کلونینگ و بیان ژن غیر ساختاری 3ABC ویروس تب برفکی سروتایپ Oدر باکتری اشرشیاکلی

کلونینگ و بیان ژن غیر ساختاری 3ABC ویروس تب برفکی سروتایپ  Oدر باکتری اشرشیاکلی

سید امیررضا پریزاده¹، محمد رضا نصیری²، سعید زیبایی*³، مجتبی طهمورث پور²، محمدرضا باسامی¹

¹ دانشجوی دکتری، گروه علوم دامی، دانشگاه فردوسی مشهد

² استاد، گروه علوم دامی، دانشگاه فردوسی مشهد

3 استادیار، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه شمال شرق کشور مشهد

تاریخ دریافت: 11/03/1393، تاریخ پذیرش: 13/05/1393

چکیده

بیماری تب برفکی اولین بیماری ویروسی شناخته شده در حیوانات است که با گذشت بیش از صد سال از شناخت آن، همچنان یکی از مهمترین خطراتی است که صنعت دامپروری دنیا را تهدید می‌نماید. یکی از مهمترین روش های شناسایی حیوان واکسینه شده از حیوان مبتلا به تب برفکی استفاده از پروتئین غیرساختاری  3ABCبه عنوان آنتی ژن در کیت الایزا می باشد. از این رو، ژن 3ABC ویروس تب برفکی سروتایپ  Oبا استفاده از واکنش زنجیره پلیمراز و پرایمرهای اختصاصی حاوی سایت های برشی BamHI و HinDIII جداسازی شد. به منظور بررسی خصوصیات نوکلوتیدی، ژن تکثیر شده به ناقل pTZ57R/T انتقال و حضور ژن هدف در ناقل کلونینگ pTZ57R/T با استفاده از روش­های کلونی PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. به منظور تولید آنتی ژن نوترکیب، ژن هدف به ناقل بیانی pET21a (+) وارد و سپس به باکتری اشرشیاکلی BL21(DE3) به عنوان میزبان بیان منتقل شد. باکتری حاوی ناقل نوترکیب با استفاده از IPTG در غلظت نهایی5/1 میلی مولار القا شد. تولید پروتئین نوترکیب با استفاده از الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ تایید شد. وزن مولکولی پروتئین تولید شده در حدود 50 کیلودالتون مشخص شد. نتایج نشان داد که از پروتئین نوترکیب تولید شده می توان به خوبی به عنوان آنتی ژن در کیت تشخیصی الایزا برای حیوانات استفاده شود.

کلید واژه ها: ژن 3ABC، تب برفکی، FMDV، پروتئین نوترکیب

مقدمه

بیماری تب برفکی اولین بیماری ویروسی شناخته شده در حیوانات است که با گذشت بیش از صد سال از شناخت آن، همچنان یکی از مهمترین خطراتی است که صنعت دامپروری دنیا را تهدید می‌نماید. این بیماری حیوانات وحشی و اهلی زوج سم به ویژه تولید کنندگان شیر و گوشت را آلوده می‌کند (Tullyet al., 2009؛Qianet al., 2004؛ Doryet al., 2009). علاوه بر حیوانات اهلی، این ویروس همچنین می­تواند بیش از 30 گونه از حیوانات حیات وحش را آلوده نماید (Thomson., 2003). ویروس عامل بیماری تب برفکی از خانواده پیکورناویریده و از جنس آفتوویروس است که دارای هفت سروتیپ O، A، Asia1، SAT1، SAT2 و SAT3 و سویه­های متعددی می‌باشد (Hemaet al., 2009). عواملی نظیر تعداد سروتایپ­ها و تحت تیپ‌های ویروس، استعداد بالای این ویروس به جهش (در نتیجه تغییرات سریع آنتی ژنیکی)، قابلیت بقاء بالای ویروس در طبیعت، قابلیت شیوع سریع (شدت واگیری 100%)، دور ماندن علائم کلینیکی در اثر ابتلا به بعضی از تحت تیپ­های خاص در بعضی از حیوانات، به خصوص گوسفند، قدرت انتقال بین گونه­ای، شکل­گیری حاملین، هزینه بسیار زیاد کنترل و مبارزه، هزینه زیاد تشخیص و اعمال مقررات سنگین بین­المللی برای کشورهایی که واجد بیماری هستند سبب افزایش اهمیت بیماری تب برفکی می شوند (Fry et al., 2005).

واکسن‌های متداول تب برفکی با استفاده از کشت سلولی (BHK21) تهیه می‌شوند. ویروس تکثیر شده در این سلول‌ها توسط روش‌های شیمیایی، مانند روش اتیلن ایمین مضاعف (BEI) غیر فعال می‌شود (Song et al., 2005). در بعضی موارد ویروس به شکل کامل غیر فعال نشده و در نتیجه منبعی برای آلودگی محسوب می‌گردد(Kim et al., 2006؛ Pengyan et al., 2008؛ YI et al., 2004). در این میان، جدا کردن حیوانات واکسینه شده و غیر واکسینه ممکن است به علت فقدان تکنولوژی تفریقی لازم، مشکل باشد (Brown et al.,2003; Priyadharshini et al., 2007). با توجه به معایب ذکر شده در واکسن ها، اولین گام در کنترل بیماری تب برفکی، تشخیص دقیق و سریع بیماری و سروتایپ عامل آن می‌باشد. برای تشخیص دقیق و درست آن به آزمون­های تشخیصی سریع و حساس نیاز است که توانایی تفکیک حیوانات واکسینه از حیوانات ناقل را دارا باشند. در حال حاضر سنجش آنتی‌بادی علیه پروتئین‌های غیرساختاری به خصوص پروتئین غیرساختاری 3ABC ویروس بیماری تب ‌برفکی تنها ابزار کارآمد جهت تفکیک حیوانات واکسینه از حیوانات آلوده گزارش شده است (Priyadharshini et al., 2007). تولید سنتتیک پپتیدهای غیرساختاری بسیار هزینه بر و نیازمند تکنولوژی خاص است. از طرفی در این روش تنها یک اپی‌توپ تولید می شودکه سبب کاهش احتمال تفرق حیوان مبتلا از حیوان واکسینه شده می شود (Clavijo et al., 2004). از این نظر، تولید نوترکیب پروتئین های غیرساختاری در باکتری اشرشیاکلی به دلیل سهولت در تخلیص و ارزان بودن پیشنهاد شده است. ویروس مربوطه در بدن حیوانات ناقل تولید پروتئین‌های غیرساختاری می نماید، در صورتیکه در حیوانات واکسینه شده این پروتئین ها وجود ندارند. با توجه به نقش مهم ژن های 3A ، 3B و 3C (ناحیه ژنی 3ABC) در تولیدپروتئین غیرساختاری، به نظر می رسد کلونینگ و بیان این ناحیه ژنی و استفاده از آن به عنوان پروتئین نوترکیب جهت تحریک سیستم ایمنی میزبان و جهت استفاده به عنوان آنتی ژن در کیت تشخیصی الایزا برای حیوانات مورد نظر امکان پذیر می باشد. بنابراین، در این مقاله ژن 3ABC سروتایپ O ویروس تب برفکی به عنوان ژن کاندیدا جهت توالی یابی و کلونینگ و بیان ژن با هدف استفاده از آن در تولید کیت تشخیصی الایزا در آینده انتخاب شد.

مواد و روش ها

ویروس تب برفکی

ویروس تب برفکی سروتیپ O از موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه شمال شرق بر روی محیط کشت BHK-21 تهیه گردید.

سویه های باکتری، پلاسمیدها و محیط کشت ها

سویه های اشرشیا کلی DH5ɑ و BL21(DE3) به ترتیب به عنوان میزبان کلونینگ و بیان انتخاب شدند. پلاسمیدهای pTZ57 R/T  (Fermentas) و pET21a(+) (Novagen) به عنوان ناقلهای کلونینگ و بیان ژن مورد استفاده قرار گرفتند. سلول باکتری حاوی ناقل دستورزی شده بر روی محیط کشت مایع Luria Broth (1درصد تریپتون، 5/0 درصد عصاره مخمر، 5/0 کلرید سدیم) حاوی  µg/ml100 آمپی سیلین کشت داده شد. pH محیط کشت 5/7 تنظیم و سلول ها در 37 درجه سانتیگراد به شکل هوازی کشت داده شدند.

تکثیر و کلونینگ ژن 3ABC

استخراج RNA ژنومی از محیط کشت سلول BHK-21 با استفاده از کیت استخراج Nucleic Acid Kit High Pure viral (ساخت شرکت Roche) انجام شد. ساخت cDNA ژنومی با استفاده از کیتRevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit/ Thermo صورت گرفت. به منظور تأیید سروتیپ O بودن ویروس مورد استفاده، واکنش زنجیره پلیمراز (PCR) با استفاده از جفت آغازگرهای 5`GCTGCCTACCTCCTTCAA3 و 5`AGCTTGTACCAGGGTTTGGC3` جهت تکثیر قطعه 402 جفت بازی 1D/2B به منظور تایید سروتایپ O ویروس تب برفکی انجام گردید (Reidet al., 2001). ژن 3ABC با استفاده از آغازگرهای اختصاصی رفت5' GGATCCGCGATCTCAATTCCTTCCCAAAAGTC 3' و برگشت 5' CCTGAACCACAACACGAGCCCAAGCTT 3' که حاوی جایگاه برشی آنزیم های BamHI در انتهای 5' آغازگر رفت و HindIII در انتهای 3' آغازگر برگشت بود، تکثیر شد. واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) با استفاده از 5/2 میکرولیتر بافر آنزیم Pfu (Fermentas)، 25/1 واحد از آنزیم Pfu پلی مراز (Fermentas)، 1 میکروگرمcDNA ژنومی، 5/2 میکرولیتر dNTP و 25/0 میکرومول از آغازگرها در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. برنامه حرارتی جهت تکثیر ژن 3ABC با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (T-Personal) ساخت آلمان به صورت زیر انجام شد: واسرشت سازی 60 ثانیه در C˚94، اتصال 30 ثانیه در C˚60 و بسط 30 ثانیه در C˚72 برای 35سیکل. یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای C˚94 برای 3 دقیقه و یک مرحله بسط نهایی به مدت 10 دقیقه در C˚72 نیز انجام گردید. محصول PCR به ناقل کلونینگ pTZ57R/T وارد و سپس به اشرشیا کلی DH5α منتقل شد.

توالی یابی ژن 3ABC

ناقل نوترکیب pTZ57R/T حاوی ژن 3ABC به منظور تعیین توالی به شرکت Bioneer کره جنوبی ارسال گردید. مقدار 30 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای عمومی رفت و برگشت به ترتیب T7 Primer وT7 terminator با غلظت 10 پیکومول به همراه نمونه­ها جهت توالی یابی فرستاده شد. این نمونه‌ها با استفاده از دستگاه ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر توالی‌یابی شدند. ابزار BLAST و رویه blastn در پایگاه NCBI جهت تعیین همولوژی توالی‌ها استفاده گردید. از الگوریتم و نرم افزار  PHRED(Ewing and Green, 1998) به منظور اصلاح نوکلئوتیدی توالی ها استفاده شد. وزن مولکولی پپتید قابل پیش‌بینی جهت تولید با استفاده از نرم افزارCLC Workbench 5 محاسبه گردید. ساختار پروتئینی 3ABC با استفاده از Swiss-pdbv -http://www.expasy.ch/spdbv)) مدل سازی و مشخص شد.

بیان پروتئین 3ABC

استخراج پلاسمید pTz57R/T+3ABC با استفاده از کیت Miniprep، شرکت Thermo صورت گرفت. هضم آنزیمی برای پلاسمیدهای pTz57R/T+3ABC و ناقل بیانی pET21a(+) با استفاده از آنزیم های برشی BamHI و HindIII انجام شد. سپس محصول هضم با استفاده از کیت #K0513 ساخت شرکت Promega از روی ژل استخراج گردید و واکنش الحاق با استفاده از آنزیم T4 DNA لیگاز (Roche) صورت گرفت. پلاسمید نوترکیب حاصل به منظور تکثیر به باکتری اشرشیا کلی DH5α وارد شد و بر روی محیط کشت LB-Agar حاوی µg/ml100 آمپی‌سیلین کشت داده شد. غربالگری و انتخاب کلنی حاوی ژن هدف با استفاده از روش کلنیPCR و هضم آنزیمی انجام گردید. ناقل بیانی جهت بررسی چارچوب خوانش صحیح با استفاده از پرایمرهای عمومی T7 Primer و T7 terminator جهت توالی یابی به شرکت Bioneer کره جنوبی ارسال شد. سپس ناقل بیانی نوترکیب به میزبان بیان اشرشیاکلی BL21(DE3) منتقل گردید و تک کلنی نوترکیب به مدت 16 ساعت در 3 میلی لیتر محیط کشت مایع LB حاوی آمپی‌سیلین کشت داده شد. یک میلی لیتر از محیط کشت تهیه شده به 100 میلی‌لیتر محیط کشت مایع حاوی آمپی سیلین اضافه و تا رسیدن به OD، 620 نانومتر در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور شیکردار انکوبه شد. در این مرحله، نمونه صفر برداشته و سپس IPTG در غلظت نهایی 5/1 میلی مولار به محیط کشت اضافه شد. نمونه برداری در ساعت های صفر،1، 2، 3و 4 به منظور مشخص کردن بیان آنتی ژن 3ABC نوترکیب صورت گرفت. سلول ها در rpm 8000 سانترفیوژ و پس از اضافه کردن 100 میکرولیتر بافر لاملی به مدت 10 دقیقه در آب جوشانده شدند. محصول در rpm 8000 سانترفیوژ و محلول رویی و انتهایی بر روی ژل اکریل آمید 12 درصد الکتروفورز شدند.

وسترن بلاتینگ

پس از الکترفورز پروتئین، وسترن بلاتینگ با استفاده از کاغذ نیترو سلولز صورت گرفت. غشا با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) 5 درصد محلول در TBS بلوکه گردید. سپس غشا در محلول آنتی بادی اولیه آنتی His-tag در TBST (TBSهمراه با 1 درصد Tween20) با رقت 1:1000 برای یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس سه بار شستشو با TBST انجام گرفت و غشا در محلول آنتی بادی ثانویه با رقت 1:1500 برای یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید. بعد از شستشو آنتی بادی ثانویه، غشا با استفاده از محلول رنگ‌زای DAB  (امریکا، Sigma) رنگ آمیزی شد.

نتایج و بحث

کلونینگ ژن 3ABC در ناقل pTZ57R/T

نتایج PCR پرایمرهای 1D/2B، سروتایپ O ویروس تب برفکی استفاده شده در این پژوهش را تایید کرد. برای قطعه‌ ژنی 1D/2B باندی به طول 402 جفت باز روی ژل آگارز مشاهده شد (شکل1). ناحیه کد کننده 3ABC بروی ژل آگارز 1 درصد نشان داد که قطعه اختصاصی به طول 1320 جفت باز، به خوبی تکثیر شده است (شکل2). عدم حضور باند در کنترل منفی و حضور قطعات اختصاصی، نشان از دقت و صحت انجام واکنش داشت. حضور ژن 3ABC در ناقل pTZ57R/T با روش کلونی PCR و هضم آنزیمی تایید گردید (شکل3). در سال 2004، پژوهشگران ژن 3ABC ویروس تب برفکی سروتایپ O برزیل را به طول 1303 جداسازی نمودند (Clavijo et al., 2004). همچنین اولین گزارش مربوط به تولید پروتئین غیرساختاری ویروس تب برفکی در مخمر پیشیا پاستوریس مربوط به سال 2007 است که در آن محققان ژن 3AB را به طول 670 جفت باز بیان کردند (Priyadharshiniet al., 2007). گزارش شده که پروتئین‌ غیر ساختاری‌ 3C ‌باعث تحریک ‌پاسخ ایمنی هومورال‌، القا تکثیر سلول‌های T و کاهش حساسیت شدید به واکسن DNA می‌شوند (Barron et al., 2001). در پژوهش (1994)Rodriguez et al. ایمن زایی پروتئین­های غیرساختاری Leader، 2C، 3A، 3B، 3C، 3AB، 3ABC و3D را در خوک ارزیابی نمودند و اختصاصی بودن آنتی­بادی­های ضد ویروس بیماری تب‌برفکی را علیه این پروتئین­های غیرساختاری موجود در سرم خوک­های آلوده یا واکسینه شده بررسی نمودند. نتایج به دست آمده نشان ­داد که پلی­پپتید 3ABC ایمن­زاترین پروتئین غیرساختاری بود و می‌تواند برای تشخیص مؤثر خوک­های آلوده از خوک­های واکسینه شده به کار گرفته شود (Rodriguez et al., 1999).

شکل 1- الگوی الکتروفورز ژل آگارز تکثیر قطعه‌ای 1D/2B

Figure 1- Agaros electrophoresis pattern of 1D/2B gene PCR products.

شکل 2- الگوی الکتروفورزی ژل آگارز (یک درصد) تکثیر قطعه‌ای ژنی 3ABC ویروس تب برفکی با آغازگرهای لینکر دار. ستون‌های 1 و3 قطعه‌ای ژنی 3ABC، ستون 2 مارکر 1Kb و ستون 4 کنترل منفی.

Figure 2- Electrophoresis of PCR products 3ABC FMDV with linker primer on agarose gel (1%). S1and S3:3ABC PCR Product (1320bp), S2:M = 1kb DNA Ladder, S4: negative control.

شکل 3- شکل A- الگوی الکتروفورزی ژل آگارز کلونی PCR، ستون 1و2 کلونی PCR، ستون 3 کنترل منفی و ستون 4 مارکر 1kb. شکلB- ستون 1 مارکر 1kb و ستون 2 : هضم آنزیمی pTZ57R/TP1-3ABC.

Figure 3- Figure A- Agaros electrophoresis of Colony PCR. S1 and S2:Clony PCR, S3:negative control, S4:1kb DNA Ladder, Figure B- S1: 1kb DNA Ladder, S2: Double digest of pTZ57R/TP1-3ABC.

آنالیز توالی آنتی ژن 3ABC

توالی نوکلوتیدی و پروتئینی ژن 3ABC ویروس تب برفکی سروتایپ O ایران در شکل 4 نمایش داده شده است. ژن 3ABC بیان شده شامل 1362 جفت باز و 455 اسید آمینه می باشد. همانطور که در شکل مشخص شده چارچوب خوانش صحیح +1 می باشد که پروتئین ها را به درستی بیان کرده است. همچنین توالی ژنی این ناحیه به منظور درک روابط بین سروتایپ­های مختلف در حال گردش با توالی­های 3ABC سروتایپ­های A، O، Asia1، SAT1، SAT2 و SAT3 ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی بانک ژن مورد مقایسه قرار گرفت. براساس نتایج به دست آمده از این مقایسه، کمترین شباهت (7/63 درصد) با ایزوله SAT2-Uga 1-07 آفریقای جنوبی و بیشترین شباهت (9/93 درصد) با ایزوله  Asia1-IND 148-01هند به دست آمد. پژوهشگران ژن 3AB تب برفکی سروتایپ O را در ناقل pTZ57R/T بیان کردند و ارتباط فیلوژنتیکی این ژن را با دیگر سروتایپ‌ها بررسی کردند (Ahmadpoor, 1391). با آنالیزهای مجازی تولید پروتئین، با ترجمه ناحیه کدکننده آنتی ژن 3ABC و با استفاده از پایگاه اطلاعاتی Expasy انجام شد. پروتئین نوترکیب تولید شده در این پژوهش دارای وزن مولکولی در حدود 50 کیلو ‌دالتون است. ساختار سه بعدی این پروتئین پیش بینی شد (شکل5).

شکل 4- توالی نوکلوتیدی و پروتئینی ژن 3ABC.

Figure 4- Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of 3ABC gene.

شکل 5- ساختار پروتئینی پیش بینی شده توسطSwiss-pdbv .

Figure 5- The secondary structural model of 3ABC in Swiss-pdbv.

بیان آنتی ژن 3ABC در اشرشیاکلی

ناحیه کدکننده آنتی ژن 3ABC به شکل موفقی از پلاسمید نوترکیب pTZ57R/T+3ABC هضم و از ژل تخلیص شد. فرآورده تکثیر خالص‌سازی شده حاوی جایگاه‌های برشی برای آنزیم‌های BamHI و HindIII بود در جایگاه همسانه‌سازی ناقل pET21a(+) با موفقیت الحاق شد. محصول الحاق به شکل موفقی به اشرشیا‌کلی BL21(DE3) منتقل گردید و نتیجه کلنی PCR و هضم آنزیمی با آنزیم های BamHI وHindIII صحت انجام واکنش را تایید کرد (شکل 6). پس از القای بیان ژن با استفاده IPTG 5/1 میلی مولار، الکتروفورز محصولات القا باند پروتئینی بزرگی را در وزن مولکولی 50 کیلو دالتون نشان داد (شکل 7). وزن مولکولی آنتی ژن با مقدار تخمین زده شده در نرم افزار CLC Workbench 5 و Swiss-pdbv همخوانی داشت. با استفاده از آنالیزهای دات بلات و وسترن بلات باندهای پروتئینی به غشای نیتروسلولز منتقل و تشکیل باند در ناحیه 50 کیلودالتون تولید آنتی ژن نوترکیب راتایید نمود (شکل 8). در سال 2004 محققان پروتئین نوترکیب 3ABC را در اشرشیاکلی بیان نمودند و وزن ملکولی آن را 62 کیلودالتون تخمین زدند (Clavijo et al., 2004). 13 کیلودالتون وزن مولکولی اضافه تولید شده این پروتئین نسبت به تحقیق حاضر، به دلیل حضور توالی محلول کننده­ی است که در پایان ژن 3ABC در نطر گرفته شده است. اگرچه محققان توانستند با بیان ژن 3AB در مخمر مقدار پروتئین بیشتری تولید کنند، اما از آنجا که مخمرها تغییرات بعد از ترجمه ای شدیدی را بر روی پروتئین تحمیل می‌کنند، بررسی های بالینی جهت موفق عمل کردن پروتئین بایستی انجام گردد (Priyadharshiniet al., 2007).

تشکر و قدردانی

این پروژه در آزمایشگاههای دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد و موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه شمال شرق انجام گرفته و بدین ترتیب از مسولان مربوطه کمال تشکر را داریم.