بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‏های رازیانه با استفاده از نشانگرهای ISSR و RAPD

طاهری, صفورا; ضابط, محمد; ایزانلو, علی; ایزدی دربندی, علی

doi:10.22103/jab.2016.1394

تعداد نشریات	26
تعداد شماره‌ها	447
تعداد مقالات	4,557
تعداد مشاهده مقاله	5,380,003
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	3,580,074

بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‏های رازیانه با استفاده از نشانگرهای ISSR و RAPD

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 8، دوره 7، شماره 4، اسفند 1394، صفحه 113-128 اصل مقاله (469.44 K)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2016.1394

نویسندگان

صفورا طاهری^* ¹؛ محمد ضابط²؛ علی ایزانلو²؛ علی ایزدی دربندی³

¹دانشجوی کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بیرجند

²استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بیرجند

³استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس ابوریحان، دانشگاه تهران.

چکیده

رازیانه بعنوان یک گیاه معطر و دارویی از زمان‏های بسیار دور توسط کشاورزان در مناطق مختلف ایران با اقلیم های متفاوت کشت و کار می‏گردد. در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 32 اکوتیپ رازیانه توسط دو نشانگر RAPD و ISSR مورد ارزیابی قرار گرفت. نشانگر RAPD در مجموع 106 قطعه چند شکل و توسط نشانگر ISSR ، 72 قطعه چند شکل تکثیر شد. باتوجه به داده‏های آغازگر RAPD و ISSR میانگین تنوع ژنی با استفاده از شاخص نی (h) برابر با 3739/0 و 2944/0 و با استفاده از شاخص اطلاعاتی شانون (i) برابر 552/0 و 4563/0 بدست آمد. میانگین محتوای چندشکلی (PIC) بدست آمده برای نشانگرهای RAPD و ISSR به ترتیب 4274/0 و 4192/0 برآورد گردید. در گروه‏بندی انجام شده براساس نشانگر RAPD اکوتیپ‏های مورد مطالعه در 7 و بر اساس نشانگر ISSR در 11 گروه طبقه‏بندی شدند. این نتایج نشان می‏دهد که رازیانه‏های ایران دارای تنوع ژنتیکی بالایی هستند و نشانگرهای RAPD و ISSR به خوبی ژنوتیپ‏های رازیانه را براساس توزیع جغرافیایی و تشابهات اقلیمی از هم تفکیک نمود. آگاهی از این تنوع ژنتیکی می‏تواند اصلاحگران را در برنامه‏های اصلاحی به خصوص دورگیری بین اکوتیپ های دور، مطالعات تکاملی و طبقه بندی یاری نماید.

کلیدواژه‌ها

آلل‏های موثر؛ تجزیه خوشه ای؛ تنوع ژنتیکی

اصل مقاله

بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‏های رازیانه با استفاده از نشانگرهای ISSR و RAPD

صفورا طاهری*¹، محمد ضابط²، علی ایزانلو²، علی ایزدی دربندی³

1- دانشجوی کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بیرجند

2- استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بیرجند

3- استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس ابوریحان، دانشگاه تهران.

تاریخ دریافت: 27/03/1393، تاریخ پذیرش: 21/01/1394

چکیده

واژه‏های کلیدی: آلل‏های موثر، تجزیه خوشه ای، تنوع ژنتیکی.

مقدمه

رازیانه با نام علمی Foeniculum vulgare. Mill متعلق به خانواده چتریان[1] بعنوان یک گیاه معطر و دارویی شناخته شده‏است. یکی از گیاهان دارویی مهم در صنعت بسیاری از کشورهای توسعه یافته محسوب می‏شود. این گیاه نقش مهمی در صنایع کشاورزی و دارویی در ایران دارد، در اکثر مناطق ایران کشت می‏شود و با آب و هوای ایران سازگاری پیدا کرده است (Hasani et al., 2011). ژرم‏پلاسم یک منبع حیاتی برای تولید گیاهان جدید با صفات مطلوب است که به افزایش تولید محصول با کیفیت و در نتیجه بهبود سطح تغذیه انسان منجر می‏شود (Zahid et al., 2009). رازیانه در طبیعت به دلیل برداشت‏های بی‏رویه تحت فشار می‏باشد و به زودی در ردیف گونه‏های در خطر انقراض قرار می‏گیرد و اگر اقدامات حفاظتی در راستای نگهداری آن انجام نشود خطر فرسایش ژنتیکی دور از انتظار نیست. اطلاعات تنوع ژنتیکی برای مدیریت گونه‏های نادر و در حال انقراض مهم می‏باشد (Bhmani et al., 2012).

کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی میان افراد یا جمعیت‏ها و آگاهی از روابط خویشاوندی گونه‏های مورد نظر در برنامه‏های اصلاحی، امکان سازماندهی ژرم‏پلاسم و نمونه‏گیری موثر از ژنوتیپ‏ها را فراهم می‏سازد. اولین قدم در اصلاح خصوصیات گیاهی، شناخت خصوصیات ژنتیکی نمونه‏های ژرم‏پلاسم است که این موضوع به نوبه خود نمونه‏گیری سیستماتیک از ژرم‏پلاسم را برای مقاصد اصلاحی و حفاظتی امکانپذیر می‏سازد (Hasani et al., 2011). به منظور حفظ، ارزیابی و استفاده از ژرم پلاسم کارآمد و موثر برای بازده و ایجاد ثبات تولید در هنگام مواجه با استرس‏های محیطی و شیوع بیماریها از بررسی میزان تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی/ ژنتیکی استفاده می‏شود (Gept. 1993).

تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی بوسیله بررسی صفات مورفولوژی و در سطح مولکولی با استفاده از ابزارهای مبتنی‏بر ژنتیک، تکنیک‏هایDNA ، روش‏های پیشرفته مولکولی و غیره انجام می‏گردد (Zahid et al., 2009). در سالهای اخیر از نشانگرهای مولکولی در مواردی زیادی مانند مطالعات پایه‏ای و کاربردی موجودات مختلف استفاده شده‏است. به‏طوری که کشف انواع مختلفی از نشانگرهای مولکولی باعث پیشرفت عمده‏ای در مطالعات ژنتیکی گردیده‏است.

از نشانگرهای مولکولی در مواردی مانند ایجاد نقشه‏های ژنتیکی و فیزیکی در موجودات زنده و شناسایی ژن‏های کمی و کیفی و طبقه‏بندی آنها و میزان تنوع ژنتیکی بین موجودات استفاده شده ‏است (GhareYazi. 1996). در زمینه استفاده از نشانگرهای مولکولی مطالعات وسیعی در گیاهان مختلف صورت گرفته است (سورنی و همکاران، 1392؛ کیانی و همکاران، 1392؛Almdari et al., 2011 Yousefi et al., 2011;)؛ اما در مورد رازیانه و به خصوص اکوتیپ‏هایی که در ایران وجود دارند، مطالعات اندکی صورت گرفته است. با توجه به وجود توده‏های متفاوت و همچنین نمونه‏های ژنتیکی مختلف در درون یک توده که در اقلیم‏های مختلف کشور می‏رویند به‏نظر می‏رسد که تفاوت‏هایی ازنظر ژنتیکی، خصوصیات فنولوژیکی، مقاومت به تنش‏های خشکی و شوری و برخی از بیماری‏ها و نیز در میزان اسانس و مواد موثره و غیره در بین آنها وجود داشته باشد (Bahmani. 2011 ).

در پژوهشیZahid et al., (2009) در پاکستان 50 نمونه رازیانه از نقاط مختلف کشور را جمع‏آوری کردند و تنوع ژنتیکی آنها را با استفاده از 30 نشانگر RAPD بررسی کردند که 24 نشانگر باندهای واضحی تولید کردند. نتایج آنها نشان داد که در بین این 50 نمونه از لحاظ ژنتیکی تفاوت‏های زیادی وجود داشت؛ این نشانگرها 48 درصد چند شکلی تولید کردند. در بررسی تنوع ژنتیکی رازیانه به کمک نشانگر RAPD، Groveri et al., (2011) نشان دادند که تنوع ژنتیکی موجود بین واریته‏های مورد مطالعه طبیعی نبوده و حاصل انتخاب‏های مصنوعی است. در پژوهشی Abou El-Nasr et al., (2013) سه واریته رازیانه را با استفاده از نشانگرهای ISSR و RAPD مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که اختلاف قابل توجهی بین واریته‏ها براساس صفات فنوتیپی مورد بررسی و همچنین تنوع ژنتیکی بین آنها وجود دارد. به وسیله نشانگرهای ISSR و RAPD، Bahmani et al., (2012) تنوع ژنتیکی 25 ژنوتیپ‏ رازیانه را بررسی و تنوع ژنتیکی بالایی را در ژنوتیپ‏های مورد مطالعه مشاهده نمودند. در گروه بندی انجام شده ژنوتیپ‏ها در 10 گروه طبقه بندی شد و در هر گروه وجود تشابهات جغرافیایی و اقلیمی میان آنها گزراش گردید. هدف از انجام این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‏های رازیانه با استفاده از نشانگرهای ISSR و RAPD و مقایسه دو سیستم نشانگری در بررسی تنوع می‏باشد.

مواد و روش

در این تحقیق 32 ژنوتیپ مختلف رازیانه مورد تحقیق قرار گرفتند (جدول 1). 31 نمونه بذر رازیانه پراکندگی کاملی از تمام مناطق ایران (غرب، شمال، جنوب، شرق و مرکز) داشته و یک نمونه خارجی (رازیانه رومی) بود.

استخراج DNA به روش دلاپورتا (Dellaporta et al., 1993) با کمی تغییر انجام شد.

جدول1- منشاء 32 اکوتیپ رازیانه از مناطق مختلف کشور.

Table1- Fennel 32 ecotypes originating from different regions of the country.

شماره اکوتیپ Ecotype Number	منطقه Region	شماره اکوتیپ Ecotype Number	منطقه Region	شماره اکوتیپ Ecotype Number	منطقه Region
1	اردکان	12	برازجان	23	سبزوار
2	بجستان	13	تبریز	24	آران بیدگل
3	کاشان	14	سنندج	25	سربیشه
4	آباده	15	دیواندره	26	خوسف
5	اهواز	16	شیراز	27	مشهد
6	دهگلان	17	قم	28	نیشابور
7	سردشت	18	ارومیه	29	گناباد
8	سقز	19	اصفهان	30	رومی (هند)
9	کرمان	20	محلات	31	ایلام
10	کامیاران	21	شبستر	32	بجنورد
11	نیریز	22	رزن

از هر نمونه 2-3 گرم برگ در حضور ازت مایع پودر و برگهای پودر شده به تیوپهای2 میلی لیتری حاوی 600 ماکرولیتر بافر استخراج ] Tris-HCL (1mM, pH=8), EDTA(10ml, 0/5 mM, pH=8), (Nacl 10mM, 5 mM) [ به همراه 80 میکرولیتر SDS 10 درصد اضافه شد. بعد از ورتکس نمونهها به مدت 15 دقیقه در حمام آب گرم (60-50 درجه) انکوبه شد. پس از سرد نمودن نمونهها، 600 میکرولیتر از مخلوط فنول:کلروفورم به تیوپها اضافه شد. نمونهها مدت 10 دقیقه و با دور 4000 سانتریفیوژ شدند. فاز بالایی به تیوپ جدید حاوی 600 میکرولیتر کلروفرم: ایزوآمیل (بترتیب به نسبت 24 به 1) منتقل و به آرامی مخلوط گردیدند و طبق شرایط قبلی سانتریفیوژ گردیدند. فاز بالایی تیوپها به تیوپهای جدید حاوی 60 میکرولیتر استات سدیم با pH=8 و 600 میکرولیتر ایزوپروپانول سرد منتقل و آنها را به‏مدت 2 دقیقه سروته تا کلاف DNA ظاهر شود. نمونهها در 4000 دور به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد تا DNA در ته تیوپها رسوب کند. پس از حذف فاز مایع، 1 میلی لیتر اتانول 70 درصد اضافه کرده و سپس به‏مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ و پس از حذف اتانول نمونهها تا حد ممکن خشک شدند. بعد از خشک شدن اتانول، DNA را در 1 میلی لیتر آب مقطر حل و سپس DNA های استخراج شده در یخچال 20- نگهداری شدند.

بعد از سنجش کمیت و کیفیت DNA استخراج شده به وسیله الکتروفورز و نانودراپ، DNA مجدد رسوب داده شد تا کیفیت آن بهبود یابد. برای انجام PCR‌ از‏ 9 آغازگر RAPD و 6 آغازگر ISSR (نشانگرها از شرکت دنازیست تهیه گردید) استفاده شد (جدول 2).

جدول 2 - مشخصات آغازگرهای ISSR و RAPD.

Table2- ISSR and RAPD primersprofile.


محتوای GC Gc content	دمای اتصال Junction temperature	توالی آغازگر Sequencing primer	شماره آغازگر Number primer	نشانگر Primer
70%	33	5َ_TGCGGCTGAG_3َ	1
70%	33	5َ_GGCACTGAGG_3َ	2
60%	33	5َ_GTGCCTAACC_3َ	3
70%	33	5َ_GATGACCGCG_3َ	4
70%	33	5َ_CTCTCCGCCA_3َ	5	RAPD
70%	33	5َ-CAGGCCCTTC_3َ	6
60%	33	5َ-AGTCAGCCAC_3َ	7
60%	33	5َ-AATCGGGCTG_3َ	8
60%	33	5َ-CAATCGCCGT_3َ	9
44/44%	51/6	5^'-(AG)₈YT-3^'	1
47/06%	50	5^'-(AG)₈T-3^'	2
47/06%	50	5^'-(GA)₈T-3^'	3
50%	53/9	5^'-(CT)₈RG-3^'	4	ISSR
41/18%	47/6	5^'-DBD(AC)₇-3^'	5
50%	53/9	5^'-(AG)₈RC-3^'	6

چرخه حرارتی PCR برای نشانگر ISSR شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و 42 مرحله بعدی واسرشت سازی در 94 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه صورت گرفت، مرحله اتصال در دمای مناسب آغازگر (53-47 درجه سانتی گراد) به مدت 1 دقیقه، مرحله بسط در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه و مرحله بسط نهایی جهت تکمیل رشته‏های دوتایی DNA در 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. چرخه حرارتی PCR برای نشانگر RAPD شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و در 42 مرحله بعدی واسرشت سازی در 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه صورت گرفت، مرحله اتصال در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، مرحله بسط در 72 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه اعمال شد و مرحله بسط نهایی، جهت تکمیل رشته های دوتایی DNA در 72 درجه سانتیگراد به مدت 8 دقیقه انجام شد. پس از انجام واکنش PCR به محتویات هر لوله 2 میکرولیتر بافر بارگذاری اضافه گردید و 10 میکرولیتر از محصول حاصله در چاهک‏های ژل آگارز 8/1 % که حاوی 4 میکرولیتر اتیدیوم بروماید جهت رنگ‏آمیزی بود، ریخته شد. نمونه‏ها به مدت دو ساعت با جریان 80 ولت الکتروفورز شدند و سپس توسط دستگاه ژل داک قطعات تکثیر یافته DNA تحت نور UV مشاهده و عکسبرداری از ژل صورت گرفت. امتیازدهی باندها بصورت صفر( عدم وجود باند) و یک (وجود باند) صورت گرفت.

تجزیه‏های آماری: با توجه به اطلاعات جغرافیایی (طول و عرض جغرافیایی)، اکوتیپ‏های جمع‏آوری شده از مناطق مختلف به کمک نرم افزار SPSS تقسیم بندی شد. پس از ثبت اطلاعات، با استفاده از نرم افزار Excel متغیرهای مربوط به هر آغازگر در ستون و نام ژنوتیپ‏ها در ردیف‏ها قرار گرفت. فاصله ژنتیکی[2] (GD) یا شباهت ژنتیکی[3] (GS) با استفاده از ضریب نی و لی [4] (GD_NL) محاسبه شد (Nei. 1987). تعداد آلل های مشاهده شده برای هر نشانگر در داخل جمعیت، تعداد آلل‏های موثر، شاخص تنوع ژنتیکی نی، شاخص اطلاعاتی شانون با استفاده از نرم افزار POPGENE32, محاسبه گردید. پس از این مرحله دندوگرام به روش UPGMA توسط نرم افزار MEGA5.05 ترسیم شد. همچنین ماتریس تشابه براساس ضریب تطابق ساده (MS) به کمک نرم افزار NTSYC2.02 بر آورد گردید. هتروزیگوسیتی درون جمعیت‏ها (Hs)، هتروزیگوسیتی بین جمعیت‏ها (Dst)، هتروزیگوسیتی کل (Ht=Hs+Dst)، ضریب تنوع بین جمعیت‏ها (Gst= Dst/Ht)، تخمین جریان ژنی از Gst یا Gcs به کمک نرم افزار POPGEN محاسبه گردید با کمک Ht و Hs بدست آمده شاخص Fst (همبستگی ژن‏های افراد مختلف در یک جمعیت ) با استفاده از فرمول Fst = 1 – Hs/Ht محاسبه شد. این شاخص ساختار، دوری و نزدیکی بین جمعیت‏ها را از طریق محاسبه هتروزیگوسیتی آلل‏ها، فراوانی آلل‏ها و تنوع در جمعیت‏ها نشان می‏دهد. زمانی که افراد از نظر فراوانی آللی کاملا مشابه‏ باشند مقدار این شاخص برابر با صفر و زمانی که افراد از نظر آللی کاملا متفاوت باشند این مقدار برابر با یک می‏شود (Weir. 1996). شاخص F_ST برای مطالعه تفاوت بین جمعیت‏ها نیز بکار می‏رود. در مطالعه جمعیت‏ها اگر میزان F_ST بین 15/0 تا 25/0 بدست بیاید F_ST بالایی دارند که نشان می‏دهد جمعیت‏های مورد مطالعه کاملاً از هم متمایز هستند.

نتایج و بحث

با استفاده از روش استخراج DNA مناسب و شرایط چرخه حرارتی کارآمد باندهای واضحی توسط نشانگرRAPD تکثیر یافت که در شکل 1 الگوی تکثیر یافته توسط نشانگر شماره 7 نشان داده شد. نشانگرهای بدست آمده از 32 اکوتیپ رازیانه با استفاده از 9 نشانگر RAPD چندشکلی قابل ملاحظه‏ای را نشان دادند. تعداد باندهای ایجاد شده توسط نشانگرهای RAPD برای 32 اکوتیپ رازیانه 1267 قطعه بود. تعداد باندهای چند، حاصل از آزمایش آغازگرهای RAPD بر روی تک بوته‎های اکوتیپ‏های رازیانه در این آزمایش، از 6 تا 17 باند متغیر بود.

شکل 1- الگوی باندی تکثیر شده توسط نشانگر RAPD (شماره 7).

Figure 1- Banding pattern reproduced by the primer RAPD (Number 7)

با توجه به اطلاعات جغرافیایی، اکوتیپ‏های جمع‏آوری شده از مناطق مختلف، به دو گروه تقسیم بندی شد، که بر‏اساس این گروه‏بندی توسط آغازگر رپید 103 قطعه چند شکل در گروه یک (17/97 درصد) و 104 قطعه چندشکل در گروه دوم (11/89 درصد) ایجاد شد و در مجموع 106 قطعه چند شکل (100%) ایجاد گردید. در پژوهشی Zahid et al., (2009) با بررسی تنوع ژنتیکی انجام داده بر روی 50 اکوتیپ رازیانه با استفاده از 30 نشانگر RAPD ، 48 درصد چند شکلی را گزارش دادند. به کمک نشانگر RAPD، Abou El-Nasr et al., (2013) نیز چندشکلی بالایی (42/68 درصد) را در ارقام رازیانه مورد بررسی بدست آوردند. در این مطالعه میزان هتروزیگوسیتی کل (Ht)، هتروزیگوسیتی درون جمعیت‏ها (Hs)و ضریب تنوع بین جمعیت‏ها (Gst) برای داده‏های بدست آمده از آغازگر RAPD به ترتیب 3764/0، 368/0 و 0225/0 بود و شاخص Fst برابر با 022/0 برآورد شد.

نتایج حاصل از تکثیر PCR ،32 اکوتیپ‏ رازیانه با استفاده از نشانگر ISSR شماره 6 در شکل 2 نشان داده شده است. با بررسی انجام شده بیشترین قطعات تکثیر شده توسط نشانگر شماره 6 (5^'-(AG)₈RC-3^') مشاهده شد و در مجموع 813 قطعه تکثیر شد. تعداد باندهای چند، حاصل از آزمایش آغازگرهای ISSR بر روی تک بوته‎های اکوتیپ‏های رازیانه در این آزمایش، از 7 تا 15 باند متغیر بود.

شکل 2- الگوی باندی تکثیر شده توسط نشانگر ISSR (5^'-(AG)₈T-3^').

Figure 2- Banding pattern reproduced by the primer ISSR (5^'-(AG)₈T-3^').

باتوجه به اطلاعات بدست آمده از نشانگر ISSR، گروه یک شامل 70 قطعه چندشکل (22/97 درصد) و گروه دوم 64 قطعه چندشکل (89/88 درصد) و در مجموع 72 قطعه چندشکل (100 درصد) تکثیر یافت. برای نشانگر ISSR به ترتیب Ht، Hs و Gst برابر 2928/0، 2873/0 و 0187/0 بدست آمد، همچنین شاخص Fst برای این آغازگر برابر 019/0 برآورد شد. میزان بالای چند شکلی بدست آمده در الگوهای باندی نشانگرهای ISSR و RAPD نشان داد که این دو نشانگر تکنیک‏های مناسبی برای بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‏های رازیانه هستند. نشانگرهای مختلف ISSR و RAPD قدرت متفاوتی در شناسایی چندشکلی در نمونه‏های مورد بررسی داشتند. F_ST که همبستگی بین ژن‏های افراد مختلف در یک جمعیت را نشان می‏دهد، در این بررسی به دلیل بالا بودن هتروزیگوسیتی کل، نزدیک به صفر بوده که بیانگر شباهت فراوانی آللی افراد مورد مطالعه است.

بیشترین آلل موثر (Ne، یعنی آلل هایی که فراوانی برابری دارند و دارای توزیع خوبی می‏باشند) ، شاخص اطلاعات شانون (I) و تنوع ژنتیکی نی (H) توسط نشانگر شماره 6 ISSR (8434/21، 3483/0 و 5288/0) برآورد گردید. نشانگر شماره 7 RAPD بیشترین تعداد آلل موثر(0999/28) و شماره 4 این نشانگر بیشترین شاخص اطلاعات شانون و تنوع ژنتیکی نی (6845/0، 4914/0) را بدست آورد. میانگین تنوع ژنتیکی نی، شاخص اطلاعات شانون و آلل موثر به ترتیب برای نشانگرهای RAPD ، 3739/0، 552/0 و 4880/1 بدست آمد و برای نشانگرهای ISSR پارامترهای ذکر شده به ترتیب 2944/0، 463/0 و 4672/1 محاسبه گردید (جدول 3). در بررسی تنوع و تفرق ژنتیکی برخی از جمعیت‏های زیره پارسی به کمک نشانگر RAPD، Hashemi et al., (2008) میانگین تنوع ژنی نی را 18/0 و شاخص اطلاعات شانون را 273/0 بدست آوردند. در بررسی گونه‏های بومی انار ایران Noormohammadi et al., (2012) به کمک نشانگرهای مولکولی ISSR و RAPD میانگین تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانون را به ترتیب برای نشانگر ISSR، 214/0 و 308/0 درصد بدست آوردند و برای نشانگر RAPD نیز به ترتیب 178/0 و 266/0 درصد بدست آوردند. باتوجه به جدول 3 بیشترین و کمترین PIC (معیاری برای قدرت تمایز هر جفت آغازگر میباشد) بدست آمده برای نشانگر RAPD به ترتیب نشانگرهای شماره 2 و 6 (468849/0 و 276789/0) و برای نشانگر ISSR، 6 و 2 (547946/0 و 3629825/0) بودند. میانگین محتوای چندشکلی (PIC[5]) بدست آمده برای نشانگرهای RPAD و ISSR به ترتیب 4274/0 و 4192/0 برآورد گردید. با بررسی نتایج بدست آمده از هر دو نشانگر RAPD و ISSR بیشترین میزان تعداد آلل‏های موثر، شاخص نی و شانون را نشانگر RAPD بدست آورده است و بیشترین میزان PIC را نشانگر ISSR به خود اختصاص داده است. دامنه کوچک تغییرآلل‏های موثر و آلل‏های مشاهده شده نشان دهنده توزیع نسبتاً برابر آلل‏ها در بین جمعیت‏ها است و این که جمعیت‏ها تقریباً در سطح یکنواختی از توزیع آللی قرار دارند. بنا به قانون هاردی - وینبرگ در جمعیت‏های دگرگرده افشان متعادل فراوانی ژنی و ژنوتیپی در غیاب گزینش، موتاسیون و مهاجرت از نسلی به نسل دیگر تغییر نمی‏کند و رابطه بین آنها ثابت بوده و همواره از توزیع دو جمله‏ای (p+q)²=p²+2pq+q² پیروی می‏نمایند (Kimura and Crow, 1963). در هر 32 اکوتیپ مورد مطالعه، آلل‏های موثر یعنی نسبت آلل‏هایی که فراوانی برابر دارند به کل آلل‏ها برای نشانگر RAPD بالای 80 درصد و برای نشانگر ISSR بالای 70 درصد می‏باشد. این امر نشان می‏دهد که با پیروی از قانون هاردی- وینبرگ، توزیع آللی درون جمعیت‏های مورد مطالعه نسبتاً برابر است و جمعیت‏ها از نظر فراوانی آللی دارای توزیع متعادل هستند.

میانگین ضریب فاصله ژنتیکی بین جمعیت‏‏ها و میانگین تشابه ژنتیکی براساس آنالیز تطابق ساده براساس الگوهای RAPD، به ترتیب 42/0 و 58/0 بدست آمد. با توجه داده‏های ISSR میانگین ضریب فاصله ژنتیکی بین جمعیت‏ها و میانگین تشابه ژنتیکی براساس آنالیز جاکارد برابر 34/0 و 66/0 برآورد شد. در بررسی انجام داده بر روی رازیانه به کمک نشانگر RAPD، Groveri et al., (2011) میانگین ضریب فاصله ژنتیکی بین جمعیت ها را 71/0 بدست آوردند.

در پژوهشیAbou El-Nasr et al., (2013) با توجه به داده‏های بدست آمده از اکوتیپ‏های رازیانه به کمک نشانگر ISSR، ضریب تشابه ژنتیکی را 77/0- 58/0 درصد برآورد کردند.

جدول 3- پارامترهای تنوع ژنتیکی در جمعیت‏های رازیانه با کمک نشانگر ISSR و RAPD.

Table3- Parameters of genetic diversity in populations of ISSR and RAPD markers with Fennel.

نشانگر Primer	شماره نشانگر Number primer	Na	Ne	H	I	PIC
	1	28	21.2751	0.3312	0.5133	0.43532
	2	30	27.7884	0.3542	0.5392	0.468849
	3	20	19.4539	0.4748	0.6667	0.414923
	4	12	9.4608	0.4914	0.6845	0.43261
RAPD	5	22	18.4548	0.2323	0.3942	0.441455
	6	20	16.3351	0.3318	0.514	0.276789
	7	34	28.0999	0.0615	0.1408	0.441404
	8	22	17.0607	0.3318	0.514	0.467045
	9	24	17.1792	0.0628	0.1432	0.468183
	1	24	18.1216	0.3051	0.4616	0.384494
	2	30	20.4331	0.2479	0.40278	0.3629825
ISSR	3	24	18.3597	0.3108	0.4645	0.371718
	4	24	17.1866	0.2780	0.4386	0.399234
	5	14	9.6926	0.2678	0.4330	0.449218
	6	28	21.8434	0.3483	0.5288	0.547946

در گروه‏بندی انجام شده براساس نشانگرهای RAPD اکوتیپ‏های مورد مطالعه در 7 گروه قرار گرفتند (شکل3). کلاستر یک (I) شامل دو زیر کلاستر (aI و bI( می‏باشد که زیرکلاستر aI شامل 7 اکوتیپ بوده و با نگاهی دقیق‏تر به اکوتیپ‏های موجود در این زیر کلاستر، به بالا بودن ضریب شباهت بین اکوتیپ‏ها پی می‏بریم. به طور مثال اکوتیپ‏های خوسف و سربیشه با ضریب شباهت (89/0)، اهواز و کاشان (85/0) در یک گروه قرار گرفته‏اند. کلاستر شماره دو (II) شامل دو زیر کلاستر (IIa و IIb) می‏باشد که در زیرکلاستر IIa اکوتیپ آران‏بیدگل قرار گرفته و در زیر کلاستر IIb اکوتیپ‏های گناباد، آباده، اردکان و کامیاران با ضرایب تشابه بین 73/0-7/0 جای گرفته‏اند. کلاستر شماره سه (III) شامل اکوتیپ‏های رومی و ایلام (ضریب شباهت 73/0) بود. در کلاستر شماره 4 (IV) اکوتیپ تبریز و در کلاستر 5 (V) اکوتیپ‏ شیراز قرار گرفتند. کلاستر 6 (VI) خود شامل دو زیر کلاستر (VIa و VIb) بود. اکوتیپ دیوان‏دره در زیر کلاستر VIa و اکوتیپ‏های کرمان و نیریز با داشتن اقلیم‏های مشابه و ضریب شباهت بالا (75/0) در زیر کلاستر VIb قرار گرفتند. کلاستر شماره 7 (VII) شامل دو زیر کلاستر (VIIa و VIIb) است که زیر کلاستر VIIa شامل 5 اکوتیپ (اصفهان، سقز، بجستان، رزن و شبستر) بود که ضریب تشابه بالای بین اکوتیپ‏های موجود در این زیر کلاستر وجود داشت و زیرکلاستر VIIb شامل 6 اکوتیپ بود. اکوتیپ‏های نیشابور، مشهد، سبزوار، بجنورد، قم و دهگلان با اقلیم مشابه و ضریب تشابه بالا (76/0-63/0) در یک گروه (VIIb) قرار گرفتند. نتایج بدست آمده رابطه بین تنوع ژنتیکی را با موقعیت جغرافیایی و یا تشابهات اقلیمی نشان می‏دهد. نتایج مشابه مربوط به ارتباط موقعیت جغرافیایی و اقلیمی با تنوع ژنتیکی جمعیت‏های مختلف گیاهی توسط دیگر محققان گزارش شده‏است (Bahmani et al., 2012 ;Rahimi malek et al., 2009; Garib et al., 2011) و این معقول به نظر می‏رسد چون که در مورد تغییرات ژنتیکی از مهمترین عوامل خارجی دما، رطوبت و غیره می‏باشد. اکوتیپ‏های رازیانه براساس اطلاعات آغازگر ISSR با روش UPGMA در 11 گروه قرار گرفتند که این نشان‏دهنده تنوع ژنتیکی وسیع در میان رازیانه‏ها می‏باشد (شکل4). با نگاهی دقیق‏تر به اکوتیپ‏های موجود در هر گروه می‏توان به وضوح وجود تشابهات جغرافیایی و اقلیمی میان آن‏ها را مشاهده کرد. کلاستر یک (I) شامل دو زیر کلاستر (aI و bI) بود، زیرکلاستر aI شامل 7 اکوتیپ (تبریز، اصفهان، دیوان‏دره، سقز، قم، سنندج و نیشابور) و زیرکلاستر bI شامل اکوتیپ‏های ارومیه، شبستر و شیراز بود.

شکل 3-گروه بندی 32 اکوتیپ رازیانه ایران با روش UPGMAبرای نشانگر RADP.

Figure 3- RAPD markers using UPGMA for cluster 32 ecotypes of fennel Iran.

اکوتیپ‏های کرمان و سبزوار با ضریب تشابه 63/0 در کلاستر دو (II) جای گرفته‏اند. کلاستر سه (III) شامل دو زیر کلاستر (IIIa و IIIb) می‏باشد. اکوتیپ‏های مشهد و کامیاران با ضریب تشابه 6/0 در زیرکلاستر IIIa جای گرفته‏اند. زیرکلاستر IIIb شامل دو اکوتیپ نیریز و رزن بود. اکوتیپ محلات در کلاستر 4 (IV) و آران‏بیدگل در کلاستر 5 (V) قرار گرفتند. کلاستر 6 (VI) شامل دو زیرکلاستر (VIa و VIb) بود. در زیرکلاستر VIa تنوع ژنتیکی از فاصله جغرافیایی تبعیت نکرده و اکوتیپ‏هایی با منشاء‏ کاملا متفاوت (گناباد و ایلام) از نظر اقلیم و فاصله جغرافیایی در یک گروه قرار گرفتند، اما با نگاهی دقیق‏تر این دو اکوتیپ دارای ضریب تشابه بالای (65/0) بودند. اکوتیپ بجنورد در زیر کلاستر VIb جای گرفته است. اکوتیپ رومی در کلاستر شماره 7 (VII) و اکوتیپ سربیشه در کلاستر 8 (VIII) جای گرفتند. کلاستر 9 (IX) شامل دو زیرکلاستر (IXa و IXb) بود. اکوتیپ‏های کاشان و سردشت با ضریب بالای تشابه (74/0) در یک گروه (زیرکلاستر IXa) قرار گرفتند. زیرکلاستر IXb شامل اکوتیپ برازجان بود. اکوتیپ خوسف به تنهایی در کلاستر 10 (X) جای گرفت. کلاستر 11 (XI) شامل دو زیرکلاستر (XIa و XIb) می‏باشد، زیرکلاستر XIb شامل اکوتیپ اردکان بود و اکوتیپ‏های دهگلان، بجستان و آباده در زیرکلاستر XIb قرار گرفتند. Abou El-Nasr et al., (2013) در بررسی انجام داده، ارقام رازیانه را در 2 گروه کلاستر بندی کردند. چنین گروه‏بندی که نشان‏دهنده تنوع ژنتیکی بالا را در رازیانه نشان می‏دهد نیز گزارش شده‏است (Bahmani et al., 2012; Zahid et al., 2009).

شکل 4-گروه بندی 32 اکوتیپ رازیانه ایران با روش UPGMAبرای نشانگر ISSR.

Figure 4- ISSR markers using UPGMA for cluster 32 ecotypes of fennel Iran.

نتیجه‏گیری

همبستگی ماتریس تشابه بدست آمده برای هردو نشانگر براساس ضریب تشابه تطابق ساده برابر با 83/0 بود که بیانگر تطابق کلاسترهای بدست آمده از هر دو نشانگر است. اطلاعات بدست آمده در این آزمایش کارایی نشانگرهای ISSR و RAPD را برای تعیین و برآورد تنوع ژنتیکی، فاصله و ارتباط میان ژنوتیپ‏‏های مختلف این گیاه تائید کرد. کسب اطلاعات درمورد شباهت‏های ژنتیکی برای جلوگیری از تبدیل شدن ژرم‏پلاسم‏های خوب به ژرم‏پلاسم یکنواخت ضروری است. از آنجایی که روش‏های ISSR و RAPD، روش‏هایی ساده‏ای هستند و نیاز به DNA کمی دارند، استفاده از آنها در برنامه‏های اصلاحی سریع و بهبود روش‏های اصلاحی مفید می‏باشند. باتوجه به اطلاعاتی که درباره روابط ژنتیکی نزدیک در اختیار بهنژادگر قرار می‏گیرد، استفاده از تکنیک‏های انگشت نگاری DNA برای انجام برنامه‏های اصلاحی هدف‏دار مانند تولید ارقام متمایز، ژنوتیپ‏هایی با تنوع ژنتیکی پایه‏ای و بهبود بهره وری ارقام موجود پیشنهاد می‏شود.

منابع

Abou El-Nasr THS, Sherin A, Mahfouze, Al-Kordy MAA (2013). Assessing Phenotypic and Molecular Variability in Fennel (Foeniculum vulgare) Varieties. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 7: 715-722.

Abou El-Nasr THS, Ibrahim MM, Aboud KA, Al-Kordy MAA (2013). Genetic variation among three fennel (Foeniculum vulgare Mill.) varieties on the basis of morphological characters, essential oil composition and ISSR markers. Applied Sciences Research 9: 1594-1603.

Almdari SBL, Safarnejad A, Nemat Zade GH. A (2012). RAPD markers to assess the genetic diversity of some species of thyme. Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Iran. 20:192-201.

Bahmani K, Izadi Darbandi A (2012). Assessment of the genetic diversity in Iranian Fennels based on ISSR markers. Special Twelfth Iranian Genetics Congress 12: 94-99.

Bahmani K, Izadi Darbandi A, Baghcheghi R (2012). Assessment of genetic diversity of Iranian fennel Rapid marker. Special Twelfth Iranian Genetics Congress 12: 99-105.

Bahmani K (2011). The Study of morphological and genetic variation in Iranian fennel populations (Foeniculum vulgare Mill.). Thesis. College of Abouraihan. Department of Agronomy and Plant Breeding Sciences.

Dellaporta S, Wood J, Hicks J (1983). A plant DNA minipreparation: Version ii. Plant Molecular Biology Reporter 1: 19-21.

Hasani MH, Torabi S, Omidi M, Etminan AR, Dstmalch T (1390). Assessment of genetic diversity in germplasm of fennel (Foeniculum vulgare Mill) Using AFLP markers. Iranian Crop Sciences 42:597-604.

Hashemi H, Safar Negad, Bagheri AR (2008). Study of genetic diversity in native Persian cumin (Bunium persicum Boiss) in Iran using RAPD markers. Quarterly Scientific - Plant Breeding and Genetic Research of pasture and forest 16: 238-246.

Gept P (1993). The use of molecular and biochemical markers in crop evolution studies. In:Evolutionary Biology. (Eds.): M.K. Hecht. Plenum Press, New York. 534.

Gharibi S, Rahimmalek M, Mirlohi A, Majidi MM, Sayed Tabatabaei BE (2011). Assessment of genetic diversity in Achillea millefolium subsp. millefolium and Achillea millefolium subspelbursensis using morphological and ISSR markers. Medicinal Plants Research 5: 2413-2423.

Ghare Yazi B (1996). DNA marker application in breeding. Proceeding of key Iranian crop science congress 368-380.

Groveri S, Jakhar ML, Malik CP (2011). Genetic Diversity of Different Varieties of Foeniculum vulgare Miller by RAPD Markers. Archives of Applied Science Research 3:17 25.

Kiani GH (2012) Assessment of genetic distances with markers RAPD rice,

Kimura, M. and J.F. Crow (1963). The measurement of effective population number. Evolution 17:279-288.

Nei M (1987). Molecular Evolutionary Genetics.New York: Columbia University press.

Noormohammadi Z, Fasihee A, Homaee-Rashidpoor S, Sheidai M, Ghasemzadeh Baraki S, Mazooji A, Tabatabaee-Ardakani SZ (2012). Genetic variation among Iranian pomegranates (Punica granatum L.) using RAPD, ISSR and SSR markers. AJCS 6:268-275.

Rahimmalek M, Sayed TBE, Arzani A, Etemadi N (2009). Assessment of genetic diversity among and within Achillea species using amplified fragment length polymorphism (AFLP). Biochem. Syst. Ecol 37: 354- 361.

Soreni A, Nazeri V, Fatahi Moghdam M.R, Ahadi Dolatsara E (2012). he genetic diversity of plant populations of motherwort in Iran with markers RAPD, Journal of Agricultural Biotechnology

Torabi S, Hasani MH, Omidi M, Etminan A, Dasmalchi T, Gharakhanlou, H (2012). Evaluation of genetic diversity in Fennel accessions using AFLP markers. Advances in Environmental Biology 6: 2821-2828.

Yousefi, V, Najafi A, Zebarjadi, A (2011). Evaluation of genetic diversity in ecotypes of Thymus sp. using ISSR markers. Seven Iranian Horticulture Science Congress. 70-72.

Weir BS (1996). Intraspecific differentiation. In: D.M. Hillis et al. (Ed). Molecular systematics, 2nd edition. Sunderland: Sinauer Associates Pub 385- 403.

Zahid NY, Abbasi NA, Hafiz IA, Ahmad Z (2009). Genetic Diversity of Indigenus Fennel (Foeniculum Vulgare Mill.) Germplasm in Pakistan Assessed by RAPD Markers. Pak. J. Bot 41: 1759-1767.

Assessment of genetic diversity of fennel ecotypes using RAPD and ISSR markers

Taheri S.*¹, Zabet M.²,Izanlo A.², Izadi Darbandi A.³

¹M.sc student, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Birjand.

²Assistant of professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Birjand.

³Assistant of professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Abouraihan, Tehran University.

Abstract

Fennels have long been cultivated as an aromatic and medicinal plant in different regions with different climate in Iran. In this study, the genetic diversity of 32 ecotypes of fennel was assessed by RAPD and ISSR markers. A total of 106 and 72 polymorphic fragments were amplified by RAPD and ISSR markers, respectively. Based on RAPD data, mean genetic diversity were 0.3739 and 0.552 by Nei (h) and Shannon's information index (I), respectively. Moreover, mean genetic diversity for ISSR marker were accordingly 0.2944 and 0.4563. The obtained average polymorphism content (PIC) by RAPD and ISSR markers were 0.4274 and 0.2192, respectively. Based on cluster analysis of RAPD and ISSR markers, the ecotypes were grouped in 7 and 11 clusters. These results indicate that the Iranian fennels have high genetic diversity, and RAPD and ISSR markers very well differentiated fennel genotypes based on the geographical distribution and climatic similarities. Understanding the genetic diversity can further help breeders in their breeding programs, especially in hybridization breeding, evolutionary and classifications studies.

Keywords: Effective alleles, Cluster analysis, Genetic variation.

* نویسنده مسئول: صفورا طاهری تلفن: 09359537057 Email: Sa.taheri524@gmail.com

[1] Apiaceae

[2]. Genetic Distance

[3]. Genetic Similarity

[4] Nei and Li

[5] Polymorphic Information Content

* Corresponding Author: Taheri, S. Tel: 09359537057 Email: Sa.taheri524@gmail.com

مراجع