر کدام از آغازگرهای رفت و برگشت و مابقی حجم تا 25 میکرولیتر آب دوبار تقطیر بود. تنها تفاوت این بود که برای کاپاکازئین از 6/0 واحد آنزیم Taqپلی مراز و برای PPARGC1α نیز از 1 پیکومول بر میکرولیتر از آغازگرهای رفت و برگشت استفاده گردید.

شرایط دمایی در نظر گرفته شده و تعداد سیکلهای تکثیر به تفکیک هر جایگاه در جدول 1 آورده شده است. آغازگرهای مورد استفاده به صورت لیوفیلیزه (شرکت Generay Biotech، آلمان) تهیه و طبق دستور سازنده آماده شد. مشخصات پرایمرها، محل و طول قطعه تکثیری به همراه آنزیم برش دهنده هر جایگاه در جدول 2 آورده شده است.

هضم آنزیمی با استفاده از روش RFLP

تمامی آنزیمهای برشی مورد استفاده در این پژوهش ساخت شرکت Fermentas (آلمان) بودند. واکنش هضم آنزیمی طبق توصیه شرکت سازنده و در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 3 میکرولیتر محصول PCR، 2 میکرولیتر بافر مخصوص و 6/0 میکرولیتر آنزیم مربوطه و مابقی حجم آب دوبار تقطیر، انجام شد. فرآیند هضم برای تمامی آنزیم هادر دمای 37 درجه سانتیگراد و در طول شب انجام شد. تنها هضم فرآورده PCR ژن OPN در دمای 65 درجه سانتیگراد و به مدت 16 ساعت انجام شد.

تعیین ژنوتیپ، فراوانی آللی و ژنوتیپی

برای تعیین ژنوتیپ گاوها مقدار 4 میکرولیتر از محصول هضم آنزیمی روی ژل آگارز 3 درصد مدت 50 دقیقه با ولتاژ 90 الکتروفورز شد. پس از رنگ آمیزی ژلها با رنگ اتیدیوم بروماید و مشاهده توسط دستگاه ژل داک، ژنوتیپ هر فرد به طور مستقیم از روی ژل تعیین شد. سپس با استفاده از نرمافزار PopGen نسخه 31/1، فراوانیهای آللی و ژنوتیپی به ازاء هر جایگاه و به روش شمارش مستقیم محاسبه شدند. همچنین، با استفاده از نرمافزار مذکور جمعیت مورد مطالعه از نظر تعادل هاردی واینبرگ در سطح معنیداری 95% بررسی شد.

شکل 1- موقعیت قرارگیری ژنهای کاپاکازئین، OPN (یا SPP1) و PPARGC1A روی کروموزوم 6 (منبع سایت ncbi).

Figure 1- The location of kappa casein, OPN (or SPP1) and PPARGC1A on chromosome 6 (reference: ncbi site).

جدول 1- شرایط واکنش به تفکیک هر جایگاه ژن.

Table 1- PCR conditions of each locus.

جایگاه

Gene

واسرشته سازی اولیه^*

Initial Denaturation

واسرشته سازی

Denaturation

اتصال آغازگر (به روشTouchdown*Anealing)

بسط

Extention

بسط نهایی^*

Final extention

تعداد چرخه (از مرحله 2 4)

Cycle

کاپاکازئین

CSN3

95°

10 min

94°

30sec

60°

30 sec

72°

30 sec

72°

30 sec

PPARGC1α – T19C

95°

5 min

94°

30sec

62°

30 sec

72°

40 sec

72°

5min

PPARGC1 α -A968C

95°

5 min

94°

30 sec

62°

30 sec

72°

40 sec

72°

5min

اوستئوپونتین (OPN)

95°

5 min

94°

45 sec

50-63°^§

72°

45 sec

72°

7min

^* این دو مرحله فقط یک بار انجام میشوند و جزء چرخه نیستند. ^§ کاهش دمای اتصال آغازگر به میزان 2 درجه سانتیگراد در هر چرخه بود.

جدول 2- مشخصات پرایمرها، توالی آغازگرها، طول قطعه تکثیر شده و آنزیم برشی مورد استفاده برای هر جایگاه.

Table 2- Characters of the primers, length of amplification and desirable restriction enzymes.

شماره دستیابی Acc #	آنزیم برشی Restriction Enzyme	محل و طول قطعه تکثیر Region and length of product	توالی آغازگرهای رفت و برگشت Forward and backward primers-	نام جایگاه Locus
X14908	Hinf I	Exon 4 350 bp	F:5' ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG 3'	کاپاکازئین CSN3
X14908	Hinf I	Exon 4 350 bp	R:5' GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA 3'	کاپاکازئین CSN3
AY547554	Bsur I	Intron 9 250 bp	F:5' CATAGCCGGCGGCCCAGGTAATGATGCACGTTGGC 3'	PPARGC1α – T19C
AY547554	Bsur I	Intron 9 250 bp	R:5'TGGAGCCTTTCGTGCTGGTACTCCTCGTAGCTGTC 3'	PPARGC1α – T19C
AY321517	Nhe I	UTR-3`^* 191 bp	F:5'GCGAGCACGGTGTTACATTACTAAGGAGAGTTGGCTAG3' R:5'GAAAATCAGAAGTGTGATAGAC 3'	PPARGC1α -A968C
NW_255516	Bsr I	Intron 4 bp 290	F5´- GCAAATCAGAAGTGTGATAGAC -3´ R5´- CCAAGCCAAACGTATGAGTT -3´	OPN

^* Untranslated region

پیشبینی ارزشهای اصلاحی و ارتباط آنها با انواع ژنوتیپ در جایگاههای مورد بررسی

ارزش اصلاحی صفات تولید شیر، درصد چربی و پروتئین شیر دوره اول شیردهی1024 گاو حاصل از 55 پدر و 220 مادر، با استفاده از مدل 1 نرم افزار DFREML پیشبینی شد. مدل شامل اثرات ثابت سال-فصل زایش و متغیر کمکی تعداد روزهای شیرواری و اثرات تصادفی شامل اثر حیوان و باقیمانده بودند.

Y = Xb + Za + e (مدل 1)

Y: بردار صفات مشاهده شده؛ b: بردار عوامل اثرات ثابت (سال-فصل زایش، تعداد روزهای شیردهی)؛ X: ماتریسی که b را به Y ارتباط میدهد؛ a: بردار ارزش اصلاحی برای اثرات ژنتیک افزایشی مستقیم؛ Z: ماتریسی که اثرات ژنتیکی افزایشی مستقیم را به Y ارتباط میدهد.

از ارزشهای اصلاحی تعداد 100 گاو گله که تعیین ژنوتیپ شده بودند، برای بررسی ارتباط بین ارزش اصلاحی صفات با چندشکلی در جایگاههای مورد مطالعه، استفاده گردید. تجزیه و تحلیل آماری توسط نرمافزار SAS (2000) و با استفاده از روال مدل خطی تعمیم یافته[4] (GLM) و بر اساس مدل خطی زیر، در سطح معنیداری 95 درصد انجام شد. همواره ژنوتیپ کاپاکازئین به عنوان اثر ثابت جهت تصحیح تاثیر ژن عمده در مدل گذاشته شد و عامل دیگر لحاظ شده در مدل، ژنوتیپ در جایگاه OPN یا PPARGC1A بود. در مورد PPARGC1A هاپلوتیپ دو جایگاه اینترون 9 و 3`-UTR نیز بررسی شد.

Y_ijk= ارزش اصلاحی برآورده شده برای صفات تولید شیر، درصد چربی و پروتئین؛ μ= میانگین جامعه؛ KCN_i= اثر ثابت ژنوتیپ iام در جایگاه چندشکلی کاپاکازئین؛ Bj= اثر ثابت ژنوتیپ jام در یک جایگاه چندشکلی از ژنهای اوستئوپونتین یا PPARGC1A.

برای بررسی هاپلوتیپهای ژن PPARGC1A و محاسبه مقدار عدم تعادل پیوستگی، از نرم افزار Haploview 4.04 (Barrett et al, 2005) استفاده شد.

کیفیت و راندمان تولید پنیر

جهت بررسی اثر چندشکلی هاپلوتیپهای شناسایی شده روی چهار فاکتور مهم پنیرسازی (راندمان تولید پنیر، ماده خشک پنیر، درصد چربی و درصد پروتئین پنیر) تعداد 5 راس از گاوهایی که ژنوتیپهای مشاهده شده را پوشش میدادند، انتخاب و در قالب طرح کاملا تصادفی با 5 تیمار و 3 تکرار از شیر نمونه گرفته و پنیرسازی انجام شد. نحوه انتخاب این گاوها، پس از مشخص شدن ژنوتیپها و در بخش نتایج توضیح داده شده است.

پنیرسازی مشابه فرآیند متداول صنعت و در پایلوت تحقیقاتی شیر مجتمع آموزش جهاد کشاورزی خراسان رضوی انجام شد. با توجه به ظرفیت کارخانه، روزانه از تعداد 3 نمونه شیر متعلق به 3 گاو به مقدار وعده شیردوشی کامل (حدود 7 کیلوگرم شیر)، جهت تولید پنیر استفاده شد که این روند به مدت 5 روز کاری ادامه داشت. پس از تعیین ترکیبات شیر (پروتئین، چربی و مواد جامد)، جهت سالم سازی آن از روش پاستوریزاسیون 65 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه استفاده گردید (Ghods Rohani, 2006). شیر پس از پاستوریزاسیون، تا دمای حدود 35 درجه سانتیگراد سرد شد و مقدار 1% استارتر مخلوط (ترموفیل و مزوفیل) به تیمارها افزوده شد. پس از گذشت حدود 30 دقیقه و تولید اسید (زمان پیش رسی) pH به 6/4 رسید. سپس مایه پنیر به میزان 001/0 درصد لیتر و کلرید کلسیم به میزان 01/0 درصد لیتر به شیر اضافه گردید. شیر تلقیح شده در ظروف هفت کیلویی پرگردید و در انکوباتور در دمای 32 درجه سانتیگراد نگهداری شد تا دلمه تشکیل گردد.

پس از اطمینان از آمادگی لخته، دلمهها به آرامی ‌توسط ابزارهای مخصوصی به مکعب‌های حدود 5/1 تا 2 سانتیمتری برش داده شد. به منظور آبگیری لختهها، محتویات درون قالبهای سوراخداری که روی صفحات مشبک قرار داشت ریخته شد و عمل آبگیری به تدریج انجام گرفت. سپس قطعات پنیر در آب نمک 14 درصد قرار گرفت و نمونهها به سردخانه منتقل و در دمای زیر 7 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

تاثیر هاپلوتیپها روی صفات راندمان پنیرسازی و کیفیت پنیر تولیدی

نحوه محاسبه راندمان تولید پنیر، به صورت اندازهگیری وزن شیر و پنیر تولید شده هر تکرار به صورت جداگانه بود. مقدار کمی از پنیر تولید شده هر نمونه برای محاسبه ماده خشک، درصد چربی و درصد پروتئین آن، به آزمایشگاه کنترل کیفی مواد و خوراک دام و طیور استان خراسان رضوی فرستاده شد و مابقی آن در آب نمک 15 درصد نگهداری گردید. آنالیز آماری تاثیر هاپلوتیپها روی صفت عملکرد تولید پنیر و شاخصهای مربوط به کیفیت آن، در نرم افزار SAS به طور جداگانه برای هر یک از صفات مورد نظر در قالب طرح کاملا تصادفی آنالیز و در سطح معنیداری 5% انجام شد.

مده آز

نتایج و بحث

تعیین ژنوتیپ و محاسبه فراوانی ژنی و ژنوتیپی

نمونههای DNA استخراجی از کمیت و کیفیت مناسبی برخوردار بودند. همچنین تکثیر قطعات مورد نظر در هر جایگاه و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی با موفقیت انجام شد. پس از هضم قطعات تکثیر شده، ژنوتیپ هر جایگاه تعیین گردید (شکل 2). برآورد فراوانی آللی، ژنوتیپی، هتروزیگوتی مشاهده شده و مورد انتظار و نیز تعادل هاردی واینبرگ در جدول 3 آورده شده است. همانطور که مشاهده میشود به جز در جایگاه ژن کاپاکازئین، در سایر جایگاهها جامعه در حالت تعادل بود. در پژوهش حاضر فراوانی آلل T و C ژن اوستئوپونتین (OPN) به ترتیب 54/0 و 46/0 برآورد شد. در سایر تحقیقات در نژاد هلشتاین نیز حد متوسط این دو ژن گزارش شده است (Leonard et al., 2009؛ Nasiri et al., 2010؛ Khatib et al., 2007; Pasandideh et al., 2011a ). اما در دو نژاد گاو بومی ترکیه مقدار آلل C کمتر بود (16/0 و 26/0) (Oztabak et al., 2008). فراوانی آللی A و C جایگاه PPARGC1A-A968C 786/0 و 214/0 برآورد گردید. بیشترین فراوانی ژنوتیپی مربوط به AA و کمترین فراوانی مشاهده شده مربوط به ژنوتیپ CC بود، به طوری که تنها دو گاو دارای این ژنوتیپ بودند. بیشتر بودن فراوانی آلل A نسبت به C در پژوهشهای دیگر نیز گزارش شده است (Komisarek et al., 2009؛ Kowalewska et al., 2010؛ Pasandide et al., 2011b) که با نتایج این پژوهش مطابقت داشت اما با نتایج Khatib و همکاران (2007)همسو نبود. فراوانی آللی T و C در جهش T19C موقعیت 1892 اینترون 9 ژن PPARGC1A به ترتیب 379/0 و 621/0 برآورد گردید. بیشتر بودن فراوانی آلل C در این مطالعه با نتایج برخی از پژوهشها مطابقت داشت (Pasandide et al., 2011a؛ Khatib et al.- 2007؛ Schennink et al., 2009؛ Komisarel and Dorynek, 2009) و با برخی دیگر موافق نبود (Kowalewska, 2010). خطیب و همکاران (2007) دلیل خارج بودن جامعه مورد مطالعه از تعادل هاردی-وینبرگ را بیشتر بودن فراوانی ژنوتیپ CC ذکر کردند. این نکته در مورد جمعیت هلشتاین اطراف استانهای تهران و اصفهان نیز مشاهده شد (Pasandide et al, 2010b).


(الف) کاپاکازئین A) Kappa Kasein	(ب) PPARGC1α-T19C B)

(ج) PPARGC1α - A968C C)	د)اوستئوپونتین D) Osteopoetin
شکل 2- انواع ژنوتیپ 4 جایگاه ژنی موردمطالعه. Figure 2- Genotypes of 4 studied loci.

جدول 3- فراوانی آللی، ژنوتیپی، هتروزیگوتی مشاهده شده و مورد انتظار و تعادل هاردی واینبرگ.

Table 3- Allele and genotype frequencies (Freq.), observed (Obs) and expected (Exp.) heterozygosity (Het) and Hardy-Weinberg equilibrium.

ژن Gene	فراوانی Freq.	هموزیگوت Hom.	هتروزیگوت Het.	هموزیگوت Hom.	فراوانی آللی allelic freq.	کای مربع K-square
کاپاکازئین CSN3	مشاهده شده Obs.	AA=0.190	AB=0.350	BB=0.460	A=0.365 B=0.635	6.004^*
کاپاکازئین CSN3	مورد انتظار Exp.	AA=0.130	AB=0.460	BB=0.440	A=0.365 B=0.635	6.004^*
PPARGC1α – T19C	مشاهده شده Obs.	TT=0.164	TC =0.428	CC=0.407	T=0.379 C=0.621	0.7313^ns
PPARGC1α – T19C	مورد انتظار Exp.	TT=0.144	TC=0.471	CC=0.365	T=0.379 C=0.621	0.7313^ns
PPARGC1α -A968C	مشاهده شده Obs.	AA=0.593	AC=0.385	CC=0.022	A=0.786 C=0.214	0.8399^ns
PPARGC1α -A968C	مورد انتظار Exp.	AA=0.617	AC=0.337	CC=0.046	A=0.786 C=0.214	0.8399^ns
اوستئوپونتین	مشاهده شده Obs.	TT=0.230	TC=0.460	CC=0.310	T=0.540 C=0.460	0.5487^ns
اوستئوپونتین	مورد انتظار Exp.	TT=0.210	TC=0.490	CC=0.290	T=0.540 C=0.460	0.5487^ns

^*(p<0.05)

در مطالعه حاضر فراوانی آللی B کاپاکازئین از آلل A بیشتر بود و به ترتیب برابر 648/0 و 352/0 محاسبه شد که با نتایج پژوهشهای انجام شده روی نژاد هلشتاین مطابقت ندارد (Tsiaras et al., 2005؛Alinaghizadeh et al., 2007؛ Rajesh et al., 2007؛ Daniela et al., 2010؛ Mohammadi et al., 2009; Dogru and Ozdemir, 2009). فراوانی آلل B در نژادهای بوس ایندیکوس گلپایگانی 32/0(Zakizadeh et al., 2006) ، مازندرانی 35/0 (Zakizadeh et al., 2006) و سیستانی 36/0 (Alinaghizadeh et al., 2007) و در نژادهای بوس تائوروس سیمنتال 24/0 (Trakovicka et al., 2012)، براون سوئیس 495/0 (Dogru and Ozdemir, 2009) و سرابی 57/0 (Zakizadeh et al., 2006) گزارش شده است. فراوانی این آلل در گاوهای محلی کرمان 30/0 (Mohammadi et al., 2009) و در آمیختههای بوس تائوروس و بوس ایندیکوس برابر 34/0 و کمتر از آلل A گزارش شده است (Rajesh et al., 2007). در پژوهش دیگری که روی پنج نژاد گاو روسی انجام شد، فراوانی آلل B از 16/0 تا 5/0 گزارش گردید (Sulimova et al., 2007).

تفاوتهای مشاهده شده در فراوانی آللی جایگاهها میتواند به دلیل محتوای ژنتیکی متفاوت نژادها و یا تعداد نمونه بررسی شده در تحقیقات مختلف باشد. جمعیت مورد مطالعه در این پژوهش از نظر جایگاههای اوستئوپونتین و PPARGC1A در حالت تعادل بودند اما فراوانی آللی کاپاکازئین متعادل نبود. دلیل این امر میتواند به دلایل نمونهگیری از جمعیت، تلاقیهای غیرتصادفی و یا فشار انتخاب روی تولید شیر باشد.

تاثیر ژنوتیپ روی صفات تولیدی

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در بررسی تاثیر جایگاههای اوستئوپونتین و پروموتور ژن PPARGC1α-A968C با کاپاکازئین روی صفات تولید شیر، درصد چربی و درصد پروتئین هیچگونه ارتباط معنیداری بین ارزش اصلاحی صفات و ژنوتیپها یافت نشد، در حالی که هاپلوتیپ PPARGC1A-T19C و کاپاکازئین با ارزشهای اصلاحی صفت تولید شیر، ارتباط معنیداری را نشان داد، اگرچه روی سایر صفات تاثیر نداشت ((P<0.05. بیشترین و کمترین ارزش اصلاحی مقدار تولید شیر به ترتیب مربوط به ژنوتیپهای هموزیگوت CSN1S3-AA/PPARGC1-TT و CSN1S3-AB/PPARGC1-CC بود (جدول 4). تاثیر سایر جایگاهها روی ارزش اصلاحی صفات مورد بررسی معنیدار نبود (اطلاعات آورده نشده است)

جدول 4- میانگین حداقل مربعات ژنوتیپهایPPARGC1α-T19C و کاپاکازئین با ارزشهای اصلاحی صفت تولید شیر.

Table 4- Least square means of PPARGC1α-T19C and k-casein with breeding values of milk.

ردیف Row	ژنوتیپ Genotype	میانگین ارزش اصلاحی Mean of B.V.	خطای استاندارد SE	احتمال P-value
1	AACC	42.3	158.8	0.791
2	AATC	-97.0	125.6	0.493
3	AATT	1359.2	355.3	0.0002^**
4	ABCC	-147.4	91.7	^**0.0001
5	ABTC	-135.9	102.6	0.934
6	ABTT	-86.1	205.1	0.829
7	BBCC	17.1	94.9	0.649
8	BBTC	36.6	86.2	0.880
9	BBTT	42.7	118.4	0.967

^**معنیدار در سطح احتمال 1%.

مطالعات گذشته بیانگر این مطلب است که آلل C ژن استوپونتین با افزایش درصد چربی (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007) و درصد پروتئین (Leonard et al., 2007؛ Schnabel et al., 2005؛ Khatib et al., 2007) مرتبط است اما برخی گزارشات نیز حاکی از عدم وجود ارتباط بین ژنوتیپهای این ژن با مقدار تولید شیر (Leonard et al., 2007)، مقدار چربی (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007)، درصد چربی (Cohen-Zinder et al., 2005)، مقدار پروتئین (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007)، درصد پروتئین (Cohen-Zinder et al., 2005) و تعداد سلولهای سوماتیک (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007) است. در تحقیقی گزارش شده است اگرچه تاثیر آلل C روی مقدار تولید شیر معنیدار نبود اما تمایل به کاهش مقدار شیر با توجه به همبستگی منفی بین این صفت با درصد پروتئین شیر، منطقی به نظر میرسد (Leonard et al., 2005). گزارش شده است که افراد هتروزیگوت با ژنوتیپ CT نسبت به دو ژنوتیپ دیگر درصد چربی تصحیح شده برای دو بار دوشش و درصد پروتئین تصحیح شده 305 روز بیشتری تولید کردهاند (Pasandideh et al., 2011a).

گزارش شده است که آلل A کاپاکازئین بر خلاف آلل B با افزایش تولید شیر (Matejicek et al., 2007 ؛ Nijole et al., 2007؛ Tsiaras et al., 2005)، درصد پایین پروتئین شیر (Matejicek et al., 2007 ؛ Tsiaras et al., 2005) و افزایش چربی (Nijole et al., 2007؛ Tsiaras et al., 2005) در ارتباط است، اگرچه روی تولید و درصد لاکتوز شیر تاثیر ندارد (Tsiaras et al., 2005). از طرف دیگر، آلل B با کیفیت بالای شیر (Matejicek et al., 2007) مرتبط میباشد. اثر مشابه ژن کاپاکازئین روی اکثر پارامترهای تولیدی، کیفی، انعقادی شیر و اجزای ماده خشک معنیدار گزارش شده است (Matejicek et al., 2007)، اگرچه در برخی پژوهشها چنین تاثیر مشاهده نشده است (Trakovicka et al., 2012).

در تحقیق دیگر ژنوتیپ BB کاپاکازئین با تولید بالای شیر با چربی کم و تولید متوسط پروتئین در ارتباط بود (Rajesh et al., 2007). در مجموع گاوهای با ژنوتیپ BB در مقایسه با ژنوتیپ AA از نظر تولید شیر سودمندتر بوده و میانگین پروتئین و چربی مناسبتری دارند. علیرغم تاثیر منفی که ژنوتیپ BB روی تولید شیر دارد اثر اصلی آن روی چربی و پروتئین شیر و همچنین ترکیب پروتئین شیر است (Nijole et al., 2007). اگرچه بررسیهای گذشته (Matejicek et al., 2007؛ Alinaghizadeh et al., 2007؛ Rajesh et al., 2007؛ Nijole et al., 2007؛ Daniela et al., 2010؛ Dogru and Ozdemir, 2009) ارتباط معنیداری بین ژنوتیپهای کاپاکازئین و به خصوص آلل B با تولید شیر و ترکیبات آن نشان داده است، در این پژوهش ارتباط معنیداری در سطح 95 درصد اطمینان بین ژنوتیپ با ارزش اصلاحی صفات تولید شیر، درصد چربی و درصد پروتئین بدست نیامد اما در بررسی هاپلوتیپ کاپاکازئین و اینترون 9 ژن PPARGC1α با ارزشهای ارثی صفت تولید شیر، ارتباط معنیدار بود (P<0.01). بیشترین و کمترین ارزش اصلاحی تولید شیر برای هاپلوتیپهای AATT و ABCC به ترتیب معادل 2/1359 و 4/147- مشاهده شد.

پژوهش حاضر با نتایج برخی تحقیقات در رابطه با تاثیر چندشکلی A968C ژن PPARGC1α روی تولید شیر (Khatib et al., 2007، Komisawrek et al., 2009؛ Weikard et al., 2004)، درصد چربی (Khatib et al., 2007؛Komisawrek et al., 2009؛ Weikard et al., 2004) و درصد پروتئین (Komisawrek et al., 2009) و همچنین، در مورد ارتباط چندشکلی T19C این ژن با تولید شیر (Khatib et al., 2007، Komisawrek et al., 2009؛ Schennink et al., 2009)، درصد چربی (Khatib et al., 2007، Komisawrek et al., 2009؛ Weikard et al., 2004؛ Schennink et al., 2009) و درصد پروتئین (Khatib et al., 2007؛ Weikard et al., 2004؛ Schennink et al., 2009) مشابهت داشت. در حالی که در تحقیقی دیگر، ارتباط معنیدار بین چندشکلی T19C و تولید چربی شیر یافت شد، اگرچه روی درصد چربی شیر تاثیری نداشت (Weikard et al., 2004). همچنین، نتایج معنیداری از ارتباط بین چندشکلیهای A968C و T19C و میزان عدم برگشت در تلیسهها و اثر کمتری از تاثیر این جایگاه روی تولید پروتئین گزارش شده است (Komisawrek et al., 2009).

تعیین هاپلوتیپها

از میان 8 نوع هاپلوتیپهای (آللهای) محتمل در بررسی توام دو جایگاه چندشکل PPARGC1α و کاپاکازئین (2×2×2)، مشخص شد که 3 هاپلوتیپ (CSN3A- PPARGC1α19C- PPARGC1α 968A/ CSN3B-PPARGC1α19-C-PPARGC1α968A/ CSN3B-PPARGC1α19T-PPARGC1α968A) وجود دارد. برای دو جایگاه اوستئوپونتین و کاپاکازئین، هر 4 نوع هاپلوتیپ (آلل) (CSN3A-OPNC/ CSN3A-OPNT/ CSN3B-OPNC/ CSN3B-OPNT) مشاهده شد. سایر هاپلوتیپهای CSN3A- PPARGC1α19C- PPARGC1α 968C/ CSN3A- PPARGC1α19T-PPARGC1α968A/ CSN3A- PPARGC1α19T-PPARGC1α968C / CSN3B- PPARGC1α19C-PPARGC1α968C/ CSN3B- PPARGC1α19T-PPARGC1α968C مشاهده نشدند؛ اگرچه احتمال وجود آنها به دلیل هتروزیگوت بودن برخی از گاوها رد نمیشود، اما قابل تشخیص نمیباشند. بیشترین فراوانی هاپلوتیپی مربوط به KCN-B/c.3359C (458/0) بود، اما نمونهای با هاپلوتیپ KCN-A/c.3359A دیده نشد (جدول 5).

با توجه به این موضوع که تاثیر ژنهای PPARGC1α و اوستئوپونتین هرکدام جداگانه به همراه ژن کاپاکازئین بررسی شدند، این امکان وجود داشت گاوی که برای هاپلوتیپ PPARGC1α/کاپاکازئین انتخاب میشود، برای هاپلوتیپ اوستئوپونتین/کاپاکازئین نیز انتخاب شود. این امر باعث کم شدن تعداد نمونههای مورد نیاز شد. به همین علت و با توجه به اینکه برخی از هاپلوتیپها در نمونه گرفته شده وجود نداشت، از تعداد 5 راس گاو که دارای ژنوتیپهای مشاهده شده بود، نمونه شیر گرفته شد و پنیر تهیه گردید (جدول 5).

جدول 5- انواع حالتهای ممکن و/یا مشاهده شده آللی در بررسی توام ژنهای PPARGC1α و اوستئوپونتین با ژن کاپاکازئین.

Table 5- Different kinds of possible and/or observed alleles in combined investigation of PPARGC1α and osteopontin with kappa casein.

جایگاه PPARCG1α و کاپاکازئین ^*PPARCG1α and CSN3^*		جایگاه اوستنوپونتین و کاپاکازئین OPN and CSN3
ACA		AC
ACC	چنین گاوی وجود نداشت No such a haplotype	AT
ATA	چنین گاوی وجود نداشت No such a haplotype	BC
BCA		BT
BCC	چنین گاوی وجود نداشت No such a haplotype
BTA

^* از چپ به راست: جایگاههای کاپاکازئین، T19C و A968C ژن PPARCG1α. Left to right: CSN3, A968C, PPARCG1α

با توجه به بررسی جهش موقیتهای اینترون و انتهای ´3 ژن PPARGC1α در این پژوهش، احتمال پیوستگی این دو جایگاه با یکدیگر و همچنین پیوستگی بین هاپلوتیپ آنها با ژن کاپاکازئین، فراوانی هریک از این هاپلوتیپها و مقدار لینکاژ بین آنها جداگانه بررسی گردید. عدم تعادل پیوستگی بین تک شکلیهای نوکلئوتیدی، با استفاده از آماره r² یا ضریب همبستگی دو جایگاه ژنی، برابر 282/0 محاسبه شد که بیانگر عدم تعادل پیوستگی (LD) ضعیف است (جدول 6). با توجه به مقدار r² و بیشتر بودن فراوانی آلل B کاپاکازئین، بالاتر بودن فراوانی هاپلوتیپهای دارای این آلل، دور از انتظار نخواهد بود. در تحقیق دیگری، ضریب r²برای نژاد هلشتاین 86/0 محاسبه شده است (Pasandideh et al., 2011a).

جدول 6- فراوانی انواع هاپلوتیپهای محتمل و بررسی لینکاژ دو جایگاه PPARCG1α و کاپاکازئین.

Table 6- Haplotypes frequencies and linkage of PPARCG1α and CSN3.

کاپاکازئین CSN3	c.3359A>C		c.1892T>C			c.1892T>C/ c.3359A>C
	A=0.75	C=0.25	C=0.542	T=0.458		AT=0.458		AC=0.292		CC=0.250
CSN3-A (0.375)	0	0.250	0.295	0.164		0.165		0.155		0.053
CSN3-B (0.635)	0.292	0.458	0.330	0.211		0.291		0.139		0.195
عدم تعادل گامتی بین دو جایگاه ژن PPARGC1A. Linkage disequilibrium between two loci of PPARGC1A gene
بلوک اول First block		بلوک دوم Second block			D'		LOD		r^2
PPARCG1A-A/C		PPARCG1 α -C/T			1.0		0.76		0.282
CSN3		PPARGC1α (2 loci)			0.19		-		-

تاثیر ژنوتیپ روی کیفیت پنیر

فاکتورهای اندازهگیری شده راندمان تولید و کیفیت پنیر در هر هاپلوتایپ در جدول 7 و نتایج آنالیز واریانس تاثیر هاپلوتیپها روی صفات کیفیت پنیر در جدول 8 آورده شده است. همچنین مشخص شد که اثر ژنوتیپها روی صفات مورد مطالعه کیفیت پنیر، از نظر آماری در سطح 95 درصد اطمینان، معنیدار نبود (جدول 8).

خواص لخته شدن تاثیر بسزایی روی تولید و کیفیت پنیر دارد، به طوریکه در شیر با خواص مطلوب پنیرسازی، مدت زمان انعقاد و تشکیل لخته کوتاهتر و استحکام لخته نیز بیشتر است. این مرحله از آن جهت اهمیت دارد که بسیار حساس بوده و اولین مرحله در ساخت پنیر است و روی مراحل بعدی پنیرسازی تاثیر میگذارد (Comin et al., 2008؛ Kubarsep et al., 2005). در تحقیق حاضر، ژنوتیپ جایگاههای مورد مطالعه تاثیر معنیدار روی راندمان تولید پنیر و ویژگیهای کیفی پنیر تولیدی نشان نداد اما سایر پژوهشها حاکی از این مطلب است که انواع ژنوتیپ بتاکازئین، کاپاکازئین و بتالاکتوگلوبولین روی زمان لخته شدن مایه پنیر (Comin et al., 2008؛ Penasa et al., 2010؛ Kubarsep et al., 2005) و استحکام دلمه تاثیر دارد (Penasa et al., 2010). گزارش شده است که بهترین ژنوتیپ از نظر زمان لخته شدن هنگامی است که حداقل یک آلل B در این دو جایگاه وجود داشته باشد (Comin et al., 2008). در تحقیقی روی گاوهای استونی گزارش شده است که خواص لخته شدن با آنزیم مایه پنیر در ژنوتیپ BB از ژن کاپاکازئین بسیار بهتر از ژنوتیپ AA بود و درصد نمونههای شیر لخته نشده کمتری وجود داشت، همچنین با بالا رفتن فراوانی آلل B کاپاکازئین در نژادهای بومی، خواص لخته شدن مایه پنیر بهتر شد (Kubarsep et al., 2005).

جدول 7- میانگین فاکتورهای اندازه گیری شده هر هاپلوتیپ در آزمایشات پنیرسازی.

Table 7- Mean of cheese parameters measured for haplotypes (Hap.).

شماره گاو Cow	هاپلوتیپŦ Hap.	%چربی شیر Milk %F	%پروتئین شیر Milk %P	وزن شیر Milk weight	وزن پنیر Cheese weight	راندمان پنیرسازی efficiency	ماده خشک Dry matter	% چربی پنیر Cheese %F	%پروتئین پنیر Cheese %P
402	AT	3.32	3.44	7.29	1.09	6.68	49.51	46.07	35.24
459	AC	3.15	3.33	7.19	1.18	6.07	46.03	42.83	32.99
447^*	BC BTA	2.77	3.17	7.36	1.10	6.66	42.31	35.43	40.77
515^*	BT BCA	3.77	3.68	7.10	1.19	6.05	44.03	41.47	35.21
461	ACA	3.67	3.82	6.66	1.13	5.94	46.05	43.50	36.07

Ŧهاپلوتیپهای دوحرفی بیانگر دو ژن اوستئوپونتین و کاپاکازئین و 3 حرفیها برای دو جهش مربوط به PPARGC1α و کاپاکازئین درنظر گرفته شده اند. ترتیب حروف هاپلوتیپها از چپ به راست به ترتیب کاپاکازئین، موقعیت T19C و 968AC میباشد.

ŦTwo alphabetic haplotypes means OPN and CSN3 genes and 3-alphabetic considered for 2 mutations of PPARGC1A and CSN3. The orders of haplotypes are CSN3, T19C and 968AC, respectively.

^* این گاو دارای هر دو نوع هاپلوتیپ مورد نظر در جایگاههای PPARGC1A‌و اوستنوپونتین بودند.

^* These cows carry both of the desirable haplotypes in PPARGC1A and osteopontin.

جدول 8- تجزیه واریانس (ANOVA) صفات مربوط به پنیرسازی.

Table 8- Analysis of variance for cheese traits.

منبع تغییر S.O.V.	درجه آزادی df	مجموع مربعات (Least square)
منبع تغییر S.O.V.	درجه آزادی df	راندمان efficiency	ماده خشک Dry matter	درصد چربی %F	درصد پروتئین %P
تیمار Treatment	4	1.565	86.816	188.369	98.934
باقیمانده Residual	10	1.891	360.595	330.027	188.704
احتمال P-value	---	0.160	0.670	0.295	0.331

بهبود ژنتیکی خواص انعقادی شیر، راه شناخته شدهای است که راندمان تولید پنیر را بهبود میدهد، اما به دلیل فقدان تجهیزات مناسب برای تعیین و رکوردبرداری منظم این صفات، امکان استفاده مستقیم از آنها در انتخاب دامها برای این صفات محدود است. لذا یک راه غیرمستقیم میتواند انتخاب به نفع ژنوتیپهای مطلوب و در نتیجه بالا بردن فراوانی آللهای مطلوب در جایگاههای موثر بر پروتئینهای شیر باشد که با پارامترهای موثر بر پنیرسازی مرتبط هستند.

نتیجه گیری و پیشنهادات

گزارشات متعددی از تاثیر چندشکلی در نواحی مختلف ژن، اعم از جایگاههای اینترون، اگزون و یا سایر نواحی غیرقابل ترجمه بالا دست یا فرودست ژن، روی محصول ژنتیکی و یا فراوردههای آن وجود دارد. به همین علت، در بررسیهای همزمان تاثیر چند جایگاه روی صفات تولیدی و به دلیل احتمال پیوستگی که بین برخی از جایگاهها به دلیل قرارگیری روی یک کروموزوم وجود دارد، مبحث توارث همزمان آنها و/یا وقوع کراسینگ اور مطرح میشود. در این رابطه میتوان تاثیر جایگاههای چندشکلی شناخته شده در داخل یک ژن روی صفات را به دلیل بالا بودن عدم تعادل پیوستگی بین آنها و یا عدم تعادل پیوستگی احتمالی این جایگاهها با نواحی شناخته نشده داخل ژن نسبت داد (Pasandideh et al. 2011). در پژوهش حاضر، مقدار عدم تعادل پیوستگی بین جایگاههای بررسی شده کم بود، لذا احتمال وقوع کراسینگ اور و پیدایش ترکیبات جدید ژنی وجود داشت. در چنین شرایطی، بالا بودن تعداد نمونه مورد بررسی میتواند منجر به مشاهده شدن تمام ترکیبات ژنوتیپی شود. همچنین استفاده از روشهای پیشرفته شناسایی SNPهای متراکم، جهت شناسایی دقیقتر ژنهای موثر بر صفات مطلوب خواهد بود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله محققین بر خود لازم میدانند تا از مسوولان محترم مجتمع آموزش جهاد کشاورزی خراسان رضوی به ویژه آقای مهندس زرقی بابت تهیه نمونههای خون و آقای مهندس زارع به جهت همکاری در تهیه پنیر در پایلوت تحقیقاتی شیر، کمال تشکر و قدردانی را بنمایند. مراحل ژنتیک ملکولی پژوهش در آزمایشگاه بیوتکنولوژی گروه علوم دامی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کاشمر انجام شد که بدینوسیله از همکاری حوزه معاونت محترم پژوهشی دانشکده سپاسگزاری میشود.

منابع

Alinaghizadeh R, Mohammad Abadi MR, Moradnasab Badrabadi S (2007). Kappa-casein Gene study in Iranian Sistani Cattle Breed (Bos indicus) Using PCR-RFLP. Pakistan Journal of Biological Sciences 10: 4291-4294.

Barrett, J C, Fry b, Mller J, Daly M J (2005). Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps, Bioinformatics. 21: 263-265.

Bonfatti, V., Di Martino G., Cecchinato A., Degano L., Carnier P (2010). Effects of β-κ-casein (CSN2-CSN3) haplotypes, β-lactoglobulin (BLG) genotypes, and detailed protein composition on coagulation properties of individual milk of Simmental cows. J. Dairy Sci. 93:3809-3817.

Buchberger, J., Dovc, P (2000). Lactoprotein Genetic Variants in Cattle and Cheese Making Ability.Food technol. biotechnol. 38: 91–98.

Cohen-Zinder, M, Seroussi E, Larkin DM, Loor JJ, Evertsvan der Wind A, Lee JH, Drackley JK, Band MR, Hernandez AG, Shani M, Lewin HA, Weller JI, Ron M (2005). Identification of a missense mutation in the bovine ABCG2 gene with a major effect on the QTL on chromosome 6 affecting milk yield and composition in Holstein cattle. Genome Research 15: 936–944.

Comin M, Cassandro S, Chessa M, Ojala R, Dal Zotto M, De Marchi P, Carnier L, Gallo G, Pagnacco, Bittante G. (2008). Effects of Composite β- and κ-Casein Genotypes on Milk Coagulation, Quality, and Yield Traits in Italian Holstein Cows. J. Dairy Sci. 91: 4022–4027.

Daniela E. Ilie, Aurelia Sălăjeanu, Anuţa Magdin, Radu Neamţ, I. Vintila. (2010). Early Determination of Animals with Favorable Genes in Milk Production for Profitable Private Farms. Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies. 43: 279- 282.

Dogru U, Ozdemir M. (2009). Genotypin of Kappa casein Locus by PCR-RFLP in Brown Swiss cattle Breed. Journal of Animal and Veterinary Advances 8: 779-781, 2009.

Ghods Rohani M (2006). The principle of milk processing and dairy products. Agricultural research, Education and Extension Organization (AREEO). Iran.

Ghods Rohani M (2008). Principle of milk chemistry. Sanabad Publisher. Iran.

Javanrouh A, Banabazi M.H, Esmaeilkhanian S, Amirinia C, H.R. Seyedabadi and H. Emrani. (2006). Optimization on salting out method for DNA extraction from animal and poultry blood cells. Proc. of 57^th Annual Meeting of the European Association for Animal Production. August 21-25, 2006. Antalya, Turkey.

Khatib H, Huang W, Wang X, Tran A. H., Bindrim A B, Schutzkus V, Monson R L, Yandell B S (2009). Single gene and gene interaction effects on fertilization and embryonic survival rates in cattle. J. Dairy Sci. 92: 2238–2247.

Khatib H, Zaitoun I, Wiebelhaus-Finger J, Chang YM, Rosa GJM. (2007). The association of bovine PPARGC1A and OPN genes with milk composition in two independent Holstein Cattle populations. J. Dairy Science. 90: 2966–2970.

Killian, G. (2010). Physiology and endochrinology symposium: Evidence that oviduct secretions influence sperm function: A retrospective view for livestock. J Animal Science 89: 1315-1322.

Komisarek J. Dorynek Z (2009). Effect of ABCG2, PPARGC1A, OLR1 and SCD1 gene polymorphism on estimated breeding values for functional and production traits in Polish Holstein-Friesian bulls. J Applied Genetics 50: 125–132.

Kowalewska IV, Kulig H, Kmiec M (2010). Associations between the bovine PPARGC1A gene and milk production traits. Czech J. Animal Science, 55: 195-199.

Kűbarsep I, Henno M, Viinalass H, Sabre D (2005). Effect of κ-casein and β-lactoglobulin genotypes on the milk rennet coagulation properties. Agronomy Research. 31: 55-64.

Leonard S, Khatib H, Schutzkus V, Chang YM, Maltecca C (2005). Effects of the osteopontin gene variants on milk production traits in dairy cattle. J. Dairy Science 88: 4083–4086.

Matejicek A, Matejickova J, Němcova E, Jandurova OM, Stipkova.M, Bousk J, Frelich J (2007). Joint effects of CSN3 and LGB genotypes and their relation to breeding values of milk production parameters in Czech Fleckvieh.Czech J. Animal Science 52: 83–87.

Mohammadi A., Mohammadabadi M. R., Mirzaei H. R., Baghizadeh A, Dayani O, Asadi M, Bahrampour V (2009). Study of Kappa-Casein gne in local and Holstein in Kerman provinc by PCR-RFLP. Journal of Agricultural Sciences and Natural Resources. 16: 125-132.

Nasiri K, Salehi A, Aminafshar M, Sayaadnezad MB, Namvar Z, Sobhani R (2010). Polymorphism of OPN Gene in the Iranian Holstein Bulls. Proc. of 4th congress of Iranian animal science. Sep. 3-5, 2010. Karaj, Iran. pp. 2870-2874.

Nijolė P, Miceikienė I, Mišeikienė R, Krasnopiorova N, Kriauzienė J (2007). Genetic factors influencing milk production traits in Lithuanian dairy cattle breeds. Žemesukiomokslay. 14: 32–38.

Oztabak K, Un J, Tesfaye D, Akis I, Mengi A (2008). Genetic polymorphisms of osteopontin (OPN), prolactin (PRL) and pituitary-specific transcript factor-1 (PIT-1) in South Anatolian and East Anatolian red cattle. Acta Agriculturae Scand Section A. 58: 109-112.

Pasandideh M., Mohammadabadi M.R., Tarang A., Esmaili A (2011, a). Association of singel nucleotide polymorphism C>T of OPN gene and milk production and composition in Iran Holstein cattle. Iranian J. Anim. Sci. 42: 199-205.

Pasandideh M., Mohammadabadi M.R., Tarang A., Esmaili A., Sayghalani R., Ansari S., Pasandideh R (2011, b). An association between T/C and A/C single nucleotide polymorphisms of PPARGC1A gene and milk production and composition in Iran Holstein cattle. Modern Genetics Journal 6: 15-23.

Pasandideh M (2010). A Analysis of bovine PPARGC1A gene polymorphism (to position 1892T>C) in Iran Holstein cattle populations. Proc. of 4^th congress of Iranian Animal Science. Sep. 3-5, 2010. Karaj, Iran. pp. 2843-2847.

Penasa, M., Cassandro M, Pretto D, De Marchi M, Comin A, Chessa A, Dal Zotto R, Bittante G (2010). Influence of composite casein genotypes on additive genetic variation of milk production traits and coagulation properties in Holstein-Friesian cows. J. Dairy Science 93: 3346–3349.

Rajesh K Patel, Jenabhai B. chauhan, Krishna M. singh, Kalpesh J. Soni (2007). Allelic Frequency of Kappa-Casein and Beta-Lactoglobulin in Indian Crossbred (Bos taurus × Bos indicus) Dairy Bulls. Turkish Journal Veterinary Animal Science 31: 399-402.

SAS (2002). Statistical Analysis System Institute. Users Guide Version 9 for Windows. Cary North Carolina USA.

Schaar, J., Hansson B, Pettersson H-E (1985). Effects of genetic variants of κ-casein and β-lactoglobulin on cheesemaking. J. of Dairy Research 52: 429-437.

Schennink, A, Bovenhuis H, Le´on-Kloosterziel KM, Van Arendonk JAM, Visker MHPW (2009). Effect of polymorphisms in the FASN, OLR1, PPARGC1A, PRL and STAT5A genes on bovine milk-fat composition. Animal Genetics 40: 909-916.

Schnabel RD, Kim JJ, Ashwell MS, Sonstegard TS, Van Tassell CP, Connor EE, Taylor JF (2005). Fine-mapping milk production quantitative trait loci on BTA6: Analysis of the bovine osteopontin gene. Proceeding of the National Academy Science 102: 6896–6901.

Schopen GCB, Visker MHPW, Koks PD, Mullaart E, Van Arendonk JAM, Bovenhuis H (2011). Whole-genome association study for milk protein composition in dairy cattle. J. Dairy Science 94 :3148–3158.

Sulimova G.E., Ahani Azari M, Rostamzadeh J, Mohammad Abadi M.R., Lazebny O.E (2007). κ-casein gene (CSN3) allelic polymorphism in Russian cattle breeds and its information value as a genetic marker. Russian Journal of Genetics 43: 73-79.

Trakovicka A, Moravcikova N, Navratilova A (2012). Kappa-Casein gene polymorphism (CSN3) and it effect on milk production traits. Acta fytotechnica et zootechnica. 3: 61-64.

Tsiaras AM, Bargouli GG, Banos G, Boscos CM. (2005). Effect of Kappa-Casein and Beta-Lactoglobulin Loci on Milk Production Traits and Reproductive Performance of Holstein Cows. J. Dairy Science 88: 327–334.

Wedholm, A., Larsen, L.B., Lindmark-Månsson H, Karlsson, A.H., Andrén, A (2006). Effect of Protein Composition on the Cheese-Making Properties of Milk from Individual Dairy Cows. J. Dairy Sci. 89: 3296-3305

Weikard R, Kűhn C, Goldammer T, Freyer G, Schwerin M (2004). The bovine PPARGC1A gene: molecular characterization and association of an SNP with variation of milk fat synthesis. Physiological Genomics 21: 1-13.

Zakizdeh S, Rahimi G, Nejati-Javaremi A, Reissmann M, Miraee-Ashtiani S M, Moradi M, Reinecke P (2006). Analysis of Kappa casein polymorphism in three Iranian native cattle and Holstein breeds by PCR-RFLP. 2006. Proc. of the British Society of Animal Science. March 2006. York, UK. pp. 89.

Association of the SNPs on CSN3, PPARGC1αand OPN genes with milk production traits and efficiency of cheese in Brown Swiss breed

Zakizadeh S.*¹, Hashemi M.J.², Gholami H.², Ghods Rohani M.³, Vakili R.⁴

^1,3Assistant Professors of Animal Science and Food Science Departments, Higher Applied Science Technology Institute

^2,4 Graduated students and Assistant Professor of Islamic Azad University, Branch of Kashmar.

Abstract

Milk is considered as a complete food to meet parts of human daily requirements for a long time. Proteins are one of the most important ingredients of milk and play a critical role in processing technology such as cheese factory. Several factors such as genetics influence on quantity and quality of milk as well as cheese. Several genes on BTA6 are recognized to be related to milk and cheese related traits. In the current study the genetic association of three candidate genes of the region including; Osteopontin, PPARGC1α, and Kappa casein with milk and cheese related traits, were investigated in Brown Swiss cattle. Total DNA was extracted from 100 cattle by salting out procedure. Genotypes frequencies were estimated by PCR-RFLP and using specific enzymes. Four factors of efficiency fat, protein and dry matter of cheese were measured. Association between polymorphisms and breeding values and cheese quality were analyzed by GLM procedure at 5% of significant level. The results showed that the population was in Hardy-Weinberg equilibrium, except Kappa Casein locus. Significant effect was observed only in combined genotype of PPARGC1A-T19C and kappa casein with breeding values of milk production. Because of the limited samples or missing of some haplotypes, genotypes had no effect on cheese production. The increasing of the samples to demonstrate other genetic combination and using modern techniques such as dense SNPs are strongly recommended.

Key words: Milk and cheese production traits, Polymorphisms, Association, CSN3, PPARGC1α, OPN.

* نویسنده مسئول: سونیا زکی زاده تلفن: 051138717071 Email: Sonia_zaki@yahoo.com

[1] bone sialoprotein I (BSP-1 or BNSP)

[2] secreted phosphoprotein 1 (SPP1)

[3] T-lymphocyte activation (ETA-1)

[4] Generalized Linear Model (GLM)

* Corresponding Author: Zakizadeh S. Tel: 051138717071 Email: Sonia_zaki@yahoo.com

مراجع