مطالعه افزایش بیان ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی با استفاده از روش سرکوبی خاموشی ژن به کمک پروتئین P19

مهشید امیری¹، مختار جلالی جواران*²، پرستو احسانی³، رحیم حداد⁴

¹دانشجوی دکتری اصلاح نباتات، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران.

²دانشیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران.

³ استادیار گروه بیولوژی مولکولی، انیستیتو پاستور ایران، تهران.

⁴ دانشیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، قزوین.

تاریخ دریافت: 05/02/1394، تاریخ پذیرش: 30/04/1394

چکیده

پروتئین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی(tissue plasminogen activator) انسان یکی از مهم­ترین پروتئین­های دارویی در درمان سکته است که در تجزیه لخته خون در مغز و رگ­های خونی قلب دخالت دارد. بدین منظور روش­های جدید موجود در بیوتکنولوژی کشاورزی همچون انتقال ژن به هسته وکلروپلاست برای تولید این پروتئین ارزشمند به کار گرفته شد. بیان موقت ژن در گیاهان، روشی سریع، قابل انعطاف و تکرار پذیر جهت تولید میزان بالای پروتئین­های داروئی ارزشمند است. مشخص شده است که خاموشی پس از رونویسی بر میزان بیان تاثیر می­گذارد. بنابراین، اثر بیان همزمان ژن سرکوب­کننده خاموشی ژن P19، که توالی کد کننده آن از ویروس کوتولگی بوته انبوه گوجه فرنگی به دست آمده است، بر روی بیان موقت tPA در گیاه توتون (Nicotiana tabacum) واریته Xanthi مطالعه شد. برای این منظور، میزان بیان در تزریق آگروباکتریوم حاوی ناقل دوتایی بیانی pTRAc-tPA-ERH به همراه اگروباکتریوم حاوی ناقل pCAMBIA-P19 در مقایسه با میزان بیان بدست آمده از آگروباکتریوم تنها حاوی ناقل دوتایی بیانی pTRAc-tPA-ERH مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده از تزریق همزمان براساس آزمون الایزا (ELISA)  نشان داد که میزان بیان tPA با استفاده از P19، mg/g 10 وزن تر برگ بود که این میزان بیان، حدود دو برابر زمانی بود که در تزریق از اگروباکتریوم حاوی ناقل P19 استفاده نشد. بنابراین در مقایسه با انتقال پایدار که به مدت زمان بیشتری برای تولید پروتئین موردنظر نیاز است، در انتقال موقت به ازاء تعداد برگ­های قابل تزریق یک گیاه و تولیدmg 10 tPA در ازاء هر گرم وزن تر برگ می­توان به میزان بیشتری از این پروتئین در مدت زمان کمتر از یک هفته دست یافت. در نتیجه، بنظر می­رسد استفاده از بیان موقت برای بیان tPA مفید است و سطح بیان با بکارگیری سرکوب­کننده خاموشی ژن کد شده توسط ویروس بهبود یافته است و به میزان بیان mg/g 10 وزن تر برگ رسیده است.

کلمات کلیدی: توتون، بیان موقت ژن، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی(tPA)، خاموشی ژن پس از رونویسی، سرکوب­کننده خاموشی ژن.

مقدمه

فعال کننده پلاسمینوژن بافتی از نوع (tPA) یک آنزیم سرین پروتئاز است که می تواند پلاسمینوژن را به فرم فعال آن، پلاسمین، تبدیل کند و پلاسمین می تواند لخته خونی را با شکستن فیبرین در عروق خرد کند. بنابراین، tPA برای درمان انسداد قلبی، عروقی و مغزی استفاده می گردد. (Rouf et al., 1996).

پروتئین tPA در بافت­های مختلف انسان و حیوانات یافت می­شود. برای تولید طبیعی tPA، بافت­هایی همچون ملانوم، اپی­تلیال، فیبروبلاست و اندوتلیال از طریق روش کشت بافت استفاده شده و tPA از این بافت­ها خالص ­گردیده است (Electricwala & Atkinson, 1985; Griffiths & Electricwala, 1987; Levin et al., 1997). علاوه بر این، از تکنولوژی DNA نوترکیب می‏توان برای تولید tPA مصنوعی استفاده نمود (Rouf et al., 1996). تا کنون، پروتئین tPA در سلول­های L موش (Browne et al., 1985)، لاین­های سلولی ملانومای بوئز[1] (Dodd et al., 1986)، لاین­های سلولی پستانداران (Jalanko et al., 1990)، اشریشیاکلی (E.coli) (Obukowicz et al., 1990)، سلول­های تخمدان هامستر چینی (CHO)(Fann et al., 2000) و لیشمانیا (Soleimani et al., 2006) تولید شده است.

 تولید tPA در گیاهان به کمک زراعت مولکولی[2] می­تواند راه مفیدی برای تولید تجاری این پروتئین باشد. کارهای ارزشمندی در زمینه تولید این پروتئین انسانی در گیاهان مختلف از جمله، خیار (Asgari et al., 2014) و توتون (Hahn et al., 2009; Masoumi Asl et al., 2010; Goojani et al., 2013) صورت گرفته است. در مطالعه Hahn et al (2009) و Masoumi Asl et al (2010) انتقال ژن به هسته گیاه توتون صورت گرفت ولی میزان تولید این پروتئین انسانی ارزشمند به ترتیب 0014/0% میزان کل پروتئین محلول و mg/kg 01/0- 026/0 بوده است. از این رو، برای افزایش سطح بیان ژن tPA در گیاه توتون، ترادف ژنی فرم K2S این پروتئین که فقط دارای دومین کرینگل دوم و دومین سرین پروتئاز است به کلروپلاست گیاه توتون انتقال یافت (Abdoli-Nasab et al., 2013). بدلیل اهمیت tPA که داروی گران­قیمت و باارزشی است، امکان تولید نه تنها به روش انتقال پایدار به گیاهان که نیاز به صرف هزینه و زمان زیادی دارد بررسی می‏گردد، بلکه به کمک سیستم بیان موقت نیز مورد تحقیق قرار می‏گیرد.

بیان موقت ژن­های بیگانه در بافت­های گیاهی روشی ارزشمند در بیوتکنولوژی گیاهی است. این روش سریع، انعطاف­پذیر، ساده، بی­نیاز به کشت بافت و در بافت­های تمایزیافته قابل اجرا است. در این روش پروتئین در سطح بالا و در کوتاه­ترین زمان با بکارگیری روش مناسب تولید می­شود (Kapila et al., 1997; Goodin et al., 2002).

خاموشی ژن پس از رونویسی[3](PTGS) به عنوان یکی از عوامل محدود کننده است که سطح بیان پروتئین را در گیاهان تحت تاثیر قرار می‏دهد (Omar, 2013). دو مکانیسم اصلی خاموشی ژن در گیاهان وجود دارد: مسیرهای خاموشی مولکول‌های RNA مداخله‌گر کوچک (siRNA) [4]و میکرو RNA[5] (miRNA) (Carthew & Sontheimer, 2009)، که در مجموع به عنوانRNA  مداخله­گر[6] (RNAi) اشاره شده است. به دلیل اشتراک چند آنزیم کلیدی، شباهت زیادی از نظر مکانیسم عمل در دو سیستم (siRNA و miRNA) به چشم می­خورد (Brodersen & Voinnet, 2006). هر دو سیستم توسط یک مجموعه شناخته شده به عنوان مجموعه القاءکننده خاموشی [7]RNA (RISC)، اسید نوکلئیک هدف (RNA ویروسی،DNA  ویروسی، mRNA ژن تراریخت وmRNA درون­زاد) خود را شناسایی می­کنند. عاملRISC دارای RNA تک رشته مکمل برای هدف خود می­باشد که به محض اتصال مسدود یا تخریب می­شود (Garabagi et al., 2012).

فرایندPTGS  به عنوان یک سیستم ایمنی تطبیقی سرکوب کننده ویروس­ها و به عنوان یک استراتژی ضد دفاعی عمل می­کند و بسیاری از ویروس­های گیاهی به گونه­ای پروتئین­ها را تغییر می­دهند که مراحل مختلف مکانیسم را سرکوب کنند. ژن ویروسی که پروتئین P19 را کد می­کند از ویروس کوتولگی بوته انبوه گوجه فرنگی[8] (TBSV) به دست آمده و به عنوان یک ژن موثر در سرکوبی سیستم خاموشی شناخته شده است (Omar, 2013).

مطالعات نشان داده­اند که بیان پروتئین هترولوگ توسط سیستم بیان موقت توسط آگروباکتریوم می­تواند در حضور سرکوب کننده خاموشی ژن افزایش یابد. گزارشات نشان داده­اند که سطح بیان پروتئین فلورسنت سبز[9] (GFP) در حضور P19 نسبت به عدم حضور سرکوب کننده خاموشی در گیاهان تراریخت بدست آمده از انتقال پایدار به میزان قابل ملاحظه­ای بالاتر بود (Voinnet et al., 2003). یافته مشابهی نیز نشان داد که به کمک بیان موقت و با استفاده از راه­انداز 35S ویروس موزائیک کلم گل ((35S CaMV میزان تولید GFPدر حضور ژن سرکوب­کننده خاموشی P19، 10 تا 25 برابر افزایش یافت (Lindbo, 2007). در مطالعه Liu and Kearney (2010) در عدم حضور P19 میزان بیان GFP ناچیز گزارش گردید (Liu & Kearney, 2010). به نظر می­رسد P19 بیان پروتئین های نوترکیب مختلف از قبیل پروتئین های گزارشگر،آنتی بادی، پروتئین­هایی با هدف تولید واکسن و پروتئین های دارویی دیگر را با میزان های متفاوت (5- 100 برابر) افزایش می­دهد (Lindbo, 2007; Garabagi et al., 2012). در مطالعه‏ایWroblewski et al  (2005) نشان دادند که کاربرد پروتئین P19 سبب افزایش بیان GFP در گیاه N. benthamiana گردید در حالی که افزایشی در میزان بیان ژن GUS مشاهده نشد و باتوجه به پایداری کمتر ژن GFP در مقایسه با ژن GUS، بیان همزمان ژن سرکوب کننده خاموشی را سبب افزایش سطح بیان یا پایایی پروتئین­ها بخصوص پروتئین­هایی با پایداری کم دانستند. همچنین در همین مطالعه، هیچگونه افزایشی در بیان پروتئین GFP و GUS در گیاه lettuce L. serriola با کاربرد همزمان سرکوب کننده خاموشی مشاهده نشد و دلیل آن ژنوتیپ گیاه ذکر گردید (Wroblewski et al., 2005). در مطالعه Bhaskar et al (2009) بر روی سیب‏زمینی، سویه Agrobacterium را بر میزان افزایش بیان به کمک سرکوب کننده خاموشی مؤثر دانستند و گزارش نمودند که کاربرد همزمان سرکوب کننده خاموشی P19 در سویه GV3101 سبب افزایش بیان گردید در صورتیکه کاربرد آن به همراه LBA4404 تفاوتی در سطح بیان نشان نداد (Bhaskar et al., 2009).

پروتئین P19 یک پروتئین چند منظوره است که به عنوان یک دایمر فعال هم در سیتوزول و هم در هسته قرار دارد (Park et al., 2004) و قادر به اتصال به مولکول­های siRNA و miRNA به صورت غیراختصاصی می­باشد (Dunoyer et al., 2004). از آنجایی که سطح siRNA مشتق شده از ویروس در گیاهان در پاسخ به آلودگی افزایش می­یابد، P19 میزان siRNA دورشته­ای آزاد را از طریق اتصال غیراختصاصی کاهش می­دهد و پاسخ خاموشی را از طریق تداخل در اتصال siRNA به RISC سرکوب می­کند (Hsieh et al., 2009).

هدف اصلی از مطالعه حاضر بررسی و ارزیابی اثر سرکوب­کننده خاموشی ژن P19 بدست آمده از TBSV برای تولید tPA به کمک ناقل بیانی pTRAc با استقاده از تکنیک اگرواینجکشن[10] می­باشد.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی: در این تحقیق از توتون (N. tabacum) واریته Xanthi استفاده شد. بذرهای گیاه پس از شستشو در گلدان­های پلاستیکی کشت گردیدند و در گلخانه دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس با شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 2±23 پرورش داده شدند.

سویه­های باکتری: از باکتری Escherichia coli سویه DH5α (موجود در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس)، Agrobacterium tumefaciens سویه GV3101 حاوی پلاسمید کمکی pMP90RK و A. tumefaciens حاوی pCAMBIA 1304 دارنده ژن P19 (اهدایی توسط دکتر احسانی، گروه بیولوژی مولکولی، انیستیتو پاستور) استفاده گردید.

ناقل ها: در این مطالعه ناقل T/pTZ57R و ناقل بیانیpTRAc-ERH (اهدایی R. Fischer  وS. Schillberg، گروه زیست مولکولی و بوم شناسی کاربردی موسسه فرانهوفر، آخن، آلمان) برای همسانه­سازی و بیان ژن tPA به کار برده شد. ناقل بیانی pTRAc-ERH دارای راه­انداز قوی و توالی تنظیمی افزایش­دهنده رونویسی و ترجمه می­باشد که عبارتند از: راه­انداز35S CaMV  به همراه ناحیه افزایش­دهنده مضاعف رونویسی[11]، ناحیه5´ رمزخوانی‌نشده کالکون سنتاز(CHS)، سیگنال پلی آدنیلاسیونCaMV 35S (pA35S) و دو نسخه از ناحیه اتصال به داربست[12] (SAR) بدست آمده از طرفین ناقل بیانی Rb7 توتون. ناقل بیانی PTRAkc-ERH همچنین حاوی پپتید نشانه بدست آمده از توالی ژن زنجیر سنگین mAb24 موش پس از بهینه‏سازی کدون­ها براساس گیاه، و توالی هیستیدینی و توالی مربوط به نگهداری در شبکه آندوپلاسمی (ER) است (شکل 1).

آغازگر: آغازگرهای مناسب ژن tPA با توجه به توالی جایگاه­های برشی آنزیم­های NcoI وNotI  در ناقل pTRAc-ERH و توالی­های کناری ژن tPA طراحی گردیدند که توالی آغازگرها عبارتند از:

آغازگر پیشرو(PF1):

 PF1: 5´-ATATTCCATGGATGCAATGAAGAGAGG-3´

آغازگر معکوس (PR1):

PR1: 5´-ATAAGAATGCGGCCGCCGGTCGCATGTTGTCA-3´

همسانه­سازی ژن tPA

به منظور تکثیر و همسانه­سازی ژن tPA در ناقل دوگانه pTRAc-ERH، ابتدا محصول PCR ژن tPA حاصل از ناقل pBI-tPA-KDEL (Goojani et al., 2013) مستقیم در ناقل T/A (ناقل pTZ57R/T) همسانه­سازی گردید (MA1). جهت آزمون صحت کلون تولید شده، PCR با آغازگرهای اختصاصی (PF1 و  PR1) انجام شد. جهت انتقال ناقل مورد نظر به درون سلول­های مستعد باکتری E. coli از روش استاندارد شوک حرارتی (Sambrook & Russell, 2001) استفاده شد. پس از استخراج پلاسمید (شرکت Thermo) به روشMiniprep (Sambrook & Russell, 2001)، شناسایی کلون­های مثبت (کشت های حاوی کلنی هایی که پلاسمید آنها دارای ژن بود اصطلاح کلونی های مثبت داده شد) و تأیید صحت توالی قطعه مربوطه، با استفاده از هضم آنزیمی (با آنزیم­های NcoI وNotI )، قطعه ژنی مورد نظر از روی ژل آگاروز جدا شده و با استفاده از کیت خالص‏سازی DNA (شرکت Thermo) تخلیص گردید.

شکل 1- نمایش شماتیک ناقل pTRAkc-ERH و سازه MA2 (pTRAc-tPA-ERH). الف: ناقل pTRAkc-ERH و جایگاه آنزیم های برشی: P35SS: راه‌انداز CaMV 35S به همراه افزایش‌دهنده مضاعف‌شده نسخه‌برداری، CHS:5¢UTR  ژن کالکون سنتاز، LPH: توالی پپتید نشانه بدست آمده از توالی ژن زنجیر سنگین mAb24 موش پس از بهینه­سازی کدون­ها براساس گیاه ، his6: توالی حاوی 6 اسید آمینه هیستیدین، KDEL: توالی نشانه نگهداری در شبکه آندوپلاسمی، pA35S: سیگنال چند آدنیله شدن CaMV 35S، SAR: ناحیه اتصال به داربست در ژن Rb7، RK2ori: ناحیه همانندسازی در اگروباکتریوم، bla: ژن bla مقاوم به آمپی‌سیلین و کربن‌سیلین، ColE1ori: منشا همانندسازی در E. coli، npt II: ژن npt II  مقاوم به کانامایسین، Pnos  وpAnos : راه‌انداز و خاتمه دهنده ژن نوپالین سنتاز؛ ب: سازه MA2 (pTRAc-tPA-ERH).

Figure 1- Chematic overview of the pTRAkc-ERH and MA2 construct (pTRAc-tPA-ERH). a: pTRAc-ERH vector with the restriction enzyme site: P35SS: CaMV 35S promoter with duplicated transcriptional enhancer, CHS: chalcone synthase 5´-untranslated region, LPH: plant codon optimized leader sequence derived from the murine heavy chain of the mAb24, his6: sequence with 6 histidine, KDEL: Endoplasmic reticulum retention signal, pA35S: CaMV 35S polyadenylation signal, SAR: scaffold attachment region of the tobacco Rb7 gene, RK2ori: origin of replication for Agrobacterium tumefaciens, bla: ampicillin ⁄ carbenicillin-resistance bla gene, ColE1ori: origin of replication for E. coli, nptII: kanamycin resistance gene, pAnos and Pnos: nopaline synthase gene promoter and terminator. b: MA2 construct (pTRAc-tPA-ERH).

به منظور همسانه­سازی ژن tPA در ناقل بیانی  pTRAc-ERH، ناقل مورد نظر با استفاده از همان آنزیم­های برشی (NcoI وNotI) هضم گردیده و پس از تخلیص به کمک کیت خالص‏سازی DNA (شرکت Thermo)، جهت تهیه سازه و انجام واکنش اتصال آماده گردید. ژنtPA  توسط آنزیم لیگاز T­4­ در ناقل pTRAc-ERH خطی درج شد. ساختار تهیه شده pTRAc-tPA-ERH (MA2) به سلول­های مستعد باکتری E. coli سویه DH5α با استفاده از روش استاندارد شوک حرارتی معرفی گردید (Sambrook & Russell, 2001). کلون­های تراریخت باکتریایی در محیط انتخابی (حاوی آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین) شناسایی و انتخاب گردیدند. صحت همسانه­سازی با استفاده از هضم آنزیمی و PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن tPA صورت پذیرفت.

تراریختی اگروباکتریوم

پس از تأیید نهائی، انتقال ناقل MA2 به باکتری A. tumefaciens با روش استاندارد ذوب و انجماد صورت گرفت (Sambrook & Russell, 2001). سلول­های تراریخت حاوی ژن مورد نظر در محیط کشت حاوی آنتی­بیوتیک­های کانامایسین (25 mg/ml)، جنتامایسین (25 mg/ml)، ریفامپسین (100mg/ml) و کاربنی سیلین (100mg/ml) در دمای°C 28 کشت و پس از 3 روز کلنی­ها مشاهده شدند. تأیید تراریختی اگروباکتریوم با استفاده از آزمون­های Colony PCR با آغازگرهای اختصاصی(PF1 ,PR1) انجام شد و از اگروباکتریوم حاوی ناقل pTRAc-ERH به عنوان کنترل در تراریختی استفاده شد.

آلوده سازی توتون با اگروباکتریوم حاوی سازه هدف (اگرواینجکشن)

اگروباکتریوم حاوی سازه مورد نظر در محیط کشت مایع لوریا برتانی[13](LB) حاوی آنتی‏بیوتیک‏های کانامایسین (25mg/ml)، جنتامایسین (25mg/ml)، ریفامپسین (100mg/ml) و کاربنی سلین (100mg/ml) در دمای°C28 به مدت 18 ساعت کشت شد. سپس کشت­ها با سانتریفوژ به مدت 15 دقیقه با شتاب  g5000 رسوب داده شدند و در محیط مخصوص تلقیح (5/5:pH) حاوی نمک­های محیطMS  (X5/0)، ویتامین‏های محیط  MS(X1)، بنزیل آمینوپورین[14] (BAP) (mg/ml001/0) و استوسرینگون (mM200) تا رسیدن به OD­600 3/0 رقیق شدند. به منظور بررسی اثر سرکوبی خاموشی ژن پس از رونویسی، قبل از تزریق، میزان و رقت برابر (OD­600 3/0) از اگروباکتریوم حاوی ناقل MA2 (pTRAc-tPA-ERH) و ناقل حاوی ژن P19 (pCAMBIA-P19) با یکدیگر مخلوط شدند و تیمار tPA-P19 آماده آزمون گردید. همچنین تیمار اگروباکتریوم حاوی ناقل فاقد ژن tPA به عنوان کنترل (Wt) و تیمار اگروباکتریوم حاوی تنها سازه ژنی tPA به عنوان تیمار tPA در نظر گرفته شد. برگ­های گیاهان(N. tobacum)  در مرحله 8-6 برگی توسط سرنگ بدون سوزن تزریق شدند و بمدت 4 روز در گلخانه با شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 2±23 نگهداری شدند.

بررسی بیان ژن tPA

به منظور بررسی و ارزیابی اثر P19 بر بیان ژن tPA از آزمون الایزا(ELISA[15])  استفاده گردید. بدین منظور 45 نانوگرم از پروتئین استخراج شده از پهنک برگ­های گیاهان تراریخت و غیرتراریخت (کنترل منفی) بر اساس روش Guy در این آزمون مورد استفاده قرار گرفت (Guy et al., 1992). آزمون الایزا به روش غیرمستقیم (Engvall & Perlmann, 1971) با استفاده از آنتی‏بادی اولیه پلی‏کلونال tPA تولید شده در خرگوش (Abcam، ایالات متحده آمریکا) و آنتی­بادی ثانویه Goat anti Rabbit IgGHRP conjugate (SC 2030، ایالات متحده آمریکا) با تغییرات جزئی (Abdoli-Nasab et al., 2013) در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار صورت گرفت. سپس میزان جذب نوری در nm450 توسط دستگاه ELISA-Reader (BioTek, USA) خوانده شد. منحنی استاندارد با استفاده از رقت‏های tPA تجاری (Alteplase) برای کمیت‏سازی پروتئین tPA مورد استفاده قرار گرفت و ضریب رگرسیون معادله بدست آمده معنی­دار بود. تجزیه و تحلیل داده­های آزمایشی با استفاده از نرم افزار SAS انجام و قبل از انجام تجزیه واریانس نرمال بودن داده­ها مورد بررسی قرار گرفت. برای انجام مقایسات میانگین از آزمون حداقل تفاوت معنی‏دار^[16] (018/0LSD=) در سطح یک درصد استفاده گردید.

نتایج و بحث

همسانه­سازی ژن tPA و تهیه سازه هدف

همانطور که در شکل 2 مشاهده می­شود قطعات بدست آمده از تکثیر پلاسمیدهای استخراج شده از کلنی­های مثبت حدود 1700 جفت باز است که اندازه این قطعه ژنی برابر با کنترل مثبت، پلاسمید حاوی ژن، نیز می­باشد و تأییدکننده درج ژن tPA در سازه است. نتایج بدست آمده با نتایج سایر مطالعات که قطعه ژنی مورد انتظار برای ژن tPA را حدود 1700 جفت باز مشخص کرده است مشابهت دارد (Masoumi Asl et al., 2010; Goojani et al., 2013). همچنین نتایج توالی­یابی با آغازگرهای M13 واقع بر ناقل و آغازگرهای اختصاصی مربوط به ژن، مشابهت با توالی ژن tPA را نشان داد.

جهت تأیید درج ژن tPA در MA2 (pTRAc-tPA-ERH)، از واکنش­های PCR با آغازگرهای اختصاصی استفاده گردید (شکل3). قطعه تکثیر شده در کنترل مثبت در حدود 1700 جفت باز است و تکثیر قطعه DNA با این اندازه مورد انتظار در محصول  PCR حاصل از پلاسمیدهای استخراج شده از کلنی­های مثبت، مبین درج صحیح ژن در این کلنی­هاست. آزمایش بعدی که برای اطمینان از حضور ژن tPA در MA2 صورت پذیرفت، هضم با آنزیم­های NcoI وNotI  (شکل 4) می­باشد. ناقل گیاهی pTRAc-ERH حدود 7700 جفت باز بوده (Maclean et al., 2007) و انتظار می­رود وقتی ژن tPA که حدود 1700 جفت باز است، در این ناقل درج می­گردد اندازه نهائی ناقل MA2 حدود 9500 جفت باز می­شود که قابل مشاهده در شکل می‏باشد. پس از هضم MA2، دو قطعه ژنی حدود 7700 (مربوط به ناقل) و1700 جفت (مربوط به ژن tPA) بازی دیده می­شود که بیان­کننده تأیید درج ژن در MA2 است.

در آخرین مرحله، MA2 به اگروباکتریوم انتقال یافت و حضور ژن tPA در کلنی­های مثبت از طریق آزمون Colony PCR با آغازگرهای اختصاصی تأیید شد (شکل5). همچنان که انتظار می­رود قطعه ژنی 1700 جفت بازی قابل دیدن است و نشان دهنده این است که MA2 حاوی ژن tPA با موفقیت به اگروباکتریوم انتقال یافته است. 

شکل 2- محصول PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی بر روی سازه حاصل از واکنش اتصال ناقل pTZ57R/T و ژنtPA . چاهک M: نشانگر مولکولی kb 1 GeneRuler (Fermentas)، چاهک 1: کنترل منفی (آب به عنوان الگو)، چاهک‏ 2: کنترل مثبت (پلاسمید حاوی ژن tPA)، چاهک‏های 6-3: محصولات PCR بدست آمده از پلاسمیدهای استخراج شده از کلونی‌های مثبت.

Figure 2- PCR products using the specific primers on the construct from the ligation reaction of pTZ57R/T and tPA. M: 1kb standard GeneRuler (Fermentas) Ladder, 1: negative control (water as template), 2: Positive control (plasmid containing tPA gene), 3-6: PCR products of extracted plasmid from positive colonies.

شکل3- محصول PCR ژن tPA به دست آمده از ناقل بیانی pTRAc-ERH با آغازگرهای اختصاصی بر روی ژل 1% آگارز. چاهک M: نشانگر مولکولی kb1 GeneRuler (Fermentas)، چاهک 1: کنترل منفی، چاهک 2: کنترل مثبت (پلاسمید حاوی ژن tPA)، چاهک‏های 6-3: محصولات بدست آمده از تکثیر ژن  tPA در ناقل بیانی pTRAc-ERH.

Figure 3- The PCR amplification from expression vector pTRAc-ERH with specific primers on the 1% Agarose gel. M: 1kb standard GeneRuler (Fermentas) Ladder, 1: negative control, 2: Positive control (vector containing tPA gene), 3-6: products from amplified tPA gene in expression vector pTRAc-ERH.

شکل 4- هضم ناقل pTRAc-ERH حاوی ژن با آنزیم‌های Nco I و Not I. چاهک M: نشانگر مولکولی kb1 GeneRuler (Fermentas)، چاهک 1: محصول واکنش هضم آنزیمی، چاهک 2: پلاسمید برش نخورده.

Figure 4- Digestion of pTRAc-ERH vector containing tPA with NcoI and Not I enzymes. M: 1kb standard GeneRuler (Fermentas) Ladder, 1: Product of enzymatic digestion reaction, 2: undigested Vector.

بررسی بیان ژن tPA

سطح بیان پروتئین tPA توسط ناقل بیانی (MA2) در حضور و عدم حضور ناقل حاوی ژن سرکوب­کننده P19 به روش آزمون الایزا (ELISA) به منظور بررسی اثر P19 بر میزان بیان مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفت. بمنظور کمی‏سازی بیان توسط آزمون الایزا(ELISA) ، از آنتی‏بادی اولیه پلی کلونال tPA استفاده شد و نمودار استاندارد دقیقی از پروتئین خالص tPA (آلتپلاز) برای محاسبه سطح بیان tPA رسم گردید. میزان جذب در طول موج 450 نانومتر در هر یک از تیمارها با سه تکرار اندازه­گیری شد. پس از تجزیه واریانس داده­ها و مقایسه میانگین­ها به روش حداقل تفاوت معنی­دار، تفاوت معنی­دار بین میانگین میزان جذب پروتئین در بین تیمارها مشاهده شد (شکل 6). نتایج حاصل از آزمون الایزا(ELISA)  نشان داد بین کنترل منفی (تزریق با اگروباکتریوم حاوی ناقل فاقد ژن) و دو تیمار دیگر که حاوی ژن tPA بودند تفاوت معنی­داری در سطح یک درصد وجود داشت. هم چنین، دو تیمار P19+tPA و tPA به تنهایی اختلاف معنی‏داری در سطح یک درصد نشان دادند. با توجه به نمودار رسم شده در شکل6 می­توان به مؤثر بودن سرکوب­کننده خاموشی ژن P19 در افزایش میزان بیان tPA در گیاه توتون (N. tabacum واریته Xanthi ) پی برد. تنها تفاوت بین این دو تیمار حضور اگروباکتریوم حاوی P19 بود، در تزریق همزمان اگروباکتریوم حاوی P19 همراه با اگروباکتریوم دارای سازه حاوی ژن tPA، سطح بیان به میزان چشمگیری نسبت به تزریق تنهایی سازه هدف افزایش یافت. وقتی اگروباکتریوم حاوی ژن به تنهایی به گیاه تزریق شد میزان بیان tPA حدود 74/0% بود در حالیکه تزریق اگروباکتریوم حاوی ژن tPA به همراه اگروباکتریوم حاوی P19 میزان بیان tPA را تقریباً دو برابر افزایش داده و میزان بیان به 36/1% میزان کل پروتئین محلول و mg/g 10 وزن تر برگ رسید. در صورتیکه میزان بیان tPA در توتون در مطالعات Hahn et al (2009) حدود 0014/0% میزان کل پروتئین محلول و Masoumi Asl et al (2010) 01/0- 026/0 میلی گرم در هر کیلوگرم وزن تر برگ در انتقال ژن به هسته بود و در مطالعه Abdoli-Nasab et al (2013) میزان بیان tPA زمانیکه به کلروپلاست انتقال یافت 1% میزان کل پروتئین محلول بود. با مقایسه میزان بیان می­توان به نقش موثر P19 در خاموشی ژن و افزایش میزان بیان پی برد. از طرفی با توجه به میزان بیان بیشتر پروتئین تولیدی در حضور و عدم حضور P19 در بیان موقت نسبت به مطالعات قبلی می­توان دریافت که این سیستم برای تولید پروتئین tPA مفید می­باشد. بنابراین اگر در هر گرم وزن تر گیاه، میزان 10 میکروگرم پروتئین tPA بیان ­گردد با در نظر گرفتن اینکه گیاه رشد مناسب داشته و دارای تعداد برگ­های قابل تزریق مناسبی نیز باشد، قادر خواهیم بود در مدت زمان کمتر از یک هفته با افزایش تعداد گیاهان دارای برگ­های قابل تزریق، با توجه به ویژگی تکرار پذیری بیان موقت، به میزان مورد نیاز از پروتئین tPA دست پیدا کنیم، در مقایسه با انتقال پایدار که میزان تولید تاکنون کمتر بوده و حداقل زمان مورد نیاز برای تولید tPA در روش انتقال ژن به هسته و کلروپلاست حدود شش ماه تا یکسال بوده و همچنین در روش انتقال ژن به هسته تکرارپذیری انتقال نیز امکان­پذیر نمی­باشد.

پیش بینی می‏شود که افزایش بیان موقت بتواند به راحتی به عنوان یک سیستم بیان سریع و مقرون به صرفه برای تولید پروتئین­های نوترکیب در تعداد زیادی از گیاهان به کار برده شود. در کنار استفاده از بیان موقت برای سطح بالاتر بیان و استفاده از سازه سرکوب­کننده P19 (حاوی ژن سرکوب­کننده خاموشی)، یکی دیگر از راهکارها برای افزایش بازده تولید، هدف قرار دادن پروتئین هدف به سمت آپوپلاست و دیگر اجزای سلول است تا در آنجا نگهداری و محافظت شوند (Voinnet et al., 2003). در این آزمایش از یک نوع وکتور برای بررسی بیان پروتئین هدف استفاده شد تا هیچ گونه تفاوتی از نظر محل نگهداری محصول وجود نداشته باشد در نتیجه بتوان تفاوت بیان را به استفاده از سازه سرکوب­کننده P19 ( حاوی ژن سرکوب­کننده خاموشی ) مرتبط دانست.

شکل 5- محصول PCR ژن tPA بر روی کلونی­های آگروباکتریوم رشد کرده بر روی محیط کشت حاوی آنتی­بیوتیک با آغازگرهای اختصاصی بر روی ژل 1% آگارز. چاهک M: نشانگر مولکولی kb1 GeneRuler (Fermentas)، چاهک 1: کنترل منفی، چاهک 2: کنترل مثبت (پلاسمید حاوی ژن tPA)، چاهک‏های 3 و 4: محصولات بدست آمده از تکثیر ژن tPA.

Figure 5- PCR product of tPA on Agrobacterium colonies grown on media containing antibiotics with specific primers on 1% Agarose gel. M: 1kb standard GeneRuler (Fermentas) Ladder, 1: negative control, 2: Positive control (vector containing tPA gene), 3 and 4: products from amplified tPA gene.

شکل6- میانگین میزان جذب پروتئین گیاهان تراریخته و شاهد در طول موج 450 نانومتر.

Figure 6. The average rate of protein absorption at 450 nm in transgenic and control plants.

بر اساس مطالعات انجام­شده، مشخص شده است که PTGS بیان موقت ژن به کمک آگروباکتریوم را محدود می­کند و بررسی­های انجام شده در این رابطه نشان دادند که می­توان با بهره­گیری از پروتئین­های سرکوب­کننده خاموشی ژن که توسط ویروس کد گذاری می­شوند براین محدودیت غلبه نمود (Voinnet et al., 2003). چندین نوع پروتئین سرکوب­کننده وجود دارند که در بین آنها،P19  موثرتر است (Johansen & Carrington, 2001). پروتئین P19، به عنوان پروتئین سرکوب­کننده قوی، مکانیسم منحصر به فردی دارد به این ترتیب که به صورت انتخابی به siRNA­ های 21 و 22 نوکلئوتیدی متصل می‏شود که این اتصال الزاماً بصورت اختصاصی نیست (Arzola et al., 2011) بدین ترتیب که از طریق میل ترکیبی زیادی که با siRNA دو رشته‏ای دارد به آن متصل می­گردد و آن را تجزیه می­کند و مانع خاموشی ژن می­گردد (Burgyán & Havelda, 2011). هم چنین مطالعات نشان داده است که در زمان اتصال، P19 دایمر پروتئینی تشکیل می­دهد که از قسمت انتهای خود به انتهای siRNA یا miRNA دو رشته­ای متصل می­گردد (Alvarez et al., 2008) و آنها را غیرفعال می­کند و بدین ترتیب مانع از تشکیل ساختار دو رشته­ای می­گردد که عنصر کلیدی محافظت شده در مسیر خاموشی می­باشند (Burgyán & Havelda, 2011). هم چنین، P19 قادر به اتصال به siRNA دو رشته­ای بوده و از تشکیل کمپلکس RISC جلوگیری می­کند. اخیراً مشخص شده است که P19 مانع گسترش و پخش دوپلکس ds siRNA که سیگنال خاموشی هستند می­گردد (Dunoyer et al., 2004). بنابراین با توجه به انواع مکانیسم عمل سرکوب‏کنندگی خاموشی که توسط P19 صورت می­گیرد، کاربرد آن برای بهبود بیان موقت پروتئین­های نوترکیب می­تواند مفید باشد، زیرا که تولید و بیان بالای پروتئین نوترکیب در انتقال ژن مورد انتظار است.

سرکوب­کننده P19 به صورت موفقیت آمیزی در سنجش بیان موقت برای افزایش عملکرد چندین پروتئین نوترکیب در جنس Nicotiana به کاربرده شده است؛ در N. benthamiana چندین گزارش از افزایش میزان بیان وجود دارد: در مطالعه Voinnet et al (2003) کاربرد P19 سبب افزایش 50 برابر و حتی بیشتر میزان بیان گردید (Voinnet et al., 2003)، Liu and Kearney (2010) افزایش سطح بیان GFP را در حضور ژن سرکوب کننده خاموشی P19 تحت کنترل پروموتور 35S، 25% میزان کل پروتئین محلول گزارش نمودند در حالی که در عدم حضور این سرکوب کننده میزان بیان تقریباً ناچیز بود (Liu & Kearney, 2010)، Garabagi et al (2012) به افزایش 15 برابر میزان بیان پروتئین نوترکیب دست یافتند (Garabagi et al., 2012) و تزریق همزمان P19 در مطالعه Thomas and Walmsley (2014) سبب گردید که میزان بیان پروتئین سه برابر افزایش یابد (Kirk et al., 2005) اما در توتون (N. tabacum) گزارشات بسیار کمی از افزایش میزان بیان وجود دارد، Mohammadzadeh et al (2014) افزایش بیان پروتئین هدف را 4-5 برابر گزارش نمودند زمانی که P19 بصورت همزمان با سازه حاوی ژن تزریق گردید، میزان بیان پروتئین نوترکیب از 004/0% به 022/0% میزان کل پروتئین محلول افزایش یافت (Mohammadzadeh et al., 2014) در حالیکه مطالعه ما افزایش تقریباً دو برابر میزان بیان پروتئین tPA را در حضور P19 نشان داد.

در مطالعه­ای Garabagi et al (2012) اعلام کرده­اند که برای افزایش بیان ژن هدف، نیاز به میزان قابل توجه­ای(OD600 بیشتر از 02/0) از P19 برای آلوده سازی N. benthamiana و N. tabacum  می­باشد و در صورت افزایش میزان P19 (به حدود OD6002/0)، با کاهش میزان پروتئین نوترکیب روبرو خواهیم شد و علت آن را مرگ سلول و نکروزه شدن بافت ذکر نموده‏اند (Garabagi et al., 2012). در حالی که در این مطالعه، زمانی که انتقال ژن به صورت همزمان با غلظت بالای سرکوب­کننده خاموشی ژن صورت گرفت، میزان بالاتری از سطح بیان tPA به دست آمد بدون اینکه اثری از نکروزه شدن که نشان دهنده مرگ سلولی است بر روی برگ گیاه توتون ( N. tabacum) مشاهده شود. نتایج ما نشان داد که کاربرد P19 در بیان موقت پروتئین هدف با سطح بالای بیان همراه بوده است. احتمالاً در عدم حضور این ژن، mRNA‏های ژن تراریخت که به میزان زیادی بیان می‏شوند برای تخریب توسط سیستم خاموشی ژن در گیاه هدف قرار داده خواهند شد (Thomas & Walmsley, 2014) و این احتمال وجود دارد که علیرغم کاربرد عناصر موثر در افزایش بیان در طراحی سازه، بدلیل پدیده خاموشی ژن، با کاهش میزان بیان پروتئین نوترکیب روبرو شویم. کاربرد P19 همراه با طراحی سازه­های حاوی عناصر موثر در افزایش بیان می­تواند برای دست­یابی به بیان در سطح بالا مفید باشد.

با توجه به سادگی و سرعت بیان موقت ژن‏های هدف، انتظارمی­رود که استفاده از P19 به عنوان افزایش­دهنده میزان بیان برای تولید صنعتی پروتئین­های نوترکیب (هم چون tPA)، در کنار تحقیق به منظور جداسازی و بررسی بیوشیمیایی پروتئین­ها، بدون نیاز به استفاده از روش­های باززایی زمان­بر مربوط به تولید گیاهان تراریخت پایدار به کار رود (Voinnet et al., 2003).