تشخیص تعدادی از عوامل باکتریایی سقط جنین در گوسفند افشاری با استفاده ازReal Time PCR و تعیین حساسیت آغازگر مربوط به کمپیلوباکتر

 معصومه صالح¹، محمد طاهر هرکی نژاد*²، وحید سلمانی³

¹دانش آموخته دانشکده کشاورزی دانشگاه زنجان

² استادیار دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری های نوین زیستی و دانشگاه زنجان  

³  پژوهشکده فناوری های نوین زیستی دانشگاه زنجان

تاریخ دریافت: 17/02/1392، تاریخ پذیرش: 22/08/1392

چکیده

ارایه روشی مناسب برای تشخیص سریع و دقیق باکتری­های مولد بیماری سقط جنین از اولویت­های کنترل و درمان به موقع این بیماری است. هدف از این تحقیق بهینه کردن یک روش مبتنی بر Real Time PCR به صورت همزمان برای چهار باکتری­ مهم مولد سقط جنین (کمپیلوباکتر، بروسلا، یرسینیا و سالمونلا) بود. تعداد 217 نمونه سواب واژینال (132 نمونه از دام­های سقط کرده و 85 نمونه از دام­هایی که بره­های سالم به دنیا آوردند) از گوسفند­های استان زنجان گرفته شده و برای سه باکتری سالمونلا، یرسینیا و بروسلا نیز نمونه­های خالص آن­ها از مرکز جمع­آوری قارچ­ها و باکتری­های صنعتی ایران PTCC خریداری شد. پس از استخراج DNA، آغازگر های اختصاصی بروسلا، سالمونلا و یرسینیا بر روی نمونه DNA باکتری­های خریداری شده مورد بررسی قرار گرفتند و پس از مشخص شدن کمپیلوباکتر به عنوان عامل سقط جنین در تعدادی از نمونه­های استان زنجان (68 نمونه مثبت از 132 دام سقط کرده و 29 نمونه از 85 دام سالم)، دقت آغازگر کمپیلوباکتر در رقت­های مختلف با استفاده از Real Time PCR نیز سنجیده شد. نتایج این بررسی نشان داد که همه باکتری­ها در شرایط یکسان با آغازگرهای اختصاصی خود به صورت همزمان با Real Time PCR قابل تکثیر بوده و آغازگر کمپیلوباکتر نیز در تمام رقت­های ایجاد شده حتی تا یک کپی از ژنوم هم قادر به تشخیص و تکثیر باکتری بوده است.

کلمات کلیدی: Real Time PCR، کمپیلوباکتر، سقط جنین، گوسفند افشاری.

مقدمه

یکی از مسایل عمده در صنعت دامپروری که دامپزشکان و دامداران در رابطه با بیماری­های گوسفند و بز با آن مواجه­اند، سقط جنین می­باشد. سقط جنین که از عوامل مهم واصلی زیان­های اقتصادی در گله­های گوسفند و بز به حساب می­آید، توسط چندین عامل عفونی و غیرعفونی ایجاد می­گردد (Striaton, 1998). باکتری­ها مهمترین علت سقط جنین­های عفونی در دام­های اهلی هستند (Sadeghi et al., 2008; Agerholm et al., 2006). تشخیص بسیاری از این باکتری­ها اغلب مبتنی بر جدا سازی باکتری با استفاده از کشت نمونه از افراد مشکوک به بیماری و یا تعیین تیتر آنتی بادی ویژه مربوط به بیماری بوده است که هر یک مشکلات و محدودیت­هایی دارند. امروزه استفاده از روش­های مبتنی بر اسیدهای نوکلئیک در تشخیص بیماری­ها جایگاه ویژه­ای پیدا کرده است. انجام آزمایش­ها با استفاده از PCR  به دلیل آنکه مبتنی برتشخیصDNA  باکتری است و با توجه به اینکه مستقیما قادر به تشخیص باکتری عامل بیماری است، برای تصمیم­گیری در مورد راه حل مناسب، برای مواجهه با بیماری ارجحیت ویژه­ای دارد (Hajia et al., 2007; Ghosian Moghadam et al., 2008; Maleknejad et al., 2007; Mohammadabadi et al., 2004; Mohammadabadi et al., 2011). در یک بررسی بر روی تشخیص کمپیلوباکتر در 105 جنین سقط شده گاو در ترکیه از چهار روش ایمنوهیستوشیمیایی، پاتولوژی، میکروبیولوژی و PCR Real- Time روش PCR Real- Time بهترین و دقیقترین روش با بیشترین تعداد نمونه مثبت شناخته شد (Tuzcu et al., 2010). در این مطالعه هدف، بهینه کردن Real Time PCR برای تشخیص همزمان چهار باکتری کمپیلوباکتر[1]، بروسلا[2]، یرسینیا[3] و سالمونلا[4] بود که پس از تشخیص کمپیلوباکتر به عنوان عامل سقط جنین در استان زنجان تست حساسیت این باکتری نیز در تعدادی از نمونه­های مثبت مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

نمونه­گیری

تعداد 217 نمونه سواب واژینال (132 نمونه از دام­های سقط کرده و 85 نمونه هم از دام­هایی که بره­های سالم به دنیا آوردند) از گوسفند­های استان زنجان گرفته شده و برای سه باکتری­ (سالمونلا، یرسینیا و بروسلا) نیز نمونه­های خالص آن­ها از مرکز جمع­آوری قارچ­ها و باکتری­های صنعتی ایران PTCC^[5] خریداری شد.

استخراج DNA

استخراج DNA از سواب­های واژینال میش­های زنجان و همچنین باکتری­های بروسلا، سالمونلا و یرسینیا با استفاده از خالص سازی فنل­کلروفرم انجام گرفت. به طور خلاصه نمونه­های سواب موجود در میکروتیوب­های 2 میلی لیتری ذوب شده و یک میلی لیتر از بافر STD (Tween20% 5/0M MgCl₂.6H₂0,0025/0 M KCl,05/0 M Tris-HCl [pH 8.3],01/0). به آن­ها اضافه گردید. نمونه­ها به مدت یک دقیقه در ×g 16000 سانتریفیوژ شده و رسوب حاصل در 200 میکرولیتر از بافر TE (Tris- EDTA) حاوی 10 درصد SDS (Sodium Dodecyl Solfate) حل شد. نمونه­ها به مدت یک ساعت در 56 درجه سانتی­گراد انکوبه شده و نهایتا  DNA نمونه­ها با خالص سازی فنل کلروفرم استخراج شدند.

طراحی آغازگر

برای طراحی اختصاصی آغازگرها، توالی های گرفته شده برای باکتری ها­ی مختلف از سایت NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)توسط نرم افزار ClC Main Workbench مقایسه^[6] گشته و آغازگرهای پیشرو و پیرو از قسمت­های متغیر^[7] توالی­ها طراحی شدند. این آغازگرها پس از طراحی توسط نرم افزارهای Fast PCR (برای بررسی دایمر)، Mfold (برای بررسی تاخوردگی^[8] آغازگر ) و Blast (برای تست اینکه آیا آغازگر، توالی­های مشابه یا DNA موجود دیگر را تکثیر می کند یا خیر ؟ ) مورد بررسی قرار گرفتند. آغازگر­ها در جدول زیر آورده شده­اند.

PCR معمولی و الکتروفورز نمونه­ها

واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 50 میلی مولار KCl، 20 میلی مولار (3/8pH=) Tris-HCl، دو میلی­مولار MgCl2، 1/0 درصد Tween20، 200  میکرومولار از هر dNTP ، 25/1 میکرومولار از هر آغازگر و 8/0 واحد Taq Enzyme انجام گرفت. پس از واسرشته­سازی اولیه به مدت پنج دقیقه و در دمای ˚C95، 30 سیکل به صورت ˚C95 (برای واسرشته سازی به مدت یک دقیقه) ، ˚C52 تا˚C55 (برای اتصال پرایمر به مدت یک دقیقه) و ˚C72 (برای بسط و تکثیر به مدت یک دقیقه) انجام شده و در نهایت یک بسط نهایی در دمای ˚C72 به مدت پنج دقیقه انجام گردید. سپس نمونه­ها برای اطمینان از تکثیر باند مربوطه بر روی ژل آگارز 3/1 درصد الکتروفورز شدند.

PCR Real Time

برای انجام واکنش های PCR Real Time از دستگاه Rotor- Gene (مدل 3000 ساخت کمپانی (Corbett Research استفاده شد. برای تکثیر هر یک جفت آغازگر، یک مخلوط اصلی (همه مواد واکنش به استثنای DNA) تهیه گردید. حجم نهایی هر واکنش 25 میکرولیتر تنظیم گردید. لیست اجزای به کار رفته در واکنش به همراه غلظت نهایی آن­ها در جدول 2-4 آمده است.

جدول 1- خصوصیات آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش.

Table 1- The characteristics of used primers in this study.

جدول 2- مواد مورد استفاده جهت واکنش Real Time PCR.

Table 2- Used materials for the Real Time PCR.

بررسی حساسیت آغازگر مربوط به باکتری کمپیلوباکتر با استفاده از Real time PCR

به جز PCR معمولی، آغازگرهای تشخیص دهنده باکتری کمپیلوباکتر با استفاده ازPCR Real time و به منظور بررسی حساسیت آغازگر مربوطه نیز مورد بررسی قرار گرفتند. به این صورت که یکی از محصولات PCR تکثیر شده برای این باکتری، نانودراپ شده و با توجه به غلظت به دست آمده و طول قطعه، تعداد باکتری در هر میکرولیتر (copy number) بافر محاسبه گردید سپس از این مخلوط PCR با تعداد باکتری­های مشخص رقت­های مختلف از ¹⁰ 10 تا یک نسخه از باکتری تهیه گردید پس از انجام Real time PCR در تعدادی از این رقت ها مشخص گردید که آغازگرهای مورد نظر قدرت تشخیص این باکتری را در هر رقت از باکتری دارند و همه رقت های باکتری مورد نظر منحنی تکثیر را با توجه به غلظت­شان نشان دادند. در نهایت منحنی استاندارد برای مقایسه رقت­های مختلف و همچنین به دست آوردن غلظت نمونه­های دیگر در C_tهای مشخص رسم گردید.

تهیه منحنی استاندارد به منظور برآورد کارایی واکنش

ابتدا نمونه­ای از DNA باکتری (استخراج شده از نمونه­های سقطی میش­های افشاری) مورد نظر توسط PCR تکثیر شده و سپس یک سری از رقت­های شناخته شده DNA مورد نظر(محصولات PCR) برای تهیه منحنی استاندارد و تخمین مقدار آغازین DNA مورد نظر برای ارزیابی کارایی واکنش به­کار رفت. لگاریتم غلظت شناخته شده از هر سری رقت محور x­ها بر غلظت ارزش واحد  C_tبرای آن غلظت رسم شد.

کاربرد منحنی استاندارد حاصل از واکنش Real time PCR

جهت به دست آوردن غلظت نمونه­های مجهول بر حسب مقادیر C_t، از ژن 16s rRNA کمپیلو باکتر پس از تعیین تعداد کپی ها و تهیه رقت های مختلف و منحنی استاندارد به دست آمده با ضریب تبیین 85/0 به بالا استفاده گردید.

محاسبه تعداد نسخه­های توالی باکتری

برای به دست آوردن تعداد نسخه های باکتری در یک میکرو لیتر، غلظت محصول مورد نظر به همراه طول قطعه تکثیر شده با استفاده از لینک calculator for determining the number of copies of tempelet (cels.uri.edu/gsc/cndna.html‎) محاسبه شده و رقت­های مختلف ایجاد گردید.

نتایج و بحث

نتایج PCR معمولی

پس از انجام PCR برای نمونه­های DNA موردنظر در استان زنجان 68 مورد از 132 نمونه گرفته شده از میش­های سقط­کرده و با بره ناقص (9/51 درصد) و همچنین 20 مورد از 85 نمونه دام­هایی که بره­های سالم بدنیا آورده بودند دارای نتایج PCR مثبت برای کمپیلوباکتر بودند (52/23 درصد) (شکل 1) که یکی از این نمونه­های مثبت برای تست حساسیت استفاده گردید. در بررسی این نمونه­ها با آغازگرهای سالمونلا، بروسلا و یرسینیا هیچ مورد مثبتی یافت نشد و هر یک از DNA باکتری­های خریداری شده به خوبی با آغازگر اختصاصی خود تکثیر یافتند (شکل 2).

نتایج توالی­یابی برای قطعه تکثیر شده با پرایمرهای مربوط به کمپیلوباکتر

 قطعه تکثیر شده توسط جفت پرایمر اختصاصی برای جنس کمپیلوباکتر یک قطعه bp 266 برای ژن srRNA 16بود (شکل 1). که پس از تکثیر، از روی ژل آگارز استخراج و خالص سازی شده و با استفاده از سیستم  ABI 3730XL DNA Analyzer Bioneer کره جنوبی توالی­یابی شد (شکل 3). عمل تطابق (Blast) برای توالی خوانده شده با توالی­های موجود در پایگاه داده­های بیولوژیکی NCBI انجام شد که این توالی100 درصد مشابهت را با توالی ژنs rRNA 16 گونه­های مختلف کمپیلوباکتر نشان داد. سپس توالی خوانده شده با ژن s rRNA 16 که طراحی پرایمر از روی آن انجام شد مورد مقایسه (Alignment) با برنامه VECTOR NTI قرار گرفت (شکل 4). به طور کلی نتایج توالی­یابی، یافته­های مارا برای وجود کمپیلوباکتر تایید نمود.

شکل 1- تکثیر اختصاصی DNA هدف با استفاده از PCR و آغازگرهای اختصاصی جنس کمپیلوباکتر و چاهک­ها به ترتیب، a:DNA Ladder 100 bp ، b: کنترل منفی، c: نمونه دام سالم، d، e و f نمونه­های سقطی که باند مربوط به کمپیلوباکتر را نشان داده­اند (در نمونه کنترل منفی به جای DNA، از آب مقطر استریل استفاده شد).

Figure 1- Specific amplification of target DNA by PCR and specific primers for Campylobacter and lans respectively: a: DNA Ladder 100 bp. b: negative control. c: healthy samples. d, e and f: aborted samples that were positive for campylobacter (in negative control was used of sterile distilled water instead DNA).

شکل 2- باندهای مربوط به تکثیر کنترل مثبت باکتری­ها. bru: باکتری بروسلا، yer: باکتری یرسینیا و sal: سالمونلا.

Figure 2- bands related to amplification of bacteria positive controls. bru: Brucella, yer: Yersinia and sal: Salmonella.

GGGGAAATAAGGAGCACATGACGTACATCACGCGCTGGCAGCGCTACAGTGTACTACGGAGACGTCGCAAGCGTTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGACGCGTAGGCGGATTATCAAGTCTTTTGTGAAATCTAATGGCTCAACCATTAAACTGCTTGAGAAACTGATAATCTAGAGTGAGGGAGAGGCAGATGGAATTGGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCACCAGGAATACCCATTGCGA

شکل 3- نتایج توالی­یابی برای محصول PCR پرایمرهای اختصاصی کمپیلوباکتر با خوانش از سر Forward

Figure 3- The results of sequencing for PCR product of specific primers for Campylobacter with the reading of the forward.

                 1                                               50

    Cam 2    (1) TTTTGTTAGGGAAGAACCATGACGGTACCTAACGAATAAGCACCGGCTAA

 CAM-NCBI    (1) TTTTCTTAGGGAAGAAATTTGACGGTACCTAAGGAATAAGCACCGGCTAA

Consensus    (1) TTTT TTAGGGAAGAA   TGACGGTACCTAA GAATAAGCACCGGCTAA

                 51                                             100

    Cam 2   (51) CTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAA

 CAM-NCBI   (51) CTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAA

Consensus   (51) CTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAA

                 101                                            150

    Cam 2  (101) TCACTGGGCGTAAAGGACGCGTAGGCGGATTATCAAGTCTTTTGTGAAAT

 CAM-NCBI  (101) TCACTGGGCGTAAAGGACGCGTAGGCGGATTATCAAGTCTTTTGTGAAAT

Consensus  (101) TCACTGGGCGTAAAGGACGCGTAGGCGGATTATCAAGTCTTTTGTGAAAT

                 151                                            200

    Cam 2  (151) CTAATGGCTCAACCATTAAACTGCTTGAGAAACTGATAATCTAGAGTGAG

 CAM-NCBI  (151) CTAATGGCTCAACCATTAAACTGCTTGAGAAACTGATAATCTAGAGTGAG

Consensus  (151) CTAATGGCTCAACCATTAAACTGCTTGAGAAACTGATAATCTAGAGTGAG

                 201                                            250

    Cam 2  (201) GGAGAGGCAGATGGAATTGGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCAC

 CAM-NCBI  (201) GGAGAGGCAGATGGAATTGGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCAC

Consensus  (201) GGAGAGGCAGATGGAATTGGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCAC

                 251                                            300

    Cam 2  (251) CAGGAATACCCATTGCGA

 CAM-NCBI  (251) CAGGAATACCCATTGCGA

Consensus  (251) CAGGAATACCCATTGCGA                               

شکل 4- مقایسه (alignment) توالی موجود برای ژن rRNA s16 در سایت NCBI و توالی تکثیر شده برای کمپیلوباکتر در این پژوهش

Figure 4- alignment for available sequence of 16s rRNA gene in NCBI and Campylobacters amplified sequence in this study.

بررسی همزمان آغازگرها با استفاده از Real time PCR

همه آغازگرها در شرایط مساوی و در دمای اتصال C˚ 52 به طور همزمان می­توانند تکثیر را انجام دهند برای بررسی درستی این مطلب و همچنین بررسی و بهینه سازی تکثیر باکتری­ها به روشReal time PCR  این روش برای این چهار تا آغازگر که دارای نمونه مثبت بودند انجام گردید و نتایج به صورت زیر به دست آمد (شکل 5 و 6). از جمله محاسن روش Real Time بر دیگر روش ها به سرعت و حساسیت بالا، عدم نیاز به دستگاه بررسی ژل[9] (زیر اشعه UV) و در نتیجه به حداقل رساندن میزان آلودگی و توانایی در اندازه­گیری میزان کپی­های ژن اشاره نمود. در این مطالعه با طراحی آغازگرهای اختصاصی هر باکتری در شرایط یکسان با بقیه امکان تکثیر همزمان باکتری­ها فراهم شد. در مطالعه­ای برای تشخیص عامل اسهال گاوی از PCR Real- Time برای تشخیص همزمان باکتری­های کمپیلوباکتر ژژونی، شیگلا، یرسینیا و سالمونلا استفاده گردید (Wiemer et al., 2011).

شکل 5- Real time PCR نمونه های مثبت دو باکتری بروسلا با طول قطعه bp200 و یرسینیا به طول bp 166 به طور همزمان.

Figure 5- Real time PCR of positive samples of Brucella with 200 bp length and Yersinia with 166 bp length Simultaneously.

شکل 6- Real time PCR نمونه های مثبت دو باکتری سالمونلا (دو نمونه اول) به طول bp 402 وکمپیلوباکتر (دو نمونه بعدی) با طول قطعه  bp266 به طور همزمان.

Figure 6- Real time PCR of positive samples of Salmonella (two first samples) with 402 bp length and Campylobacter (two other samples) with 266 bp length Simultaneously.

تست حساسیت کمپیلوباکتر

در مورد باکتری کمپیلوباکتر یکی از نمونه­های مثبت پس از PCR و تعیین غلظت به روش گفته در رقت­های مختلف تهیه گردید و هفت تا از این رقت­ها در Real Time PCR مجددا مورد آزمون قرار گرفتند. تمامی این رقت­ها با دقت بالا تکثیر شده و آغازگر اختصاصی کمپیلوباکتر توانست تا یک کپی از ژنوم را هم تکثیر کند. در یک بررسی Levett et al (2005) نیز برای تشخیص سویه­های مختلف لپتوسپیرا و اختصاصی بودن آغازگرها از این روش استفاده کرده و توانستند کارایی آغازگرهای طراحی شده خود را در تمایز سویه­های بیماری زا و غیر بیماری زای لپتوسپیرا نشان دهند. Fowden et al (2010) نیز در یک بررسی بر روی تشخیص گونه­های کمپیلوباکتر در یک سیستم امنیت غذایی،حساسیت آغازگرهای این باکتری را به وسیله Real Time PCR تا 10 کپی از ژنوم در هر واکنش نشان دادند در این تحقیق اختصاصی بودن آغازگرها 100 درصد گزارش شده است. 

بررسی اختصاصی بودن آغازگرها

در همه نمونه­ها هر آغازگر فقط DNA باکتری مربوط به خود را در صورت وجود باکتری در نمونه به طور اختصاصی تکثیر نموده و هیچیک از باکتری­ها به هیچ وجه توسط آغازگرهای دیگر تکثیر نیافتند.

نتیجه­گیری کلی

در این تحقیق نیز  Real Time PCRروشی دقیق و حساس برای تشخیص باکتری­های مربوط به سقط جنین بود. آغازگرهای طراحی شده در این بررسی دقت و کارایی لازم را برای تکثیر همزمان داشته و آغازگر مربوط به کمپیلوباکتر نیز توانایی تشخیص این باکتری را حتی در حضور یک کپی از ژنوم در هر میکرولیتر داشته است.

تقدیر و تشکر

بدین وسیله از سازمان جهاد کشاورزی استان زنجان: آقای مهندس رستمخانی برای همکاریهای بی دریغشان در تمام زمینه­ها و همچنین آقایان مهندس موسوی و عیسی بیگلو بخاطر هماهنگی و همکاری در نمونه برداری کمال تشکر را دارد. همچنین از نظرات و پیشنهادات سازنده داوران محترم مقاله صمیمانه تشکر و قدردانی می­گردد.

شکل 7- نتایج تکثیر و ذوب رقت های مختلف برای کمپیلوباکتر.در منحنی ذوب (پایینی) مشتق فلئورسانس (محور yها) در مقابل دما (محور xها) نشان داده می­شود.

Figure 7- Results for amplification and melt of different dilutions of Campylobacter. In melt curve the derivative of fluorescence (Y axis) vs. temperature (X axis) is shown.

شکل 8- رسم منحنی استاندارد در غلظت­های مختلف نمونه­های کمپیلوباکتر.

Figure 8- The standard curve for different concentrations of Campylobacter samples.