ویژگی های مولکولی و زیستی جدایه های ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی آلوده کننده فلفل در استان تهران

ویژگی های مولکولی و زیستی جدایه های ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی آلوده کننده فلفل در استان تهران

یلدا سخن سنج¹، فرشاد رخشنده رو* ²

¹ داننشجوی سابق کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران.

² استادیار گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران.

تاریخ دریافت: 17/03/1392، تاریخ پذیرش: 12/03/1393

چکیده   

ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی یا Tomato ringspot virus (ToRSV) یکی از عوامل تهدید کننده کشت سبزیجات در جهان است. در طی فصول زراعی سال های 1391-1389 تعداد 110 نمونه برگی دارای علایم مشکوک به آلودگی ویروسی و یا بدون علایم به صورت تصادفی از فلفل قلمی مزرعه ای و گلخانه‌ای استان تهران جمع آوری شد. با استفاده از آزمون های‌ سرولوژیکی Double ،Antibody Sandwich Elisa (DAS-ELISA)  وDot immunobinding assay (DBIA)  حضور ویروس در 22% نمونه ها تائید شد. خصوصیات بیولوژیکی جدایه های  ویروس با مایه زنی مکانیکی گیاهان محک و ویژگی های مورفولوژیک آن ها با مشاهده پیکره های ایزومتریک با روش Immunosorbent electron microscopy (ISEM) مورد بررسی قرار گرفت. آلودگی نمونه های گیاهی به ToRSV با استفاده از آزمون reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) و کاربرد آغازگر اختصاصی طراحی شده در این تحقیق جهت تکثیر قسمتی از ژن تولید کننده پلیمراز ویروس مورد تائید قرار گرفت. قطعه ژنی تکثیر شده مربوط به یکی از جدایه ها در پلاسمید pTZ57R/T وارد و به سویه DH5α باکتری E. coli انتقال داده شد و همسانه سازی قسمتی از ژن پلیمراز ویروس انجام پذیرفت. پلاسمید همسانه سازی شده استخراج و سپس ترادف قطعه ژنتیکی مربوط تعیین گردید و با کد دسترسی JQ972695 در NCBI ثبت گردید. مقایسه با استفاده از ابزار جستجوی Blast میزان 94-87 % شباهت بر مبنی توالی نوکلئوتیدی و 98-94% شباهت بر مبنی توالی اسید آمینه ای بین نژادهای ایرانی و آمریکایی  مشخص شد. داده های این بررسی می تواند جهت ردیابی، بررسی پراکنش و دامنه میزبانی و استفاده در روش های مدیریت مبارزه با ویروس در مزارع فلفل ایران به کار رود.

واژه های کلیدی : ToRSV، همسانه سازی، RT-PCR،  phylogenetic analysis، sequencing.

مقدمه

ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی (ToRSV) به راسته ی Picornavirales، خانواده Secoviridae، زیر خانواده Comovirinae و جنس Nepovirus تعلق دارد (Sanfacon et al., 2009). پیکره های ویروس ایزومتریک گرد و قطری در حدود 30 نانومتر داشته و به هنگام الترا سانتریفوژ در شیب چگالی ساکارز، سه جزء رسوبی را شکل می دهند (Stace-Smith, 1996). ژنوم ویروس از دو عدد RNA تک رشته ای مثبت تشکیل شده است که هر رشته ژنومی دارای یک قاب خواندنی باز بوده و در ابتدای 5َ به یک پروتئین ویروسی با وزن مولکولی کم (Vpg) متصل شده است (Sanfacon et al., 2009). ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی تعداد زیادی از گیاهان علفی و یا درختان مثمر و غیر مثمر را آلوده می سازد و موجب کاهش عمر باغات زراعی و زینتی می شود. این ویروس با کاهش توان زیستی گیاهان میزبان و نیز کاهش بازارپسندی و افزایش حساسیت آن­ها به تنش­های غیر زیستی و یا زیستی دیگر موجب بالا رفتن میزان خسارت می شود (Stace-Smith, 1984). تا کنون جدایه های متفاوتی از ToRSV در نقاط مختلف جهان گزارش شده است و هر جدایه اختصاصی دارای ویژگی های سرولورژیکی مجزایی می باشد. بر این مبنی تا کنون پنج گروه سرولوژیکی از این ویروس گزارش شده است (Bitterlin & Gonsalven, 1988). جدایه های مختلف ویروس در توالی کد کننده انتهای 3َ موجود روی دومین مولکول RNA ژنومی از یکدیگر قابل تمایز هستند (Wang & Sanfacon, 2000). صرف­نظر از نوع میزبان و توان بیماریزایی و یا منطقه جغرافیایی محل جداسازی جدایه های مختلف، نپوویروس ها دارای حفاظت ژنومی در منطقه ژنتیکی غیر قابل ترجمه انتهای ژنوم (3'-UTR) می باشند (Pribylova et al., 2008) . نتایج تحقیقات اخیر نشان داد که جدایه های مختلف ToRSV نیز از حفاظت بالای ژنومی در منطقه 3'-UTR برخوردارند (Li et al., 2011). ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی در ایران از پراکندگی وسیعی برخوردار است. این ویروس از مزارع سویا در استان های گلستان، مازندران، خوزستان، اردبیل و لرستان ((Golnaraghi et al., 2004، تاکستان های شمال کشور (Rakhshandehroo et al., 2005)، گیاهان زینتی استان های مرکزی و تهران (Ghotbi & Shahraeen, 2009)، گوجه فرنگی کاری های استان های جنوب کشور (Massumi et al., 2009)، باغات سیب (Moini, 2010) استان خراسان و نیز درختان میوه هسته دار استان های تهران و گلستان  (Sattary et al., 2012) گزارش شده است. این ویروس هم چنین به تازگی از درختان میوه هسته دار در برخی از استان های کشور گزارش شده است (Sattary et al, 2012). ویروس مذکور از طریق گونه های مختلف نماتد Xiphinema در خاک و نیز توسط بذر منتقل می شود (EPPO, 2005). با توجه به گستردگی ویروس در مناطق و میزبان های مختلف در ایران و به دلیل موجود نبودن تحقیقی در این زمینه در سبزیجات زراعی ایران در این پژوهش میزان آلودگی و نیز ویژگی های زیستی و مولکولی جدایه هایToRSV آلوده کننده فلفل قلمی مزرعه ای و گلخانه های استان تهران تعیین گردید.

مواد وروش ها

نمونه برداری

در طی فصول زراعی سال های 1391-1389 تعداد 110 نمونه برگی به صورت تصادفی و با حرکت در قطر مزرعه از نمونه های فلفل قلمی (Capsicum annum L.) علایم دار با علایم مشکوک به آلودگی ویروسی و نیز بدون علایم کاشته شده در مزارع و گلخانه های متفاوت استان تهران شامل شهر ری، شهریار، تهران و ورامین جمع آوری شد. مزارع و گلخانه ها با فاصله 10 کیلومتر از یکدیگر انتخاب شدند و نمونه برداری از هر منطقه با توجه به میزان سطح زیر کشت فلفل در آن انجام صورت پذیرفت.

الایزا به روش ساندویچ دو طرفه آنتی بادی ((DAS-ELISA

به منظور ردیابی ToRSV از آزمون الایزا به روش ساندویچ دو طرفه آنتی بادی(DAS-ELISA) مطابق روش (Clark & Adams (1977 استفاده شد. در این آزمون از آنتی بادی های چند همسانه ای (Agdia, USA) با رقت 200 برابر جهت ردیابی ToRSV استفاده شد. عصاره گیری از نمونه های برگی جمع آوری شده با نسبت یک به یک (یک گرم بافت برگ در یک میلی لیتر بافر استخراج) در هاون چینی سرد انجام پذیرفت. برای این آزمون از بافر سوبسترا دارای ماده پارانیتروفنیل فسفات به میزان (1mg/mL) استفاده شد و واکنش رنگ زایی نمونه های مثبت و حضور رنگ زرد با دستگاه الایزا خوان مدل ELX 800-Biotek در طول موج 405 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت. نمونه هایی که مقدار عددی جذب آن ها از 3 برابر میانگین جذب چاهک های مربوط به شاهد سالم بیشتر بود به عنوان نمونه های مثبت و آلوده به ویروس در نظر گرفته شدند (Clark & Adams (1977. برای هر بار انجام آزمون از نمونه های کنترل مثبت و منفی استفاده شد. همچنین از نمونه های برگ فلفل فاقد آلودگی نیز به عنوان شاهد سالم استفاده شد.

آزمون دیبا  Dot-immunobinding assay (DIBA)

به دلیل احتمال خطا در نتایج آزمون الایزای مستقیم به دلیل قابلیت کم شستشو و حذف اکسیدانت ها از چاهک های واکنش در آزمون مذکور، نمونه هایی که واکنش رنگ زایی ضعیفی با آنتی بادی اختصاصی در آزمون DAS-ELISA داشتند، برای تائید آلودگی توسط آزمون DIBA مورد بررسی مجدد قرار گرفتند. برای این منظور از تعداد 50 نمونه گیاهی آلوده به ToRSV با واکنش ضعیف در آزمون DAS-ELISA استفاده شد. آزمون دیبا مطابق روش ((Banttari & Goodwin,1985 انجام شد و در آن از آنتی بادی چند همسانه ای ToRSV با رقت 200 برابر و آنتی بادی ضد خرگوش  (Sigma-Aldrich, Germany) Goat Anti-Rabbit (GAR) با رقت 10000 برابر استفاده شد. برای ردیابی ویروس از مواد شیمیایی رنگزا (NBT) nitro blue tetrazolium (Sigma-Aldrich) و (BCIP) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate استفاده شد. حضور لکه های بنفش رنگ در سطح غشاء به فاصله زمانی 20 دقیقه از زمان افزوده شدن به منزله آلودگی به ویروس در نظر گرفته شد. در  این آزمون از عصاره برگ های فلفل سالم و آلوده به عنوان شاهد های منفی و مثبت استفاده شد. 

بررسی خصوصیات زیستی جدایه های ToRSV ردیابی شده از فلفل

آزمون Immunosorbent electron  microscopy (ISEM)

به منظور مشاهده پیکره ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی، تعداد سه نمونه از جدایه های مربوط به شهر های ورامین و شهرری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی مورد مشاهده قرار گرفتند. این تحقیق مطابق روش Milne  انجام پذیرفت (Milne, 1993). برای این منظور از آنتی بادی چند همسانه ای ویروس با رقت 200 برابر استفاده شد.  رنگ آمیزی منفی پیکره­ها توسط محلول یورانیل استات 2% انجام پذیرفت. مشاهده پیکره ها و عکسبرداری از نمونه­ها توسط دستگاه میکروسکوپ الکترونی گذاره مدل Philips EM-208 با میدان ولتاژ80 کیلوولت و بزرگنمایی 100-80 هزار برابر انجام پذیرفت.

زیست سنجی گلخانه ای

به منظور بررسی برخی خصوصیات زیستی مربوط به جدایه های ToRSV در این تحقیق از گیاهان علفی سنجشی استفاده شد و عصاره برگ نمونه های آلوده به صورت مکانیکی بر روی آنها مایه زنی شد. برای مایه زنی از تعداد پنج جدایه شاخص دارای نوع شاخص علایم ToRSV استفاده شد. برای این منظور عصاره هر پنج نمونه در بافر فسفات پتاسیم 1/0 مولار  با 1/7pH=  دارای 15% از ماده 2- مرکاپتواتانول استخراج و به صورت مکانیکی بر روی گیاهان خیار (Cucumis sativus L.)، توتون (Nicotiana tabacum cv. Samsun)، لوبیا چشم بلبلی (Vigna unguiculata L.)، و لوبیای معمولی (  (Phaseolus vulgaris L با تکرار درگلخانه مایه زنی شد. در مراحل 2 تا 4 برگی و 10 روز پس از مایه زنی، علایم ظاهر شده روی گیاهان مایه زنی شده یادداشت برداری شد آزمون الایزا تا 14 روز پس از مایه زنی به منظور اطمینان از آلوده بودن گیاهان مایه کوبی شده انجام پذیرفت.

آزمون RT-PCR

برای تشخیص دقیق ویروس در نمونه های آلوده از آزمونRT-PCR  برای نمونه هایی از گیاهان که توسط آزمون سرولوژیک الایزا مثبت شناخته شده بودند، استفاده شد. برای این منظور عصاره های برگی آلوده به ویروس به صورت مکانیکی بر روی گیاه محک لوبیا در گلخانه مایه زنی شد. چهارده روز پس از مایه زنی، آموده RNA کل از بافت برگ های جوان لوبیا با استفاده از ستون های کوچک استخراج (mini column RNA extraction kit, Vivantis, Malaysia) استخراج شد.

طراحی آغازگر برای ژن پلیمراز ویروس ToRSV و سنتز DNA مکمل cDNA

جفت آغازگرهای (ToRSV-RDR-F, R) با توجه به منطقه‌ی ژنتیکی حفاظت شده مربوط به آنزیم پلیمراز واقع برروی RNA-1 جدایه‌های موجود در بانک جهانی ژنNCBI  شامل AF135410, AF135409, DQ641947, GQ141525, GQ141528, GQ141527, GQ141526 برای این تحقیق طراحی شدند. تمامی جدایه های مذکور در گذشته از آمریکا از درختان میوه گزارش شده بودند. همردیف سازی توالی‌های ژنتیکی مربوط به منطقه حفاظت شده آنزیم پلیمراز برای جدایه‌های فوق توسط نرم افزار GeneDoc انجام پذیرفت (Nicholas et al., 1997) و طراحی آغازگر با استفاده از نرم افزار Primer 3 (Ambion, USA) انجام پذیرفت. فرایند ساخت DNA مکمل (cDNA) با استفاده از آنزیم نسخه بردار معکوس (M-MuLV) و مطابق دستورالعمل شرکت Fermentas آلمان و با آغازگر برگشتی (Reverse Primer) اختصاصی ژن پلیمراز ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی (ToRSV-RDR-R) انجام پذیرفت. واکنش مولکولی PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده برای تکثیر قسمتی از منطقه ژنی مسئول بیان پلیمراز ویروس باندازه 411 جفت باز واقع در فاصله بین نوکلئوتید های1236 تا 1647 از قطعه اول RNA ژنومی ویروس انجام پذیرفت. از آغازگرهای رفتی (ToRSV-RDR-F) و برگشتی (ToRSV-RDR-R) با توالی های به ترتیب '5'-GAAGAGCTAGAGCCTCAACCAGG-3 و 5'-CGCCTGGTAATTGAGTAGCCC-3' و چرخه های حرارتی زیر برای تکثیر توالی هدف استفاده شد: 4 دقیقه در 95 درجه قرار داده شد سپس با 35 سیکل، واسرشته شدن، اتصال پرایمر وبسط نهایی با دماهای 1 دقیقه در 95 درجه،1دقیقه در 54 درجه و2دقیقه در 72 درجه به ترتیب دنبال شد و در نهایت یک سیکل 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه.

همسانه سازی محصول PCR توسط کیت تجارتی شرکت فرمنتاس (Inst TAclone ^TM PCR Coling kit, #K1213)

برای همسانه سازی محصول PCR ابتدا محصول PCR حاوی باند مربوط به قطعه ژنتیکی تکثیر شده هدف از ژل آگارز توسط کیت استخراج دی ان ای (DNA Extraction Kit #K0513) استخراج شد. قطعه ژنتیکی حاصل در ناقل پلاسمیدی همسانه ساز pTZ57R/T وارد شد. پس از انتقال، ناقل پلاسمید نوترکیب با استفاده از شوک حرارتی به درون سلول های مستعد باکتری E.coli سویه α DH5 انتقال یافت. با استفاده از غربالگری پرگنه‌‌ باکتری های نوترکیب با استفاده از محیط کشت انتخابی دارای آمپی­سیلین و کشت پرگنه های سفید (حاوی پلاسمید نوترکیب) روی محیط کشت انتخابی جدید دارای مواد X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) و IPTG (IPTG (isopropyl-D-thiogalactopyranoside) توده های نوترکیب انتخاب و برای  استخراج پلاسمید با استفاده از روش لیز قلیائی مورد استفاده قرار گرفتند. برای تائید حضور قطعه DNA تکثیر شده در پلاسمید نوترکیب، با استفاده از دو آنزیم برشی BamH1 و EcoR1 پلاسمید مذکور برش داده شد.

توالی یابی و آنالیز فیلوژنتیکی

پلاسمید های استخراج شده در دو تکرار به صورت مستقیم برای توالی یابی به شرکت Bioneer کره جنوبی توسط شرکت تکاپوزیست ارسال گردید. مقایسه توالی نوکلئوتیدی ردیابی شده با سایر توالی های موجود در NCBI با استفاده از موتور جستجو گر nBlast انجام پذیرفت. با استفاده از نرم افزار ClustalW منطقه ژنتیکی تکثیر شده برای جدایه ایرانی و سایر جدایه های ثبت شده در NCBI (جدول 1) همردیف شدند و پس از حذف نوکلئوتیدهای پوچ از درون توالی، درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم افزار Mega 5 و به صورت p-distance با 1000 تکرار ترسیم گردید. برای این منظور ویروس پژمردگی باقلا Broad bean wilt virus-2 به عنوان گروه خارجی قرار گرفت.

نتایج

ردیابی ToRSV  با استفاده از آزمون های سرولوژیکی DAS-ELISA   و DBIA و مولکولی RT-PCR

با استفاده از آزمون سرولوژیکی الایزا مشخص شد که ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی در 22% از 110 نمونه فلفل جمع آوری شده از مزارع و گلخانه های استان تهران حضور دارد که از این میزان 10% مربوط به آلودگی مزرعه ای و 12% مربوط به آلودگی گلخانه ای بود. از تعداد 50 نمونه ای که در الایزا واکنش ضعیفی را با آنتی بادی نشان داده بودند و توسط آزمون DIBA مجدداً برای حضور ویروس مورد ردیابی قرار گرفتند، همگی نمونه ها واکنش رنگزایی قوی را نشان دادند که بیانگر قابلیت بیشتر تکنیک DIBA در مقایسه با ELISA برای ردیابی ویروس می باشد (شکل 1). در نمونه هایی که توسط الایزا برای ToRSV آلوده تشخیص داده شدند، پس از انجام آزمون RT-PCR با استفاده از آغازگر اختصاصی طراحی شده در این پژوهش قطعه ژنی مورد نظر به وزن 411 جفت باز مربوط به منطقه ژنتیکی کد کننده آنزیم پلیمراز تکثیر گردید (شکل 4). همچنین با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی طراحی شده در این بررسی براحتی قطعه ژنتیکی مورد انتظار از بخشی از ژن پلیمراز ویروس در گیاهان محک مایه کوبی شده با ویروس تکثیر گردید.

جدول 1- کدهای دسترسی، میزبان و منطقه جغرافیایی جدایه های ToRSV منتخب که برای بررسی فیلوژنتیکی بر مبنی بخشی از توالی نوکلئوتیدی مربوط به ژن تولید کننده آنزیم پلیمراز در این تحقیق انتخاب شده اند.

Table 1- Accession numbers, host and origin of ToRSV isolates selected for phylogenetic analysis on the basis of a partial nucleotide sequence of the RdRP gene encoding viral polymerase in this study.

شکل 1- ردیابی ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی از فلفل های استان تهران با استفاده از آزمون DBIA . حلقه های بنفش رنگ بیانگر واکنش مثبت (نمونه آلوده) و بیرنگ بیانگر واکنش منفی (نمونه غیر آلوده) می باشد. ردیف: A 1, 2,3,4,5  نمونه های فلفل جدا شده از شهر ورامین. ردیف B1,2,3,4,5: نمونه های فلفل جدا شده از شهر ری.، ردیف C 1,4,5 : نمونه های فلفل شهریار.، ردیف  D 1,2 : نمونه های فلفل شهر ری.، D 3,4,5: نمونه های فلفل تهران.، :C2 نمونه فلفل سالم وC3  : بافر.

Figure 1- Detection of Tomato ring spot virus (ToRSV) from pepper plants in Tehran by dot immunobinding assay. Test results representing the total leaf protein extracted from pepper plants isolated from Tehran. Infected samples and ⁄ or positive reactions are represented by lilac dots. No reactions are obtained from healthy pepper material (colorless). Lanes A1,2,3,4,5 represent ToRSV-infected pepper isolated from Varamin district; B1,2,3,4,5 are for infected pepper from Shahriar district; D1,2 infected pepper plants from Shahrerey district; D3,4,5 infected pepper plants from Tehran district; C2: Healthy pepper sample and C3: Buffer.

آنالیز فیلوژنتیکی جدایه های ToRSV

پس از همسانه سازی و تعیین توالی قطعه ژنی تکثیر شده توالی ژنتیکی مذکور با کد دسترسی (JQ972695) در بانک جهانی به ثبت رسید (جدول 1). مقایسه توالی های نوکلئوتیدی با ابزارهای جستجوی nBlast و pBlast نشان داد جدایه ایرانی آلوده کننده فلفل با سایر جدایه های ثبت شده در بانک جهانی ژن به میزان 94-89 % در سطح توالی نوکلئوتیدی و 98-94 % در سطح توالی اسید آمینه ای مشابه می باشد (جدول 1). بیشترین میزان تشابه بین جدایه های آمریکایی ویروس با جدایه ایرانی مشاهده شد. در درخت فیلوژنتیکی، جدایه ایرانی در کنار سایر جدایه های آمریکایی ویروس که از زغال اخته گزارش شده بودند در گروه اول قرار گرفت (شکل 2). جدایه جدا شده از هلو با فاصله ژنتیکی از سایر جدایه های جدا شده از زغال اخته و نیز فلفل در گروه فیلوژنتیکی اول قرار گرفت و جدایه های ویروسی که از تمشک جدا شده بودند در کنار یکدیگر در گروه فیلوژنتیکی دوم قرار گرفتند (شکل 2).

شکل 2- درخت  فیلوژنتیکی حاصل از مقایسه جدایه ایرانی با جدایه های آمریکایی بر مبنی قطعه ژنتیکی باندازه 411 جفت باز از طول ژن پلیمراز جدایه های Tomato ring spot virus. درخت فیلوژنتیکی به روش p-distance و با هزار تکرار ترسیم شده است. درصد های بوت استراپ (Boot strap) گروه ها بر روی انشعابات نشان داده شده است. Scale bar. بیانگر فاصله ژنتیکی باندازه 05/0 می باشد. توالی نوکلئوتیدی ژن RdRP ویروس پژمردگی باقلا (BBWV-2) به عنوان گونه خارجی انتخاب شده است.

Figure 2- Phylogenetic tree of Tomato ring spot virus isolates constructed from the alignment of 411 nucleotide sequence of the polymerase gene of isolates from Iran, together with the homologous American isolates. Tree rooted using the p-distance method based on 1000 replicates.  Bootstrap percentages of clades are shown along internal branches of trees. Branch lengths represent genetic distances.  The tree was rooted with the RdRP of Broad bean wilt virus-2 (BBWV), used as an outgroup species.

زیست سنجی و ایمینوالکترون میکروسکوپی

با استفاده از آزمون میکروسکوپ الکترونی و تکنیک (ISEM) پیکره های ایزومتریک ویروس در عصاره برگ مربوط به نمونه های آلوده مشاهده و مورد عکاسی قرار گرفتند. از این طریق پیکره های کروی ToRSV با قطری حدود 30 تا 32 نانومتر مشابه ابعاد ذکر شده توسط محققان پیشین (Stace-Smith, 1984; 1996; Samuitiene et al., 2003) در عصاره ی نمونه های آلوده مشاهد شد (شکل 3). بین جدایه های مختلف از لحاظ مورفولوژیکی تفاوت معنی داری مشاهده نشد. گیاهان محک سنجشی تا 10 روز پس از مایه زنی مکانیکی توسط تمام جدایه های مربوط به میزبان ها و مناطق مختلف علایمی یکسان به مانند آنچه که در گذشته برای ویروس ToRSV گزارش شده بود را نمایان ساختند (EPPO, 2005) (جدول 2) و (شکل 5). با این وجود بین جدایه های مربوط به مناطق مختلف در ایجاد علایم در برخی گیاه های محک تفاوت در علایم وجود داشت. گیاه های لوبیای چشم بلبلی و لوبیای معمولی پس از مایه زنی جدایه های مختلف ویروس مربوط به مناطق مختلف با لکه های کلروزه موضعی سیستمیک، نکروز سیستمیک، بدشکلی، موزاییک و موزاییک سیستمیک به آلودگی ویروس پاسخ دادند (شکل 5) در حالی که لوبیا های مذکور در پاسخ به مایه زنی با عصاره جدایه های مختلف گلخانه ای و مزرعه ای یکسان پاسخ دادند.

جدول 2- دامنه میزبانی Tomato ring spot virus جدا شده از فلفل در استان تهران بر روی گیاهان علفی محک.

Table 2- Host range of pepper infecting Tomato ring spot virus isolates from Tehran, on indicator herbaceous plant species.

Sn: Systemic necrosis; Sc: Systemic chlorosis; Vc: Vein clearing; Mo: Mosaic; LD: Leaf deformation; CLL: Chlorotic local lesion, SL: Symptomless.

شکل 3- پیکره های ایزومتریک ToRSV با قطر حدود 30-32 نانومتر. پیکره ها پس از تکثیر ویروس در گیاه محک لوبیا از عصاره برگ جداسازی شده و توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره EM-208 با استفاده از تکنیک ISEM مورد عکاسی قرار گرفته اند. مکان حضور پیکره ها در شکل با پیکان مشخص شده است (Bar. 100nm).

Figure 3- Isometric particles of Tomato ring spot virus with a diameter about 30-32 nm. Particles were captured with ISEM technique and photographed with using EM-208 electron microscope system after viral replication in bean propagative-indicator host plant. Viral particles indicated by arrow head through in picture. Bar. 100 nm.

شکل 4- الکتروفورز محصول PCR جدایه های ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی ردیابی شده از فلفل های تهران با استفاده از جفت آغازگر طراحی شده در این تحقیق. راهک های 1، 2 و 3 : قطعه 411 جفت باز تکثیر شده در نمونه های فلفل شهرهای تهران، شهر ری و ورامین. L : نردبان وزن مولکولی باندازه 100 جفت باز شرکت فرمنتاس آلمان. C: چاهک مربوط به نمونه شاهد منفی که در آن از RNA گیاه فلفل سالم به عنوان نمونه استفاده شده بود.

Figure 4- Electrophoresis of RT-PCR products amplified with designed primers for Tomato ring spot virus isolates detected from infected pepper plants in Tehran.  Lanes 1 to 3 represent amplified products of about 411 bp from infected pepper samples for Tehran, Shahre rey and Varamin districts respectively. Lane L, 100-bp DNA ladder (Fermentas, Germany); Lane C, negative control (PCR conducted using RNA from healthy pepper plant material).

بحث

ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی (ToRSV) به صورت مستقل و یا همراه با سایر عوامل بیماریزای ویروسی به گستره وسیعی از سبزیجات در نقاط مختلف جهان حمله می کند (EPPO, 2005). در این تحقیق جداسازی و بررسی ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی از فلفل برای اولین بار در ایران گزارش می­شود. هم چنین پراکندگی این ویروس در زراعت های مختلف فلفل در استان تهران برای اولین بار تعیین شد. نتایج این پژوهش نشان داد فلفل کاری های گلخانه ای و مزرعه ای استان تهران با درصدهای مختلف به ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی آلوده می باشند. این بررسی مشخص کرد که فلفل ها در استان تهران در مجموع به میزان 22% بهToRSV آلوده می باشند که از این میزان 10% مربوط به آلودگی مزرعه ای و 12% مربوط به آلودگی گلخانه ای بود. پراکندگی بیشتر این ویروس درفلفل های گلخانه ای ممکن است به دلیل مناسب تر بودن شرایط آب و هوایی برای تکثیر و گسترش بهتر ویروس در مقایسه با مزرعه بوده باشد. از طرفی این احتمال نیز وجود دارد که به دلیل استفاده از بذور آلوده وارداتی از کشورهای آمریکایی و کاشت آنها در گلخانه ها، منابع آلودگی بالایی برای ویروس در گلخانه ها در طی سال های این تحقیق فراهم آمده باشد. با این وجود پایین بودن نسبی درصدهای آلودگی نشان از آن دارد که این ویروس احتمالا از قدمت زیادی در منطقه برخوردار نبوده و در این مناطق وارداتی است. ویروس مذکور از دامنه میزبانی بسیار زیادی برخوردار بوده و از آنجایی که نمونه برداری ها ازمزارع و گلخانه های با محصولات علفی و یکساله انجام پذیرفته است بنابراین امکان تغییر در درصدهای آلودگی به دلیل استقرار محصولات جدید و ورود منابع جدید آلودگی در مزارع و گلخانه های مورد نمونه برداری در سال های بعد وجود خواهد داشت که این امر اتخاذ تدابیر مدیریتی و اجرای اصول قرنطینه و بهداشت زراعی را جهت کاهش منابع آلودگی در منطقه طلب می نماید. در بررسی های فیلوژنتیکی نیز مشخص شد که جدایه ایرانی ویروس دارای شباهت بسیار زیادی به جدایه های آمریکایی ویروس است که این مطلب بیانگر این ادعا می تواند باشد که بذور وارداتی عامل استقرار منابع آلودگی در گلخانه ها می باشد. در بررسی دامنه میزبانی آزمایشگاهی جدایه های مختلف ToRSV مناطق مختلف استان تهران مشخص شد که جدایه های مختلف در گیاه لوبیا از علایم متفاوتی برخوردارند (شکل 5). تنوع علایم در گیاهان محک مرتبط با آلودگی ToRSV در گذشته توسط سایر محققین نیز گزارش شده است (Li et al., 2011) و این امر می تواند به دلیل حضور نژادهای متفاوت این ویروس در مناطق مختلف می باشد. با این وجود اثبات این مطلب نیازمند تعیین توالی ژنومی جدایه های مختلف ToRSV موجود در مناطق مختلف می باشد.

نپوویروس ها از جمله عوامل ویروسی با پیکره گرد ایزومتریک می باشند. چنین ویروس هایی در مقایسه با ویروس های میله ای از ساختمان های ثانویه زیادی در سطح ژنوم خود برخوردار هستند ) (Wetzel et al., 2004. حضور چنین ساختارهای ثانویه ای ممکن است مانع اتصال آغازگرهای اختصاصی به توالی هدف شوند (Abou-Ghanem et al., 2005). از اینرو توصیه می شود تا برای انجام بهتر آزمون PCR از واکنش های شروع داغ (Hot Start) استفاده شود تا دماهای بالا اجازه باز شدن ساختارهای ثانویه در سطح ژنوم را بدهد. استفاده از واکنشگرهایی مانند دی متیلن سولفوکساید (DMSO) و یا دی تیو تریتول (DTT) می توانند به باز شدن ساختارهای ثانویه مذکور کمک نموده و با اتصال مناسب آغازگر به هدف عمل ردیابی آسان تر خواهد شد (Li et al., 2011). پایین بودن دقت RT-PCR در ردیابی ToRSV توسط محققین قبل نیز گزارش شده است (Fuchs et al., 2010). با این وجود طراحی آغازگر بر مبنی قسمت های حفاظت شده ژنوم ویروس می تواند دقت واکنش PCR را افزایش دهد. در این تحقیق جفت آغازگری برای ردیابی جدایه های ایرانی ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی طراحی شد که با دقت بالا قادر به ردیابی ویروس از منابع گیاهی آلوده بود (شکل 4). بر مبنی آنالیز فیلوژنتیکی توالی نوکلئوتیدی مربوط به آنزیم پلیمراز جدایه های جهانی ToRSV در دو کلاستر گروه بندی شدند که بیانگر احتمال حضور دو ژنوتیپ متفاوت از این ویروس در جهان می باشد (شکل 2). با وجود اینکه تغییر در شرایط جغرافیایی تفکیک کننده جدایه ها نمی باشد ولی با توجه به همگرایی جدایه های ویروسی جدا شده از میزبان های مختلف در درون هر کلاستر و نیز فواصل ژنتیکی متفاوت بین جدایه های مربوط به میزبان های مختلف به نظر می رسد تنوع میزبانی باعث تفکیک ژنتیکی جدایه ها شده است (شکل 2).  با توجه به امکان ورود ویروس مورد تحقیق توسط بذور آلوده به کشور توصیه می شود از بذور سالم و مقاوم به ویروس استفاده شود و پایش مناسب بذور وارداتی برای حضور عوامل ویروسی مختلف توسط نهادهای مرتبط انجام پذیرد.