تبدیل میکوتوکسین دی‌اکسی‌نیوالنول به فرم 3- استیله آن در گیاهان گندم و توتون از طریق بیان ژن سنتتیک استیل ترانسفراز

تبدیل میکوتوکسین دی‌اکسی‌نیوالنول به فرم 3- استیله آن در گیاهان گندم و توتون از طریق بیان ژن سنتتیک استیل ترانسفراز

زهرا ایرانی^1،2، فروغ سنجریان*¹، محمدرضا عظیمی²

¹ پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران.

² دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران.

تاریخ دریافت: 27/03/1391، تاریخ پذیرش: 23/07/1392

چکیده

یکی از مکانیسم‌های مولکولی ایجاد مقاومت به بیماری بلایت فوزاریومی سنبله گندم که توسطFusarium graminearum  تولید می‌شود سم‌زدایی توکسین دی‌اکسی‌نیوالنول (DON) است. فوزاریوم‌های تولید کننده میکوتوکسین دارای آنزیم‌هایی هستند که خاصیت سمی آن‌ها را کاهش می‌دهند. آنزیم تریکوتسین 3-O-استیل ترانسفراز (Tri101) تریکوتسین‌ها را به ترکیباتی با سمیت کمتر تبدیل می‌کند. این آنزیم‌ها با جایگزین کردن گروه استیل به جای گروه OH در کربن 3 از سمیت آنها می‌کاهد. مطالعات نشان داده است که در  مخمر ژنAYT1 قادر به انجام این کار است. در این پژوهش ژن سینتتیک AYT1  به گیاه توتون منتقل شده، در گندم نیز به صورت موقت بیان شد. نتایج نشان داد که این ژن سینتتیک در هر دو گیاه بیان می‌شود. بررسی واکنش آنزیمی استیل ترانس فرازی با تکنیک کروماتوگرافی لایه نازک مشخص کرد که این ژن  می‌تواند با تبدیل DON به  3A DON(3- استیل دی­اکسی­نیوالنول) از سمیت آن بکاهد.

واژه‌های کلیدی: استیل ترانسفراز، بلایت فوزاریومی گندم، دی­اکسی­نیوالنول، سم­زدایی.

مقدمه

مایکوتوکسین‌ها متابولیت‌های ثانویه قارچی هستند که برای جانوران سمی هستند (Karlovsky, 2011). از مهم ترین آنها می‌توان به تریکوتسن‌ها، مایکوتوکسین غالب ردیابی شده در غلات اشاره کرد (Karlovsky, 2011; Nicholson et al., 2003; Nicholson et al., 2004). این توکسین‌ها که توسط قارچ‌هایی از جنس Fusarium، Myrothecium، Stachybotrys، Trichoderma، Trichothecium تولید می‌شوند، اثرات مهلکی بر سلامت انسان و حیوانات دارند (Karlovsky, 2011; Sarter & Zakhia, 2004). از اثرات آنها بر روی سلولهای یوکاریوتی می‌توان مهار سنتز پروتیین، RNA و DNA، مهار عملکرد میتوکندری، تاثیر بر تقسیم سلولی و عمل غشا (He et al., 2010) و همچنین القای آپوپتوز (Karlovsky, 2011) را نام برد. این سموم به دلیل پایداری در شرایط انبارداری، فراوری و پخت نان برای سلامت خطرناک بوده (Goswami & Kistler, 2004) و از طریق شیر، گوشت و تخم مرغ وارد زنجیره غذایی انسان شده  و سلامت انسان را به مخاطره می‌اندازند (He et al., 2010).

از مهمترین تریکوتسن‌های آلوده کننده غلات، دی‌اکسی‌نیوالنول (DON) می‌باشد، که عمدتا توسط قارچ F. graminearum، عامل اصلی بیماری بلایت فوزاریومی سنبله در گندم و ذرت، تولید می‌شود. DON مانند سایر تریکوتسن‌ها، ترکیبی سسکویی­ترپنوئیدی، دارای ساختار حلقوی با وزن مولکولی کم است (He et al., 2010; Llorens et al., 2006) و در ساختار خود دارای گروه اپوکسی بر روی کربن شماره 12 و 13 و گروه OH بر روی کربن‌های 3 و 15 است که سمیت آنرا موجب می‌شوند (Krska et al., 2001; Alexander et al., 2002).

کاهش خطرات تهدید کننده مایکوتوکسین برای انسان و دام از طریق سم‌زدایی امکان پذیر است. سم‌زدایی DON به طرق شیمیایی و آنزیمی صورت می‌گیرد. بهترین ماده جهت سم‌زدایی شیمیاییDON، سدیم متا بی سولفات می‌باشد که از لحاظ کاربردی  دارای محدودیت‌هایی است (Karlovsky, 2011). در سم‌زدایی آنزیمی DON، آنزیم‌های مختلفی به کار گرفته شده اند، که از جمله آنها می‌توان به  استیل­ ترانسفرازهای قارچی (Alexander et al., 2002; He et al., 2010) و گلیکوزیل ترانسفرازهای گیاهی (Poppenberger et al., 2003) اشاره کرد. این آنزیم‌ها کربن شماره 3 ترکیب DON را هدف قرار داده و گروه OH آن را با گروه استیل و یا گروه گلیکوزیل جایگزین کرده و موجب کاهش سمیت مایکوتوکسین می‌شوند (Mc Cormick et al., 1999).

مقدار مجاز مصرفی DON در ایالات متحده برای انسان 1 µg/g و دام 5 µg/g می‌باشد (Manoharan et al., 2006). علاوه بر این DON عامل تهاجم قارچ بیمارگر به گیاه است و تحمل به آن باعث کاهش خسارات مزرعه ای می‌شود (Poppenberger et al., 2003). بیماری بلایت فوزاریومی در اکثریت نقاط غله خیز دنیا وجود دارد و باعث کاهش محصول می‌شود (Goswami & Kistler, 2004). در ایران نیز عامل این بیماری در مناطق گیلان و مازندران (Foroutan et al., 1993)، مغان (Babadoost et al., 1995) و خوزستان (Moosawi-Jorof, 2003) گزارش شده است. بنابراین سم‌زدایی از این مایکوتوکسین می‌تواند هم در افزایش عملکرد و هم در سلامت غذای انسان و خوراک دام تاثیر بسزایی داشته باشد.

در مخمر Saccharomyces cerevisiae مکان ژنی AYT1(ORF-Y1106Bc) شناسایی شده است که محصول آن در حفاظت مخمر در برابر تریکوتسن‌ها نقش دارد (Alexander et al., 2002). در این پژوهش ORF کد کننده استیل ترانسفراز مورد استفاده قرار گرفته است. این ژن برای بیان در گیاه بهینه سازی شده و سپس به گیاه منتقل شد. و در نهایت نحوه عملکرد و توانایی آن در کاهش سمیت مایکوتوکسین، از طریق استیله کردن آن، در گیاه مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک بدون تغییر در توالی اسیدآمینه ای عمل بهینه سازی رمز در توالی ژن AYT1 مخمر موجود در بانک ژن با شماره دسترسیZ73168Y13138 درمورد گیاه به عنوان میزبان انجام گرفت (Abkar et al., 2010). توالی بهینه­سازی شده توسط شرکت Shine Gene Molecular Biotech ساخته و به صورت کلون شده در پلاسمیدpUC57 ارایه شد.

ساخت سازه‌های ژنی: ژنAYT1 مصنوعی پس از تائید توسط توالی یابی با استفاده از برش آنزیمی دوگانه با آنزیم‌های Bam H1 و Sac 1 از پلاسمید pUC57 خارج و با استفاده از آنزیمT4 Ligase (Fermentase)  به جای ژن گزارشگر gus  در پلاسمید دو گانه pBI121  همسانه سازی شد و سازه جدید pBI121SA بدست آمد (شکل 1).

شکل 1- سازه مورد استفاده در تراریختی گیاه (pBI121SA). ژن AYT سنتتیک جایگزین ژن gus در پلاسمید PBI121 شده است.

Figure 1- Construct used for plant transformation (pBI121SA). gus gene was replaced with Synthetic AYT1 gene.

سازه ژنی حاصل به باکتری E. coli سویه DH5α منتقل شد و سپس با روش ذوب و انجماد (Harisch et al, 1988.) به باکتری Agrobacterium tumefaciens  سویه LBA4404 انتقال یافت. غربالگری کلنی‌های به دست آمده با استفاده از آغازگرهای طراحی شده، با کلنی PCR صورت گرفت. از سازه حاصل جهت تراریختی پایدار توتون و همچنین تراریختی موقت گندم استفاد شد. آغازگرهای اختصاصی طراحی شده عبارت بودند از:

FAYT1: 5`-GCGTGCAGATGCTTGAAAATGACC-3`,

R AYT1: 5`-CGTAGCGTAATTAGTCCATTC-3`   

شرایط PCR انجام شده عبارت بود از:  94درجه سانتی گراد به مدت 60 ثانیه، 54 درجه سانتی گراد به مدت 60 ثانیه، 72 درجه سانتی گراد  به مدت 60  ثانیه، که برای 30 سیکل تکرار می­گردید. تراریختی پایدار گیاه توتون: تراریختی توتون با ساختار ژنی موجود از طریق آلوده سازی قطعات برگی انجام شد (Sanjarian et al., 2006). باززایی و انتخاب لاینهای تراریخت در محیط‌های کشت انتخابی حاوی mg/ml 100 کانامایسین انجام پذیرفت. پس از ریشه دهی، گیاهچه‌ها به گلدان منتقل شدند، بذرهای حاصل از خود­لقاحی نسل T0 جمع آوری شده و برای آنالیز‌های بعدی مورد استفاده قرار گرفت.

آنالیزهای مولکولی گیاهان تراریخت: جهت اثبات ورود ژن synth-AYT1 به گیاه و بیان آن از واکنش PCR و RT-PCR استفاده شد. DNA ژنومی از بافت برگ با استفاده از روش CTAB (Doyle & Doyle, 1987) استخراج گردید. RNA کل گیاهان تراریخت نیز با استفاده از کیت RNX-Plus ^TM(Cat. No. RN7713C. Cina gene,Iran) از برگ گیاه استخراج شد و ساخت cDNA با استفاده از آغازگر OligodT انجام شد. DNA و cDNA با آغازگرهای اختصاصی ذکر شده در کلنی PCR و با همان شرایط تکثیر شدند (Sanjarian et al., 2006).

تراریختی موقت گندم: تراریختی موقت گندم با روش اگرواینفیلتریشن انجام شد. پس از دست یافتن به شرایط بهینه تراریختی موقت با روش اگرواینفیلتریشن توسط ژن gus (Irani et al.,2012)، تراریختی موقت گندم با سازه حاوی ژن مصنوعی AYT1 انجام شد. برای انجام ترارریختی ابتدا اگروباکتریوم حاوی ژن AYT1 در محیط LB مایع حاوی mg/ml 100 کانامایسین، در 28 درجه سانتیگراد کشت شد. سوسپانسیون باکتری در OD برابر با 6/0 ، درC˚4، 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه رسوب داده شد. سپس باکتری‌ها با محیط (Murashige & Skoog,1962)MS  با pH=5.2، استوسیرنگون با غلظت  mM10 و بافر MES با غلظت M 5/0 مجددا به صورت سوسپانسیون درآمدند و سپس باکتری‌ها در شیکر C˚ 28 به مدت 3 ساعت انکوبه شدند. این سوسپانسیون باکتریایی برای آلوده­سازی قطعات برگی گندم استفاده شد. قطعات برگ در سوسپانسیون باکتری غوطه ور شدند و به مدت 20 دقیقه تحت خلا قرار گرفتند. سپس با قطع ناگهانی خلا باکتری‌ها به بافت برگ نفوذ کردند. برگ‌ها با آب مقطر استریل شسته شدند و به پتری دیش منتقل شدند. پس از 6روز، از برگ‌ها پروتئین استخراج شد و در واکنش آنزیمی جهت تبدیل DON به 3A DON استفاده شد و فعالیت آنزیمی با TLC بررسی شد.

بررسی فعالیت آنزیمی تراژن‌های AYT1: از گیاهان تراریختی که توسط آنالیزهای مولکولی، تراریختی آنها اثبات شده بود، پروتئین استخراج شد (Ohasto et al. 2007) و در واکنش آنزیمی جهت تبدیل DON به 3A DON استفاده شد. به میزان 100 میکروگرم از پروتئین کل استخراج شده با 40 میکروگرم DON  مخلوط گردید و برای پیشرفت واکنش استیله­شدن، استیل کوآنزیم A با غلظت نهایی mM 1 اضافه شد و حجم نهایی واکنش با Tris-HCl 50Mm pH= 7.5 به 250 میکرولیتر رسید. مخلوط فوق در دمایC ˚ 37 به مدت 24 ساعت نگهداری شد. سپس 250 میکرو لیتر اتیل استات به مخلوط اضافه شد و پس از سانتریفیوژ، روشناور بر روی کاغذ TLC لکه گذاری شد. انتهای کاغذ در درون فاز متحرک کروماتوگرافی (اتیل استات و تولوئن به نسبت 1:3) قرار داده شد. پس از حرکت فاز متحرک در طول فاز ثابت (کاغذ TLC)، کاغذ در دمای اتاق خشک شد و آشکارسازی با مخلوط اتانول و اسید سولفوریک با نسبت 1:9 انجام شد.

نتایج

توالی یابی ژن سنتز شده، صحت آن را در مقایسه با توالی طراحی شده تائید کرد. با استفاده از آزمون کلنی PCR ورود سازه pBI121SA به اگروباکتریوم تایید شد (شکل2) و این باکتری جهت تراریختی گیاهان مورد استفاده قرار گرفت.

  شکل 2- کلنی PCR از اگروباکتریوم، M: نشانگر((Fermentas 1Kb DNA Ladder، 1: کنترل مثبت (pUC+AYT1)، 7-2: آگروباکتریوم‌های تراریخت شده، 8: کنترل منفی (اگروباکتریوم غیرتراریخت).

Figure 2- Colony PCR from Agrobacterium. M: 1kb ladder (Fermentas), 1:Positive control (pUC+AYT1), 2-7: Transfomed Agrobacterium, 8: Negative control (non-transformed Agrobacterium).

جهت آنالیز‌های مولکولی توتون‌های تراریخت 8 گیاه مختلف مورد بررسی قرار گرفتند.DNA  ژنومی از این گیاهان استخراج و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تراژن تکثیر گردید. مشاهده محصولات PCR با اندازه مورد انتظار bp 1441ورود ژن به ژنوم گیاهان را تائید کرد (شکل 3). برای تائید رونویسی از تراژن AYT1، RNA کل از گیاهان منتخب استخراج گردید و از روی آنها cDNA ساخته و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن تکثیر شد. وجود باندی با اندازه تقریبی bp 1441 در گیاهان تراریخت در مقایسه با گیاه غیر تراریخت رونویسی ژن را تائید کرد. با استفاده از کنترل منفی RT-PCR بدون آنزیم Reverse transcriptase، عدم آلودگی RNA با DNA  را نشان داد (شکل 4).

شکل3- محصولات PCR توتون‌های تراریخت شده M: نشانگر1Kb DNA Ladder  (Fermentas) 1-6: گیاهان تراریخت با سازه دارای ژن AYT1، 7: کنترل منفی(گیاه غیرتراریخت)، 8: کنترل مثبت (pUC+AYT1).

Figure 3- PCR products from transformed tobaccos, M: 1kb ladder (Fermentas), 1-6: Syntetic AYT1 Transformed tobaccos, 7: C^- (non-transformed tobacco), 8: C⁺ (pUC+AYT1).

شکل4- RT-PCR از گیاهان تراریخت. M: نشانگر1Kb Ladder  (Fermentas)، 1: کنترل مثبت باآغازگرهای ژن توبولین، 2: کنترل منفی RT-PCRبدون آنزیم Reverse transcriptase، 10-3: گیاهان تراریخت شده باژن سنتزی AYT1، 11: کنترل مثبت (pUC+AYT1)، 12: کنترل منفی (گیاه غیرتراریخت).

Figure 4- RT-PCR products from transformed plants, M: 1kb Ladder (Fermentas), 1: C⁺ by using tubulin primers, C^- RT-PCR without Reverse Transcriptase, 3-10: Transformed plants with synthetic AYT1 gene, 11: C⁺ (pUC+AYT1), 12: C^- (non-transformed plant)

برای ظهور و تشخیص سوبسترا (DON)، محصول حاصل از واکنش آنزیمی از روش کروماتوگرافی بر روی لایه نازک (TLC) استفاده گردید. پروتئین کل از توتون‌های تراریخت و توتون‌های غیر تراریخت بعنوان کنترل منفی و همچنین از برگ گندم تراریخت شده استخراج شد و پروتئین کل در واکنش آنزیمی بعنوان آنزیم استفاده شد. نتایج حاصل از این آزمایشات نشان داد که پروتئین‌های استخراج شده از توتون‌ها و برگ‌های گندم تراریخت فعالیت استیل ترانسفرازی دارند و لکه مربوط به فرم استیله سوبسترا یعنی 3A DON در واکنش آنزیمی مربوط به این گیاهان مشاهده می‌شود (شکل 5و 6). در صورتی که پروتئین‌های استخراجی از گیاهان غیر تراریخت فاقد فعالیت استیل ترانسفرازی بوده و فقط لکه مربوط به سوبسترا DON در ردیف TLC مربوط به آنها مشاهده شد. البته لکه سوبسترا DON در نمونه‌های تراریخت نیز قابل مشاهده بود (شکل 5و 6).

بحث

قارچ  F. graminearum ترکیبات سمی را تولید می‌کند که از عوامل بیماریزا برای انسان می‌باشد. گروه هیدروکسیل موقعیت3 مایکوتوکسین DON باعث تشدید سمیت می‌شود (Shima et al., 1997). جایگزینی این گروه با گروه‌های دیگر مانند استیل و گلیکوزیل باعث می‌شود که سمیت این توکسین برای انسان به ده برابر کمتر از فرم تغییر نیافته (DON) کاهش یابد (Poppenberger et al., 2003). بنابراین تراریختی گیاه با ژن‌های سم‌زدایی کننده مانند  HvUGT13248 که باعث گلیکوزیله شدن (Schweiger et al., 2010) یا ژن‌های Tir101 (Ahmadizade et al., 2013; Muhitch et al.,2000) و یا AYT1
(Sanjarian et al., 2006)  که باعث استیله شدن مایکوتوکسین‌ها می‌شود، می‌تواند گام موثری در این راه باشد. از آنجا که منشا ژن AYT1  مخمری است بهینه سازی کدون جهت بیان در گیاه می‌تواند کمک شایانی به افزایش بیان و خاصیت آنزیمی آن شود. البته مقایسه قدرت سم‌زدایی پروتئین‌های کاندید دیگر با این پروتئین می‌تواند در انتخاب مطلوبترین ژن برای تراریختی گیاه  هدف (گندم) راهگشا یاشد، که این مطالعات در حال انجام است.

مطالعات نشان داده که ارقام مقاوم گندم پس از آلودگی با قارچ عامل FHB، افزایش بیان آنزیم P450 منواکسیزناز را نشان می­دهند که این آنزیم توانائی سمیت­زدائی DON را دارد (Li et al., 2010). آنزیم گلوتاتیون­ترانسفراز نیز از طریق تشکیل ترکیب گلوتاتیون-DON می­تواند در سمیت­زدائی این میکوتوکسین نقش داشته باشد (Karlovsky, 2011). همچنین آنزیم گلیکوزیل­ترانسفراز در آرابیدوپسیس که به وسیله ژن DOGT1 کد می­شود DON را به حالت گلیکوزیله که سمیت پایین­تری دارد، تبدیل می­کند (Poppenberger et al. 2003). در مطالعه حاضر افزایش مقاومت به DON در گیاهان گندم با بیان ژن مصنوعی AYT1 مخمر برای اولین بار مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که ژن سینتتیک AYT1، هم در گیاه توتون و هم در گندم قابلیت تبدیل  فوزاری توکسین DON را به 3-A DON  دارد. اگرچه این عمل بطور کامل صورت نمی‌گیرد و مقداری از سوبسترا همچنان باقی می‌ماند که این در مورد سایر ژن‌های استیله کننده نیز صادق است(Ohasto et al., 2007). بنابراین این ژن مصنوعی می‌تواند بعنوان یک ژن کاندید جهت سم‌زدایی از مایکوتوکسین‌ها و تراریختی گندم مطرح باشد و جهت مقابله با بیماری FHB به گندم انتقال یابد.

تشکر و قدردانی

این تحقیق بخشی از پایان نامه کارشناسی ارشد نویسنده اول است. نویسندگان از پژوهشگاه مهندسی ژنتیک و زیست فناوری  به دلیل فراهم آوری امکانات انجام این تحقیق قدردانی می‌نمایند. یاد و خاطره دانشمند گرانقدر جناب آقای دکتر حق نظری را گرامی می‌داریم، روحش شاد.