ارزیابی فعالیت برخی از آنزیم‌های دفاعی نخود (Cicer arietinum L.) تحت تنش سرما

ارزیابی فعالیت برخی از آنزیم­های دفاعی نخود (Cicer arietinum L.) تحت تنش سرما

سمانه کرمی معلم¹، رضا معالی امیری²*، هوتن وفایی³، یاسمن نظیری⁴

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، ایران.

²دانشیار پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، ایران.

³ دانشجوی کارشناسی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، ایران.

⁴ دانشجوی کارشناسی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، ایران.

تاریخ دریافت: 03/05/1395، تاریخ پذیرش: 20/10/1395

چکیده

گیاهان جهت بقا و تحمل تنش‌های محیطی نیازمند مکانیسم‌های دفاعی متعددی هستند. در این پژوهش فعالیت آنزیم‌های اکسیداز متناوب (AOX) میتوکندری، سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و کاتالاز (CAT) ، میزان نشت الکترولیتی (ELI) و پراکسید هیدروژن (H₂O₂) به عنوان شاخص‌های خسارت سلولی در دو ژنوتیپ حساس (ILC533)  و متحمل (Sel 96TH11439) نخود زراعی (Cicer arietinum L.) تحت تنش سرمای 4 درجه سانتی‌گراد ارزیابی شد. نتایج تجزیه آماری نشان داد که اختلاف معنی‌داری بین ژنوتیپ‌ها تحت تیمارهای دمایی وجود داشت. تحت تنش سرما به موازات کاهش شاخص‌های خسارت، فعالیت آنزیم AOX افزایش معنی‌داری یافت. بیشترین فعالیت این آنزیم در ژنوتیپ متحمل در روز ششم پس از تنش سرما مشاهده شد در حالی­که تحت این شرایط میزان فعالیت این آنزیم در ژنوتیپ حساس به­طور معنی­داری کمتر از ژنوتیپ متحمل بود. افزایش فعالیت آنزیم AOX که با خسارت سلولی کمتر (نتایج ELI و H₂O₂) به­خصوص در روز ششم پس از تنش سرما همراه بود، بیانگر اهمیت این آنزیم در تحمل به سرما در گیاه نخود می‌باشد. افزایش معنی­دار و همزمان الگوی فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT ضمن تایید نتایج فعالیت AOX، درجه تحمل ژنتیکی نخود به سرما را افزایش داده و یا اینکه سبب بهبود گیاه پس از اعمال تنش می‌شود. چنین شاخص‌هایی ممکن است در ارزیابی ژنوتیپ‌های نخود تحت تنش سرما و یا بکارگیری آن‌ها در برنامه‌های اصلاحی مفید باشند.

واژه­های کلیدی: اکسیداز متناوب، سرما، نشت الکترولیتی، نخود.

مقدمه

گیاهان به­دلیل آنکه توانایی حرکت و جابه­جایی ندارند، پیوسته در معرض تنش‌های محیطی زنده و غیر زنده قرار دارند. بنابراین تحت شرایط مزرعه از یک طرف باید قادر به درک تغییرات محیطی بوده و از طرف دیگر توانایی پاسخ و حفظ توازن سلولی را تحت این شرایط داشته باشند (Kazemi Shahandashti et al., 2013). تنش سرما به عنوان یکی از عوامل محدود ‌کننده رشد گیاهان زراعی بر عملکرد و کیفیت محصول اثر می‌گذارد. افزایش تحمل به تنش سرما در اثر تغییر پاسخ‌های سلولی در سطوح فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی است که احتمالاً در اثر تغییر فعالیت ژن‌های القایی و برنامه‌ریزی مجدد ژنوم اتفاق می‌افتد. غشای پلاسمایی به عنوان اولین بخش از سلول بوده که به تنش سرما واکنش می‌دهد. بنابراین اندازه‌گیری میزان خسارت وارد شده به غشا از طریق شاخص نشت الکترولیتی [1](ELI) در مراحل اولیه تنش می‌تواند الگوی مناسب میزان تحمل به سرما را نمایش دهد (Heidarvand et al., 2011). از طرف دیگر، گونه‌های فعال اکسیژن[2] ‌(ROS)  شامل رادیکال‌های آزاد آنیون سوپراکسید (O₂^•−)، رادیکال هیدروکسیل (•OH) و همچنین مولکول‌های غیررادیکالی از جمله پراکسید هیدروژن (H₂O₂) از عوامل اصلی خسارت سلولی می‌باشند  (Gill and Tuteja 2010). در گیاهان، ROS‌ها طی نشت اجتناب‌‌ناپذیر الکترون‌ها به مولکول اکسیژن طی فعالیت‌های زنجیره‌‌ انتقال ‌‌الکترون در کلروپلاست، میتوکندری و غشای پلاسمایی و یا به­عنوان محصول فرعی مسیرهای متابولیکی سلول تولید می‌شوند (Heyno et al., 2011). تنش‌های محیطی از جمله سرما، به­دلیل ایجاد اختلال در فرآیندهای تعادل[3] سلولی منجر به افزایش تولید ROS‌ها می‌شوند. افزایش بیش از حد میزان ROS‌ها و یا حذف ناکارآمد آن‌ها سلول را در وضعیت تنش اکسیداتیو[4] قرار داده که می‌تواند تهدیدی برای سلول‌ در اثر پراکسیداسیون چربی‌ها، اکسیداسیون پروتئین‌ها، خسارت اسیدهای نوکلئیک، مهار آنزیم‌ها و فعال‌سازی مسیر مرگ سلولی باشد (Mishra et al., 2011; Huang et al., 2012)‌‌. با وجود اثرات مخرب، ROSها به عنوان مولکول‌های پیام رسان ثانویه[5]، در بسیاری از فرآیندهای سلولی از ­جمله پاسخ به تنش‌های سلولی شناخته شده‌‌اند (Heidarvand and Maali Amiri 2010). اینکه ROSهای سلولی به­عنوان مولکول‌های پیام­رسان عمل کنند و یا اینکه خسارت اکسیداتیو به سلول وارد کنند بستگی به تعادل در تولید ROS و سیستم‌های حذف کننده[6] آن‌ها دارد. حذف موثر ROSهای تولیدشده تحت تنش سرما نیازمند فعالیت مکانیسم‌های دفاعی سلول از جمله آنتی­اکسیدان‌‌های آنزیمی[7] شامل سوپراکسید دیسموتاز  (SOD)[8]‌، کاتالاز (CAT)[9]‌، گایاکول پراکسیداز (GPX)[10]‌، آنزیم‌های چرخه آسکوربات-گلوتاتیون مانند آسکوربات پراکسیداز (APX)[11] و گلوتاتیون ردوکتاز  (GR)[12] در بافت‌ها‌ و اندامک‌های سلولی می‌باشد (Foyer and Noctor 1998). زنجیره انتقال الکترون میتوکندریایی شامل کمپلکس‌های آنزیمی مختلفی است که در تامین شیب پروتون لازم برای تولید ATP نقش بسزایی دارند. مسیر اصلی این زنجیره که منجر به تولید انرژی می‌شود، مسیر تنفسی سیتوکروم‌ سی ‌اکسیداز (COX)[13] نام دارد که با استفاده از الکترون‌های ارسالی از استخر یوبیکوینول، اکسیژن را به آب احیا می‌کند (Wang et al., 2010). به­موازات فعالیت مسیر COX، گیاهان پایانه اکسیداز تنفسی دیگری نیز به­نام اکسیداز متناوب (AOX)[14]‌دارند که یوبیکوینول را اکسید کرده و اکسیژن را به آب احیا می‌کند (Vanlerberghe, 2013). AOX توسط یک خانواده ژنی در هسته‌ کنترل­شده که این خانواده ژنی شامل دو زیرخانواده با اسامی aox1 و aox2 می‌باشد. بیان ژن‌های aox1 (مانند aox1a در آرابیدوپسیس و توتون) در پاسخ به تنش‌های زنده و غیرزنده و همچنین عدم کارکرد مناسب مسیر انتقال الکترون میتوکندریایی تحت تاثیر قرار می‌گیرد (Gandin et al., 2012). مسیر متناوب AOX احتمالا در تعدیل تولید ROS‌هایی که طی زنجیره انتقال الکترون میتوکندریایی تولید می‌شود، نقش دارد به طوری­که تحت تاثیر تنش‌های محیطی میزان فعالیت آنزیم AOX افزایش می‌یابد و در نتیجه میزان ROS و در نهایت خسارت سلولی کاسته می­شود (Vanlerberghe et al., 2009). به­دلیل مشکلات کشت بهاره گیاه نخود (Cicer arietinum L.) از جمله خشکی و کمبود رطوبت آخر فصل که منجر به کاهش تولید تا میزان 400-300 کیلوگرم در هکتار می‌شود، کشت پاییزه این محصول با توجه به بارندگی و وجود رطوبت در پاییز و زمستان منطقی به نظر می‌رسد، لیکن سرما عامل محدود‌‌کننده در توسعه کشت پاییزه نخود محسوب می‌شود (Kazemi Shahandashti et al., 2013).‌ مطالعه مسیر تنفسی AOX تحت تنش سرما در گیاه نخود به دلیل نقش احتمالی آن در تنظیم تولید ROS‌ها می‌تواند در شناسایی مکانیسم‌های تحمل به تنش سرما و بکارگیری آن‌ها در برنامه‌های اصلاحی مفید باشد. در این پژوهش فعالیت آنزیم AOX به همراه برخی پاسخ های دفاعی دو ژنوتیپ متحمل و حساس نخود تحت تنش سرما بررسی شد.

مواد و روش‌ها

بذور دو ژنوتیپ متحمل (Sel96Th11439) و حساس (ILC533) به تنش سرما نخود کابلی از موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور تهیه شد. بذور در محلول هیپوکلریت سدیم 10 درصد به مدت 10 دقیقه ضد عفونی شده و پس از شستشو  5 الی 10 بذر در پتری­دیش بر روی کاغذ صافی و آب مقطر جوانه زدند. گیاهچه­ها به گلدان (نسبت ماسه، خاک رس و کود برگ 1:3:1) انتقال داده شد و در اتاقک رشد در گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه تهران با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نوری 220 میکرو مول بر متر مربع بر ثانیه و دمای 23 درجه سانتی­گراد و رطوبت 75 درصد به مدت 21 روز نگه­داری شدند. بخشی از گیاهان به­عنوان  نمونه­های کنترل یا شاهد در چنین شرایطی حفظ شده و بخشی دیگر به دمای 4 درجه سانتی­گراد منتقل شد و به­مدت 6 روز در آن دما نگه­داری شد. نمونه­­برداری از برگ­ها در روز اول، سوم و ششم تحت تیمار دمایی 4 درجه سانتی­گراد انجام شد.

در اندازه‌گیری میزان هدایت الکترولیتی از برگ‌های کاملاً سالم بخش میانی ساقه استفاده شد. هشتاد میلی­گرم برگ‌ پس از برش افقی، به لوله آزمایش حاوی ده میلی­لیتر آب مقطر انتقال یافت. جهت جذب بهتر آب با استفاده از پمپ خلا هوای درون محیط خارج شده و لوله‌های آزمایش به مدت سی دقیقه در دستگاه شیکر قرار گرفتند. میزان هدایت الکترولیتی نمونه‌ها (EC1) با استفاده از دستگاه EC متر (Inolab، آلمان) قرائت شد. در مرحله دوم میزان هدایت الکترولیتی (EC2) محتوی لوله آزمایش، پس از 10 دقیقه قرارگیری در حمام آب جوش (95 درجه سانتی­گراد) و سپس 30 دقیقه قرارگیری در دستگاه شیکر تعیین شد و در نهایت میزان شاخص خسارت براساس فرمول محاسبه شد (Popov et al., 2005).

در خصوص جداسازی میتوکندری، پنج گرم نمونه برگی از در 20 میلی لیتر بافر استخرج شامل 4/0 مولار مانیتول،‌‌50 میلی‌مولار MOPS[15] (pH 7.2)‌، 2 میلی‌مولار EGTA[16]، 4 میلی‌مولار L-cystein‌، 20 میلی‌مولار بتا‌مرکاپتواتانول[17]‌، 6/0 درصد PVP[18]‌ و 5/0 درصد BSA[19] در دمای 4 درجه سانتی‌گراد هموژنیزه شد. محلول حاصل با سرعت 4000×g به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول شناور در دو مرحله یکبار به مدت 10 دقیقه با سرعت 2000×g و سپس به مدت30 دقیقه با سرعت 10,000×g سانتریفیوژ شد. رسوب موجود در تیوب با بافر شست­و­شو شامل 3/0 مولار مانیتول، 20 میلی مولار MOPS، 1/0 درصد حجمی Defatted BSA و یک میلی مولار EGTA هموژنیزه شد و سپس به مدت 10 دقیقه با سرعت 2000×g سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ محلول رویی به مدت 15 دقیقه با سرعت 15000×g، رسوب موجود در انتهای تیوب در بافر شست­و­شو هموژنیزه شد (Erdal et al., 2015).

فعالیت AOX از طریق اسپکتروفتومتری تغییرات غلظت فرم اکسید (DQ) و احیای (DQH₂) دوروکویینول[20] به دست آمد. فعالیت AOX در محیط S  شامل 5 میلی‌مولار MgCl₂ ، 10 میلی‌مولار K₂HPO₄ ، 10 میلی­مولار سدیم پیروات، 5 میلی‌مولارDDT[21]، 025/0 درصد EDTA[22] ، 8/1 میکرومول میکسوتیوزول[23] و 10 میلی­مولار TES (تنظیم pH روی 8/6 توسط KOH) به دست آمد. فعالیت آنزیم AOX پس از افزودن 200 میلی­لیتر پیش­ماده DQH₂ به 2500 میلی­لیتر از محیط S و اضافه نمودن 20 میلی­لیتر عصاره حاوی میتوکندری به­کمک اسپکتروفتومتر   (Shimadzu 160) در طول موج 288 نانومتر قرائت شد (‌Affourtitand Moore 2003).

اندازه گیری فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز طبق روش (1987)Beyer and Fridovich  انجام شد. فعالیت این آنزیم به صورت فتومتریک بررسی شد. بافر اصلی واکنش شامل بافر فسفات (8/7pH=) 100 میلی مولار، متیونین12 میلی مولار، نیتروبلو تترازولیوم 75 میکرو مولار،EDTA 100 میکرو مولارو ترایتون ایکس-100 (025/0 درصد) بود. از بافر اصلی به هر چاهک به میزان290 میکرو لیتر اضافه شد. سپس از بافر ریبوفلاوین 2 میکرو مولار به میزان 5 میکرو لیتر به مخلوط واکنش اضافه شد و دستگاه روی طول موج  nm 560 کالیبره شد. برای سنجش هر نمونه 10 میکرولیتر از عصاره پروتئینی استفاده شد. این واکنش بر اساس میزان احیای نوری نیتروبلو تترازولیوم و توانایی آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در ممانعت از این واکنش بررسی شده است. میزان فعالیت آنزیم براساس واحد آنزیم در دقیقه در میلی­گرم پروتئین  محاسبه شد.

فعالیت آنزیم کاتالاز در دمای 25 درجه سانتی­­گراد به­روش (1998)Scebba et al.  اندازه­گیری شد. مواد استفاده شده شامل 3000 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم (7=pH) 50 میلی­مولار، 5 میکرولیتر پراکسید­هیدروژن 41/3 مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیم بوده و فعالیت آنزیم بر اساس میکرومول پراکسید ­هیدروژن تجزیه­شده در دقیقه در میلی­گرم پروتئین محاسبه شد.

محتوای H₂O₂ برگ با کمک 35/0 گرم از بافت برگی انجام شد. ابتدا برگ‌ها در ازت مایع ساییده­شده و در حمام آب یخ با 5 میلی‌لیتر TCA[24] 1/0‌% کاملا مخلوط شدند. مخلوط هموژن­شده در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با سرعت g×12000 به­مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 5/0 میلی­لیتر از مایع رویی به 5/0 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلی­مولار افزوده شد. سپس یک میلی­لیتر از یدید پتاسیم یک مولار به آن اضافه شده و میزان جذب در طول موج 390 نانومتر قرائت شد (Loreto and Velikove 2001).

داده­های آزمایشی بر اساس آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار به کمک نرم­افزار SPSS 20 تجزیه و تحلیل شد و میانگین­ها بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن مقایسه شدند.

نتایج و بحث

نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که اثر متقابل ژنوتیپ و تیمارهای دمایی از نظر صفات مورد بررسی تفاوت­های معنی­داری (0.01P≤) داشتند که دلالت بر وجود تنوع ژنتیکی در بین ژنوتیپ­ها و نیز واکنش متفاوت ژنوتیپ­ها تحت تیمارهای دمایی داشت. در این پژوهش ELI به­عنوان شاخص فیزیولوژیکی در تعیین خسارت غشاء در ژنوتیپ‌های نخود به کار گرفته شد. آزمون مقایسه میانگین ELI، ‌اختلاف معنی‌داری بین تیمارهای دمایی نشان داد که بیانگر تنوع بالقوه پاسخ­های دو‌ ژنوتیپ­ نخود تحت این شرایط بود (شکل1). تحت دمای فیزیولوژیکی (23 درجه سانتی‌گراد)، میزان ELI در ژنوتیپ متحمل به­طور معنی­داری کمتر از ژنوتیپ حساس بود که بیانگر ظرفیت ژنتیکی متمایز آن‌ها می‌باشد. انتقال گیاهچه‌ها به دمای 4 درجه سانتی‌گراد در روز اول تغییر قابل توجهی در میزان ELI ایجاد نکرد. با این­وجود در روز سوم و ششم تنش، میزانELI  در ژنوتیپ حساس افزایش معنی‌داری داشت در حالی­که در ژنوتیپ متحمل تغییر معنی‌داری در میزان ELI مشاهده نشد. کمترین و بیشترین میزان ELI مربوط به ژنوتیپ متحمل و حساس در روز ششم تنش بود. بنابراین نتایج ELI تحت تنش­های طولانی مدت (شش روز پس از تنش) احتمالا بیانگر درجه تحمل متفاوت دو ژنوتیپ­ استفاده شده در مقایسه با تنش­های کوتاه مدت (یک روز پس از تنش) خواهد بود. به طور کلی میزان کم نشت الکترولیتی در سلول‌های برگ بیانگر تحمل گیاه به تنش سرما می‌باشد (Kazemi Shahandashti et al., 2014)‌. بنابراین به نظر می‌رسد ژنوتیپ متحمل با میزان ELI کمتر تحت شرایط تنش از مکانیسم‌های دفاعی فعال‌تری برخوردار بوده که سبب نوعی سازگاری سلولی در آن شده است. افزایش میزان ELI به بالاتر از  50 درصد بیانگر خسارت شدید سلولی و در نهایت مرگ آن می‌باشد که چنین وضعیتی در ژنوتیپ حساس مشاهده شد (Heidarvand et al., 2011).

شکل 1-  تغییر شاخص هدایت الکترولیتی (ELI) تحت شرایط کنترل، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرمای چهار درجه سانتی­گراد در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساس ILC 533 (ستون خاکستری) نخود.

Figure 1- Change in electrolyte leakage index ELI in the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

میزان بالاتر ELI تحت تنش سرما ناشی از تولید ROS بوده که در نهایت منجر به تنش اکسیداتیو می‌شود (Heidarvand and Maali-Amiri 2013). بنابراین، در این آزمایش الگوی تغییر میزان H₂O₂ طی روزهای مختلف تنش سرما اندازه‌گیری شد. این مولکول برخلاف سایرROSها، نیمه عمر بیشتری داشته و قادر به انتشار مابین غشاهای زیستی می­باشد و به­عنوان مولکول پیام­رسان در محلی به­دور از محل تولید خود، سبب ایجاد تنش اکسیداتیو در سلول­های گیاهی می­شود ‌(Bienert et al., 2007).‌ نتایج نشان داد که در ژنوتیپ متحمل، میزان H₂O₂ بعد از یک افزایش معنی‌دار طی روزهای اول و سوم تنش،‌ در روز ششم کاهش یافت به طوری­که تحت چنین شرایطی به کم‌ترین سطح بین تیمارهای آزمایشی رسید. تحت چنین شرایطی میزان H₂O₂ در ژنوتیپ حساس به طور مهیجی در مقایسه با شرایط کنترل افزایش یافت (حدود 33%) (شکل 2). چنین وضعیتی ضمن تایید نتایج ELI بیانگر توسعه تنش اکسیداتیو تحت تنش سرما (در مقایسه با شرایط کنترل) در ژنوتیپ حساس (در مقایسه با ژنوتیپ متحمل) می‌باشد. بنابراین در نخود، درجه پاسخ به تنش سرما وابسته به ژنوتیپ متفاوت بوده که مطالعه الگوهای خسارت در شرایط کنترل و تنش نشان دهنده آن بودند (Nazari et al., 2012).

SOD و CAT مولکول‌های فعال در سازوکارهای دفاعی سلول تلقی شده که به ترتیب نقش مهمی در تولید و تخریب H₂O₂ دارند (Kazemi Shahandashti et al., 2014). نتایج نشان داد که از نظر فعالیت آنزیمی، دو ژنوتیپ پاسخ‌های متفاوتی به سرما نشان دادند. سطوح فعالیت SOD در ژنوتیپ حساس پس از تغییر جزئی در روز اول تنش، به تدریج طی روزهای سوم و ششم تنش کاهش یافت به طوری که به کمترین میزان فعالیت خود رسید در حالی­که در ژنوتیپ متحمل افزایش تدریجی در میزان فعالیت SOD مشاهده شد. بیشترین میزان فعالیت SOD (‌حدود 50 درصد)‌ در روز ششم تنش سرما بود. در روز اول تنش، میزان فعالیت CAT در ژنوتیپ متحمل کاهش یافته در حالی­که در روز سوم و ششم تنش افزایش معنی‌داری مشاهده شد، در نتیجه فعالیت آن به سطوح مشاهده شده در شرایط کنترل رسید. فعالیت این آنزیم در ژنوتیپ حساس، کاهشی در حدود 52 درصد در روز سوم تنش درمقایسه با کنترل نشان داد.

شکل 2- تغییر میزان پراکسید هیدروژن (H₂O₂) تحت شرایط کنترل، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرمای چهار درجه سانتی­گراد در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساس ILC 533 (ستون خاکستری) نخود.

Figure 2- Change in hydrogen peroxide (H₂O₂) content in the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

شکل 3- تغییر فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) تحت شرایط کنترل، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرمای چهار درجه سانتی­گراد در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساس ILC 533 (ستون خاکستری) نخود.

Figure 3- Change of activity in superoxide dismutase (SOD) in the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

اگرچه فعالیت آن در روز ششم تنش بیشتر از روز سوم تنش بود اما در مقایسه با کنترل کاهش معنی‌داری در فعالیت CAT مشاهده شد (شکل 3 و 4). بنابراین آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مطالعه شده  در این تحقیق با یکدیگر همکاری کرده به طوری که افزایش فعالیت همزمان آن‌ها سبب کاهش میزان خسارت سلولی (ELI) و همچنین کاهش H₂O₂ به عنوان یکی از ROSهای تولیدی سلول شده است. در میتوکندری گیاهان، فرآیند انتقال الکترون، تولید ROS و در نهایت میزان ATP پیچیده می‌باشد زیرا تحت تنش، مسیر متناوب دیگری از جریان الکترون به­سمت آنزیم AOX ایجاد شده که یک نوع انعطاف‌پذیری بین سه فرآیند متابولیسم کربن، انتقال الکترون و تولید ATP فراهم می­آورد  (Vanlerberghe 2013). بنابراین در مرحله بعدی، فعالیت آنزیم AOX به­عنوان یکی از کمپلکس‌های آنزیمی مهم در زنجیره انتقال الکترون میتوکندریایی گیاهان سنجیده شد.

میزان فعالیت آنزیمAOX  با طولانی‌تر شدن دوره تنش از روز اول به ششم در هر دو ژنوتیپ پس از یک کاهش معنی‌دار، افزایش نشان داده که بیانگر نقش موثر این آنزیم در پاسخ‌های بیوشیمیایی گیاه به تنش سرما بود

شکل 4- تغییرفعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) تحت شرایط کنترل، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرمای چهار درجه سانتی­گراد در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساس ILC 533 (ستون خاکستری) نخود.

Figure 4- Change of activity in catalase (CAT) in the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

. با این­وجود میزان فعالیت AOX در ژنوتیپ متحمل بسیار بیشتر از ژنوتیپ حساس بود طوری­که این روند صعودی برخلاف ژنوتیپ حساس در روز سوم پس از تنش آغاز شد و در روز ششم پس از تنش به حداکثر میزان خود رسید (شکل 5). تحقیقات نشان داده است که فعالیت AOX تولیدO₂^.- را تعدیل کرده که به­نوبه خود تبدیل آن به سایر گونه‌های ROS مانند H₂O₂ و OH• را کاهش می‌دهد (Rogovet al., 2014). به نظر می‌رسد که تحت تنش پیام­رسانان تنش اکسیداتیو و خصوصیات غشای پلاسمایی (نتایج ELI و H₂O₂) به عنوان عوامل اساسی در تنظیم فعالیت ژن‌های aox عمل کرده که در نهایت سبب مهار تولید ROS (در این آزمایش H₂O₂) می‌شود (شکل 1 و 2).

شکل 5- تغییر فعالیت آنزیم اکسیداز متناوب (AOX) تحت شرایط کنترل، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرمای چهار درجه سانتی­گراد در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساس ILC 533 (ستون خاکستری) نخود.

Figure 5- Change of activity in alternative oxidase (AOX) in the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

تحقیقات درتوتون نشان داده است که انتقال گیاهان به شرایط سرما باعث القای فعالیت آنزیم AOX می‌شود به طوری­که میزان مالون‌ دی‌آلدئید[25]‌ (MDA) به عنوان یکی از شاخص‌های خسارت سلولی کاهش یافت (Wang et al., 2011).‌

بنابراین، در میتوکندری تغییر در تولید ROS در اثر تغییر در ظرفیت مهار ROS سلول رخ می‌دهد. این بدان معنی است که مکانیسم‌های کنترلی تولید ROS میتوکندریایی مانند AOX می‌توانند اهمیت زیادی در تعیین اینکه چگونه سلول میزان ROS خود را مدیریت کرده و سطح ثابت ROS سلولی را تعیین کند، دارند (Amirsadeghi et al., 2006).

ارتباط بین خسارت سلولی (ELI) و فعالیت آنزیم AOX در این آزمایش غیرهمسو بوده به طوری که میزان بالاتر فعالیت این آنزیم در ژنوتیپ متحمل با کاهش خسارت سلولی در ارتباط بود. نکته جالب آن است که فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نیز به موازات افزایش فعالیت آنزیم AOX در نخود مخصوصا در ژنوتیپ متحمل افزایش یافت. به نظر می‌رسد مسیر AOX و مسیر پاسخ‌های آنتی‌اکسیدانی در سلول با یکدیگر همکاری داشته که در نتیجه آن بیشترین مهار تولید H₂O₂ و میزان ELI با بیشترین فعالیت آنزیم AOX و آنتی‌اکسیدان‌ها همراه بود.

افزایش فعالیت آنزیم AOX نشان داد که القای فرآیند سازگاری سلولی در جهت مهار ROS ممکن است در سطح رونویسی و ترجمه صورت گیرد طوری­که انتقال گیاهچه‌ها به سرما، در مسیر انتقال الکترون در میتوکندری اختلال ایجاد کرده و گیاه با سنتز پروتئین AOX و همچنین افزایش فعالیت آن به این شرایط پاسخ ‌دهد که در نتیجه آن میزان ROS سلولی کاهش می‌یابد‌ (نتایج H₂O₂ و ELI). ژنوتیپ حساس نخود به دلیل فعالیت کمتر آنزیم AOX به موازات ظرفیت کاهش یافته فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی دچار خسارت بیشتری در مقایسه با ژنوتیپ متحمل شد. مطالعه بهتر و دقیق‌تر مکانیسم فعالیت این آنزیم و اعضای خانواده آن و همچنین مطالعه راهکارهای افزایش بیان و فعالیت این آنزیم در نخود زراعی راهکاری مهم در تحمل به تنش سرما در این گیاه بوده به ­طوری­که بکارگیری‌ آن‌ها کشت پاییزه این گیاه را ممکن می‌سازد.

منابع