ارزیابی تنوع ژنتیکی در ژنوتیپ‌های چغندرقند (Beta vulgaris L.) با استفاده از نشانگر ISSR

کیخسروی, حمیده; دهداری, مسعود; معصومی اصل, اسد

doi:10.22103/jab.2017.1754

تعداد نشریات	26
تعداد شماره‌ها	447
تعداد مقالات	4,557
تعداد مشاهده مقاله	5,380,003
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	3,580,074

ارزیابی تنوع ژنتیکی در ژنوتیپ‌های چغندرقند (Beta vulgaris L.) با استفاده از نشانگر ISSR

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 7، دوره 9، شماره 2، شهریور 1396، صفحه 127-141 اصل مقاله (593.99 K)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2017.1754

نویسندگان

حمیده کیخسروی¹؛ مسعود دهداری^* ²؛ اسد معصومی اصل³

¹دانشجوی کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج، ایران.

²دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج، ایران.

³استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج، ایران.

چکیده

چغندرقند یکی از مهمترین گیاهانی است که در تأمین غذای مردم جهان نقش کلیدی دارد و از نظر ارزش غذایی در ردیف برنج، ذرت، گندم، سیبزمینی و حبوبات قرار دارد. تعیین میزان تنوع ژنتیکی در مواد گیاهی گام اولیه برای شناسایی، حفظ و نگهداری ذخایر توارثی و طراحی برنامه‌های اصلاحی میباشد. بهمنظور بررسی تنوع ژنتیکی در 20 ژنوتیپ چغندرقند، از 20 آغازگر ISSR استفاده گردید. بعد از استخراج DNA و تکثیر قطعات با استفاده از آغازگرهای ISSR، نوارهای حاصله امتیازبندی شدند و تجزیههای آماری صورت گرفت. ﺷﺎﺧﺺﻫﺎی ﺗﻨﻮع ژﻧﺘﯿﮑﯽ ﺑﻪدﺳﺖ آﻣﺪه در ژﻧﻮﺗﯿﭗهای چغندرقند مورد مطالعه نشان داد که بیشترین میزان محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) مربوط به مکان UBC853 (38/0) و کمترین میزان PIC مربوط به مکان UBC847 (13/0) بود. همچنین بیشترین میزان شاخص شانون که نشان دهنده تنوع بین جمعیتی است، مربوط به مکانUBC830 (32/4) در حالی که مکان ژنی UBC847 دارای کمترین میزان شاخص شانون (58/0) بود. تجزیه خوشهای براساس دادههای مولکولی با استفاده از ضریب تشابه جاکارد و روش UPGMA، ارقام را در 4 گروه اصلی قرار داد. براساس نتایج حاصل از تجزیه به مولفههای اصلی، سه مولفه اول به ترتیب 67/72، 99/5 و 05/4 درصد از واریانس کل را توجیه کردند. گروهبندی حاصل از مولفههای اصلی، نتایج تجزیه خوشهای را تا حدی تأیید کرد. از نتایج حاصل از این مطالعه میتوان در برنامههای بهنژادی چغندرقند استفاده نمود.

کلیدواژه‌ها

چغندرقند؛ نشانگر ISSR؛ تنوع ژنتیکی؛ اطلاعات چند شکلی

اصل مقاله

ارزیابی تنوع ژنتیکی در ژنوتیپ‌های چغندرقند (Beta vulgaris L.) با استفاده از نشانگر ISSR

حمیده کیخسروی¹، مسعود دهداری*²، اسد معصومی اصل³

¹دانشجوی کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج، ایران.

²دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج، ایران.

³استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج، ایران.

تاریخ دریافت: 21/11/1395، تاریخ پذیرش: 22/04/1396

چکیده

واژه‌های کلیدی: چغندرقند، نشانگر ISSR، تنوع ژنتیکی، اطلاعات چند شکلی.

مقدمه

چغندرقند با نام علمی (. Beta vulgaris L) گیاهی دگرگشن، دیپلوئید و دو ساله از تیره اسفناج است که برای تولید ریشه ذخیرهای کشت میشود. طول دوره رشد چغندرقند، بسته به شرایط محیطی و ژنوتیپ، از 5 تا 9 ماه متغیر میباشد و به عنوان گیاهی دیررس شناخته میشود (Khajehpor, 2011). چغندرقند یکی از دوازده گیاه اصلی است که غذای مردم جهان را تأمین می کند و از نظر ارزش غذایی در ردیف برنج، ذرت، گندم، سیب زمینی و حبوبات قرار می گیرد. قند یکی از عمدهترین و ارزانترین موادغذایی است و به عنوان سرچشمه انرژی محسوب می شود. ساکارز تهیه شده از چغندرقند یک مکمل غذایی در سراسر جهان است که حدود 1/3 ساکارز جهان را شامل می شود (Basati, et al., 2003). منابع ژنتیکی گیاهی، علاوه بر زیربنای توسعه کشاورزی، به‌عنوان منبعی از سازگاری ژنتیکی، همچون سپری در برابر تغییرات محیطی عمل می‌کنند. این منابع تأمین‌کننده مواد خام ژنتیکی هستند که درصورت بهره‌برداری صحیح از آن‌ها، واریته‌های جدید و مطلوب‌تر گیاهی را می‌توان تولید کرد (Abdmishani & Shahnejat-Bushehri, 1997). جهت افزایش تولید و استفاده بهینه از منابع ژنتیکی و تنوع موجود در آن‌ها روش‌های معمول اصلاحی به تنهایی کافی نبوده و به نشانگرهای مولکولی به عنوان مکمل نیاز دارند. از آنجا که موفقیت هر به‌نژادگر نیز به تعیین تنوع و استفاده از آن‌ها در برنامه‌های اصلاحی بستگی دارد، لذا ضروری است که تنوع موجود در جامعه گیاهی مورد مطالعه قرار گیرد (Nematzadeh et al., 2003). بدلیل تنوع کم و تأثیر عوامل محیطی و مراحل رشدی گیاه بر نشانگرهای مورفولوژیکی و پروتئینی، امروزه نشانگرهای مبتنی بر DNA به عنوان ابزارهای کارآمد و مکمل برای تعیین سطح تنوع و تعیین روابط ژنتیکی ژنوتیپ‌ها به‌کار می‌روند ( Babajanpour et al., 2009; Barzan et al. 2015; Saghalli et al. 2016 ). با توجه به موارد فوقالذکر برآورد تنوع ژنتیکی در ژنوتیپهای مختلف چغندرقند براساس صفات مورفولوژیکی، سخت است و نشانگرهای بیوشیمیایی نیز تنوع کمی را آشکار میکنند. اما نشانگرهای مولکولی توانایی تشخیص تنوع ژنتیکی در هر زمان و مکان به صورت وسیع دارند. نشانگرهای مولکولی تحت تاثیر محیط نیستند و پیشنهاد شده برای تعیین تشابه ژنتیکی میان ژنوتیپ‌ها استفاده شوند. در این میان نشانگر ISSR به طور گسترده‌ای برای تجزیه و تحلیل تنوع گیاهان مورد استفاده قرار گرفته‌است. هرچند ازRAPD وSSR در چغندرقند برای شناسایی و نقشه‌برداری ژرم‌پلاسم نیز استفاده شده‌است ( .(Qiaohong, et al., 2012 مزایای استفاده از نشانگر مولکولی RAPD و ISSR در تشخیص تنوع ژنتیکی، سادگی، سرعت روش، حداقل DNA موردنیاز و هزینه کم است. گزارشات مختلف در گیاهان مثل Wu et al. (2004) در برنج،Shahriari Ahmadi et al. (2012) در ژنوتیپهای پنبه، Kantetky et al. (1995) در ذرت، Naderi et al. (2015) در لاینهای نخود، Rao et al. (2007) در ارقام زراعی و نژادهای وحشی نخود، Bornet et al. (2002) در ارقام سیبزمینی حاکی از قدرتمند بودن نشانگر ISSR در برآورد تنوع ژنتیکی در اکثر گیاهان است. از نشانگرهای مولکولی از جمله ISSR در چغندرقند نیز در چند مطالعه استفاده شده است. Srivastara et al. (2007) با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR تنوع ژنتیکی در چهار جمعیت دیپلوئید چغندرقند بررسی کردند. آنها 327 نوار برای 28 نشانگر RAPD و 39 نوار برای چهار آغازگر ISSR مشاهده نمودند. متوسط محتوی اطلاعات چندشکلی (PIC) برای RAPD و ISSR به ترتیب 41/0 و 44/0 در مطالعه آنها بدست آمد. Wang and Goldman (1999) روابط ژنتیکی میان 37 ژنوتیپ چغندر قند با استفاده از نشانگر RAPD مطالعه نمودند. نمودارهای دو بعدی منشا مشترک ژنوتیپهای مورد مطالعه آنها به اثبات رسانید. Smulders, et al.(2010) 12نشانگر SSR را برای توصیف 40 واریته دیپلوئید و تریپلوئید چغندرقند بکار گرفتند. آنها تکثیر 21-3 آلل را گزارش نمودند و اظهار داشتند که تنوع ژنتیکی در گونههای دیپلوئید از گونههای تریپلوئید خیلی بیشتر است. Abassi, et al. (2014) از 18 نشانگر SSR برای ارزیابی 168 ژنوتیپ حاصل از 12 والد چغندرقند استفاده کردند. تجزیه خوشهای ژنوتیپهای گردهافشان را از ژنوتیپهای نرعقیم تفکیک نمود. در مطالعه دیگرLi et al. (2010) تنوع ژنتیکی 111 اینبرید لاین حاصل از بذر و 178 اینبریدلاین حاصل از دانهگرده را به کمک نشانگر SSR بررسی کردند. آنها دو زیر گروه کاملا مشخص در کل ژرمپلاسم معرفی کردند. اینبریدلاینهای حاصل از بذر از نظر گروههای هتروتیک متفاوت از اینبریدلاینهای حاصل از دانه گرده بودند. با وجود مطالعات گستردهای که روی بررسی تنوع ژنتیکی چغندرقند در داخل و خارج از کشور صورت گرفته است، اما بر روی ژنوتیپهای مورد استفاده در این مطالعه گزارشی در خصوص استفاده از نشانگرهای ISSR در دسترس نیست. با توجه به موارد فوق و این که استفاده از نشانگرهای ISSR نیازی به اطلاعات توالی ژنوم ندارد و منجر به ایجاد الگوهای چندجایگاهی و بسیار چندشکل میشود (Askari et al., 2011; Ghasemi et al., 2010; Zamani et al., 2011; Zamani et al., 2015)، به همین دلیل این مطالعه با بکارگیری 20 ژنوتیپ چغندرقند و 20 آغازگر ISSR طراحی گردید.

مواد و روش

به منظور بررسی میزان تنوع ژنتیکی میان 20 ژنوتیپ مختلف چغندرقند (جدول 1)، از 20 آغازگر ISSR با توجه به مطالعات قبلیIzzatullayeva et al., 2014)) استفاده شد (جدول 2). بذور و ژنوتیپ‌ها از موسسه اصلاح و تهیه بذر چغندرقند کرج تهیه شدند. برای تهیه نمونه‌های برگی، از هر رقم 12 عدد بذر در گلدان کاشته شد و پس از گذشت چهار هفته نمونه‌های برگ گیاهچه‌های جوان تهیه و به فریزر ۴۰- درجه‌سانتی‌گراد منتقل گردیدند و تا زمان استخراج DNA در این دما نگهداری شدند. استخراج DNA با استفاده از روش Murray & Thampson, (1980) انجام گرفت. کمیت و کیفیت نمونه‌های DNA با استفاده از روش اسپکتوفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز 7/0 در صد تعیین شد. نمونه‌های DNA پس از تعیین غلظت، به غلظت 150 میکرولیتر رقیق شدند DNA های ژنومی با کیفیت مطلوب برای انجام واکنش‌های PCR مورد استفاده قرار گرفتند. تکثیر DNA ژنومی با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و با دستگاه ترموسایکلر PCR-MJ Mini-BIO RAD, Germany)) انجام شد. تکثیر با آغازگرها و به کمک PCR صورت پذیرفت. محصول حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز (5/1 درصد) Top vision آشکارسازی شد. رنگ آمیزی ژل‌ها با اتیدیوم بروماید (1μg/ml) صورت گرفت. در مرحله آخر از ژل با اشعه UV و توسط دستگاه ژل‌داک (Gel Logic QUANTUM ST4, Germany) عکس‌برداری شد. نوارهای ایجاد شده بوسیله هر آغازگر به صورت صفر و یک (به ترتیب برای عدم وجود و وجود) بدون در نظر گرفتن شدت نواردهی امتیازبندی شدند. تجزیه و تحلیل مشاهدات با استفاده از نرم افزارهای NTSYS PC 2.02 و Popgen32 صورت پذیرفت (Francis et al., 1999). شاخص محتوای اطلاعات چند شکلی PIC با استفاده از فرمول²ΣPi PIC= 1 - محاسبه شد (Botstein et al., 1980). در این فرمول Pi فراوانی آلل i م در یک مکان مشخص می‌باشد. با توجه به ضریب همبستگی کوفنتیکی در نهایت تجزیه خوشهای به روش UPGMA انتخاب و انجام شد. سپس پراکنش ژنوتیپها با استفاده از نمودار سه بعدی حاصل از سه مولفه اصلی اول برای تایید یا عدم تایید گروهبندی حاصل از تجزیه خوشهای بررسی گردید.

نتایج و بحث

با بررسی تعداد نوارهای چند شکل، آغازگرهای مطلوب شناسایی و برای کلیه نمونهها مورد استفاده قرار گرفتند که در نهایت 19 جفت آغازگرهای ISSR نوارهای چند شکل را در ارقام مورد بررسی نشان دادند. و تنها یک آغازگر (UBC859) نتوانست تکثیر نماید و بنابراین نواری هم ایجاد نکرد. الگوی نواری حاصل از آغازگر UBC824 از سری آغازگرهای ISSR در شکل (1) نشان داده شده است.

جدول 1 - مشخصات ژﻧﻮﺗﯿﭗهای چغندرقند ﻣﻮرد مطالعه.

Table 1- Description of the studied sugar beet genotypes.

ردیف No.	ژنوتیپ Genotype	شجره Pedigree	منشأ و ﻣﺤﻞ ﺟﻤﻊآوری origin and Collection region
1	SBSI.16	--------	Iran
2	32099	SC (7112* 261)* 5RR	Iran
3	32101	SC (7112SB36) 5RR	Iran
4	32102	SC (419SB36)5RR	Iran
5	32106	SC (7112SB36)5RR-HSF-33	Iran
6	32107	SC (419SB36)5RR-HSF	Iran
7	32109	SC (7112SB36)7221-34-IISF-7	Iran
8	32111	SC (7112SB36)7221-43-HSF-39	Iran
9	32113	SC (7112SB36)110-7-HSF-8	Iran
10	32116	SC (7112SB36)110-52-HSF-59	Iran
11	32117	SC (7112SB36)110-52-HSF-63	Iran
12	32122	SC (7112SB36)111-52-HSF-19	Iran
13	32123	SC (7112SB36)111-52-HSF-25
14	F- 20505	---------- -----------	Iran
15	Antic	-----------	Gemany
16	Pars	-----------	Iran
17	Doroti	-----------	France
18	Shirin	----------	Iran
19	Karaji	----------	Iran
20	Marak	----------	Belgian

بجز نوارهای حاصل از آغازگرهای UBC834، UBC835، UBC845، UBC847، UBC848 و UBC851 نوارهای سایر آغازگرها 100درصد چندشکل نشان دادند (جدول 3). از کل 149 نوار تولید شده 15 نوار تک شکل(منومورف) و 134 نوار از آنها چندشکل بودند. بیشترین میزان محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) مربوط به مکان ژنیUBC853 به مقدار 38/0و کمترین آن مربوط به مکان ژنی UBC847 به مقدار 13/0 بود (جدول 4). محتوای اطلاعات چند شکلی به عنوان یکی از ویژگیهای مهم نشانگرهای مولکولی در نظر گرفته میشود و میتواند برای ارزیابی تمایز نشانگرها از هم بکار رود (Junjian et al., 2002).

جدول2- مشخصات 20 آغازگر ISSR مورد مطالعه.

Table 2- Description of the 20 studied ISSR markers.

دمای اتصال (سلسیوس) Annealing temperature (Celsius)	توالی آغازگر 5 Sequences (5 )	آغازگر Primers	شماره No.
44.6	CTCTCTCTCTCTCTCTA	UBC814	1
47.1	TCTCTCTCTCTCTCTCC	UBC823	2
47.1	TCTCTCTCTCTCTCTCG	UBC824	3
47.1	ACACACACACACACACC	UBC826	4
47.1	ACACACACACACACACG	UBC827	5
47.1	TGTGTGTGTGTGTGTGG	UBC830	6
48	AGAGAGAGAGAGAGAGYT	UBC834	7
48	AGAGAGAGAGAGAGAGYC	UBC835	8
48	GAGAGAGAGAGAGAGAGYT	UBC840	9
44.6	GAGAGAGAGAGAGAGAT	UBC842	10
48	CTCTCTCTCTCTCTCTRG	UBC845	11
48	CACACACACACACACACRC	UBC847	12
48	CACACACACACACACARG	UBC848	13
48	GTGTGTGTGTGTGTGTYG	UBC851	14
48	TCTCTCTCTCTCTCTCRT	UBC853	15
48	ACACACACACACACACYT	UBC855	16
48	ACACACACACACACACYA	UBC856	17
48	ACACACACACACACACYG	UBC857	18
48	TGTGTGTGTGTGTGTGRC	UBC859	19
41.2	ATCATGATGATGATGATG	UBC864	20

مقدار PIC در نشانگرهای UBC834 و UBC848 برابر 19/0 بود، دلیل کم بودن این مقدار در نشانگرها، ممکن است به علت نرخ جهش بالاتر در توالیهای تکراری دی نوکلئوتیدی باشد (Vigoruroux et al., 2005). در توافق با این پژوهش Srivastara et al (2007) مقدار PIC را در بررسی تنوع ژنتیکی ارقام چغندر قند بوسیله نشانگر ISSR 44/0 گزارش کردند. آنها اثبات نمودند که کارآیی نشانگر ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی چغندرقند بیشتر از نشانگرهای آیزوزایم است. مقدار PIC تابعی از تعداد و فراوانی آلل است. بیشترین میزان شاخص شانون مربوط به مکانUBC830 (32/4) که نشان دهنده تنوع جمعیتی است، بود. همچنین مکان UBC847 دارای کمترین میزان شاخص شانون (58/0) بود (جدول 4). مکانهای ژنی که میزان شاخص شانون در آنها بالاتر باشد، تنوع بین ارقام را بهتر نشان میدهند. شاخص شانون، نشاندهنده میزان چند شکلی آغازگر در مجموع ارقام است. مطابق با این پژوهش در مطالعات دیگر این آغازگرها تنوع و چند شکلی زیادی را در ژنوتیپهای دیگر چغندر قند نشان دادهاند. مثلا در بررسی ده رقم و لاین چغندرقند از هلند و چین با استفاده از شش تا از نشانگرهایISSR فوق الذکر چندشکلی بالایی مشاهده شد. آزمون لاین ها به وسیله انگشت نگاری ISSR با استفاده از شش آغازگر توانست آنها را از هم متمایز کند (Qiaohong, et al., 2012). در تحقیقی دیگر از نشانگرهای RAPD و ISSR برای مقایسه تنوع ژنتیکی 42 توده چغندرقند استفاده شد (Izzatullayeva et al., 2014). متوسط نوارهای چندشکل تشکیل شده توسط ISSR، 2/97% بود که بیشتر از نشانگر RAPD (93%) بود. میزان تنوع ژنتیکی بالایی بهوسیله هر دو نشانگر گزارش شد، که این نشان داد دو نشانگر برای شناسایی تنوع ژنتیکی در تودههای چغندرقند مناسب هستند. در مطالعه آنها دندروگرام حاصل از نشانگرهایRAPD و ISSR نشان داد که هر دو گروهبندی شباهتهایی با هم دارند Izzatullayeva et al., 2014)). در مطالعه دیگر از 20 آغازگر ISSR مشابه با نشانگرهای مورد استفاده در این پژوهش برای بررسی تنوع ژنتیکی، انگشتنگاری و انتخاب ژنوتیپهای موتانت متحمل به خشکی استفاده شد (Sen & Alikamanoglu, 2012). آنها توانستند تعدادی ژنوتیپ موتانت متحمل به خشکی را از این طریق شناسایی نمایند. علاوه بر نشانگر ISSR از سایر نشانگرها بخصوص SSR هم در بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای چغندرقند استفاده شده است که همانند مطالعه حاضر تنوع ژنتیکی وسیعی گزارش شده است(Smulders, et al. 2010; Abassi, et al. 2014; Li, et al. 2010).

دامنه ضریب تشابه بدست آمده از نشانگر ISSR در این تحقیق از 14/0 بین دو رقم مراک و آنتیک تا 93/0 بین دو رقم 32109 و 32106 متغیر بود (مشاهدات نشان داده نشدهاند). در کارهای اصلاحی ارقامی که کمترین تشابه را با هم دارند، بهترین ارقام برای کارهای اصلاحی در دورگهگیری هستند و بر عکس ارقامی که بیشترین تشابه ژنتیکی را با هم دارند برای برنامه های اصلاحی چندان مناسب نیستند. در نتیجه از بین ارقام مورد مطالعه، احتمالا رقمهای آنتیک و مراک برای تلاقی و طراحی برنامههای اصلاحی مطلوب هستند هرچند که به ویژگیهای مهم زراعی آنها هم باید توجه شود.

ضرایب تشابه ژنتیکی میان 10 ژنوتیپ در مطالعه دیگر روی چغندر قند به کمک شش آغازگر ISSR در محدوده 43/0 تا 83/0بود که بیشتر از مقادیر بدست آمده در این مطالعه می باشند (Qiaohong, et al., 2012). مسلما با توجه به مشابه بودن آغازگرها دلیل این اختلاف را می توان به ماهیت ژنوتیپهای مورد استفاده ارتباط داد یعنی تنوع مشاهده شده در ژنوتیپهای مطالعه حاضر بیشتر بوده است.

شکل 1- الگوی نواری آغازگرUBC840 در 20 ژنوتیپ چغندرقند (آگارز 5/1 درصد). چاهک اول( (M نشانگر راهنما بر اساس جفت باز و چاهکهای دیگر مربوط به ژنوتیپها میباشند.

Figure 1- The bands pattern of UBC824 primer (agarose1.5 percent) in the 20 studied sugar beet genotypes. The first column (M) is related to ladder marker (M) and the other columns are related to genotypes.

جدول 3- تعداد نوارهای تکثیر شده و چندشکل تولید شده توسط هر آغازگر

Table 3- Total and polymorphism number of bands produce with each primer.

تعداد نوار تک شکل Monomorphic number of bands	تعداد نوار چند شکل Polymorphism number of bands	تعداد کل نوار تولید شده Total number of bands	درصد نوارهای چند شکل Polymorphism bands percentage	پرایمر Primer	ردیف N.o
0	7	7	100	UBC814	1
0	7	7	100	UBC823	2
0	4	4	100	UBC824	3
0	5	5	100	UBC826	4
0	8	8	100	UBC827	5
0	11	11	100	UBC830	6
2	8	10	80	UBC834	7
1	10	11	90	UBC835	8
0	10	10	100	UBC840	9
0	7	7	100	UBC842	10
3	5	8	62	UBC845	11
7	4	11	30	UBC847	12
1	7	8	88	UBC848	13
1	7	8	88	UBC851	14
0	4	4	100	UBC853	15
0	9	9	100	UBC855	16
0	7	7	100	UBC856	17
0	7	7	100	UBC857	18
0	7	7	100	UBC864	19

جدول 4- ﺷﺎﺧﺺﻫﺎی ﺗﻨﻮع ژﻧﺘﯿﮑﯽ آغازگرهای ISSR در ژﻧﻮﺗﯿﭗهای چغندرقند

Table 4- Genetic diversity indices of ISSR markers in sugar beet genotypes.

شاخص شانون Shannon index	محتوی اطلاعات چندشکلی(PIC) Polymorphism content information	آغازگر Primer	ردیف No.
2.65	0.33	UBC814	1
2.54	0.23	UBC823	2
0.79	0.19	UBC824	3
1.36	0.13	UBC826	4
3.22	0.31	UBC827	5
4.32	0.29	UBC830	6
2.43	0.19	UBC834	7
3.74	0.27	UBC835	8
3.82	0.24	UBC840	9
2.39	0.22	UBC842	10
1.15	0.26	UBC845	11
0.58	0.13	UBC847	12
2.16	0.19	UBC848	13
2.35	0.30	UBC851	14
1.50	0.38	UBC853	15
3.98	0.32	UBC855	16
2.00	0.14	UBC856	17
2.68	0.33	UBC857	18
2.65	0.20	UBC864	19

گروهبندی ارقام براساس مشاهدات مولکولی

براساس دندروگرام حاصل از نشانگر مولکولی ISSR، 20 رقم چغندر قند در 4 گروه متفاوت قرار گرفتند (شکل 2). نتایج حاصل نشان داد که ارقام FSBI.16، 32106، 32109، 32111، 32113، 32116، 20505 F-، 32122، 32102، 32101، پارس، 32117، 32107، 32123، شیرین، کرجی و مراک در یک گروه قرار گرفتند، که در مجموع 85 درصد ژنوتیپها میباشند. در گروههای دوم، سوم و چهارم به ترتیب ارقام 32099، دوروتی و آنتیک قرار گرفتند. بعبارت دیگر از نظر نشانگرهای بکار رفته بیشترین تنوع مشاهده شده میان این سه رقم با هم و با گروه یک بوده است. بطور کلی نتایج این تحقیق نشان داد که نشانگر ISSR نشانگری کارا جهت آشکارسازی روابط مولکولی بین ارقام مورد آزمایش میباشد. به این معنی که نشانگر ISSR ابزار مهمی جهت مطالعه تنوع ژنتیکی در چغندرقند میباشد. از بررسیهای انجام شده برای گروهبندی ارقام مورد آزمایش چغندرقند میتوان چنین استنباط کرد که سطح تنوع ژنتیکی بین آنها در حد مطلوبی است. به طوری که در آینده میتوان با برنامههای اصلاحی مناسب در جهت افزایش عملکرد، کیفیت و سازگاری این گیاه در کشور گامهای اساسی برداشت. علاوه بر این، روابط مولکولی ایجاد شده از این مطالعه که نشان دهنده روابط بین ارقام چغندرقند مورد بررسی هستند، ممکن است در برنامههای اصلاحی چغندرقند مفید باشند و با دقت و توجه کافی به گروهبندیهای ایجاد شده برای ارقام موجود، به سهولت میتوان ارقام مناسب را جهت برنامههای بهنژادی انتخاب نمود. نتایج حاصل از تجزیه خوشهای براساس ضریب تشابه جاکارد نشان داد که دو رقم FBSI.16 و آنتیک از نظر ژنتیکی فاصله زیادی با هم دارند. بنابراین میتوان انتظار داشت با تلاقی بین آنها که در گروههای دور از هم قرار گرفتهاند، نتاج نوترکیب متجاوز جهت انتخاب در برنامههای اصلاحی تولید شود. چرا که یکی از راههای مطمئن برای دستیابی به هتروزیس بالا، استفاده از موادی است که دارای کمترین خویشاوندی باشند و شناسایی تلاقیهای حاوی هتروزیس بالا مهمترین قدم در تولید محصولات دورگ است و معمولاً والدین با قدرت ترکیبپذیری بالاتر و فاصله ژنتیکی بیشتر میتوانند دورگهای با عملکرد بالاتر تولید کنند.

شکل 2- گروه بندی ارقام چغندر قند براساس مشاهدات مولکولی نشانگرISSR به روش UPGMA

Figure 2- Classification of sugar beet genotypes based on ISSR markers data using UPGMA method.

نتایج حاصل از تجزیه به مولفههای اصلی

نتایج تجزیه به مولفههای اصلی نشان داد که سه مولفه اول حدود 72/82 درصد از تنوع کل بین لاینها را تبیین کردند (جدول 5). مولفه اول 67/72 درصد، مولفه دوم 99/5 درصد و مؤلفه سوم 05/4 درصد از تغییرات کل را تبیین کردند. یعنی نشانگر ISSR مورد استفاده دارای توزیع نسبتاً مناسبی در سطح ژنوم بودهاند، پراکنش ژنوتیپها در یک نمودار سه بعدی براساس سه مولفه اصلی اول، همانند گروهبندی حاصل از تجزیه خوشهای چهار گروه را معرفی کرد و توانست ارقام را تفکیک کند (شکل 3). اما با وجود شباهتهای زیاد تفاوتهایی نیز مشاهده شد. بطور مثال، ژنوتیپ آنتیک در هر دو روش در یک گروه قرار گرفت ژنوتیپ 32117 در روش مولفههای اصلی نسبت به بقیه ژنوتیپها فاصله گرفته و در گروه جداگانهای قرار گرفت. در نمودار سه بعدی ژنوتیپ 32099 با ژنوتیپهای 32123، شیرین و کرجی در یک نقطه تجمع یافتهاند، ولی در نمودار تجزیه خوشهای فقط ژنوتیپ 32099 به تنهایی در یک گروه جداگانه قرار گرفت. شایان ذکر است که کم بودن درصد تبیین تغییرات مولکولی در تجزیههای چند متغیره مانند تجزیه به مولفههای اصلی میتواند ناشی از توزیع مناسب نشانگرهای مولکولی در سراسر ژنوم و در نتیجه عدم کفایت سه مولفه اول برای توجیه حداکثر تغییرات مولکولی باشد. از طرفی توزیع مناسب نشانگرها در سراسر ژنوم به مفهوم ارزیابی دقیقتر و بهتر مولکولی به دلیل نمونهبرداری مناسب از کل ژنوم است (Fazli & HaghMyrza, 2012).

در اکثر مطالعات بررسی تنوع ژنتیکی بوسیله نشانگرهای مولکولی گروهبندی ژنوتیپها نیز صورت میگیرید. هدف اصلی در اینجا انتخاب ژنوتیپهای مناسب برای ادامه کارهای اصلاحی می باشد. در این راستا ژنوتیپهایی انتخاب می شوند که حداکثر فاصله ژنتیکی از هم داشته باشند. با توجه به اینکه مقدار هتروزیس به دو عامل یعنی غالبیت و تفاوت بین والدین بستگی دارد این روند قابل توجیه میباشد. از تجزیه خوشهای و تجزیه به مولفههای اصلی برای گروهبندی ژنوتیپهای چغندر قند بر اساس مشاهدات نشانگر ISSR در چند مطالعه استفاده شده است (Qiaohong, et al., 2012; Srivastara et al. 2007 Sen & Alikamanoglu, 2012;). همانند نتایج این پژوهش در تمامی این مطالعات نشانگرهای ISSR را ابزاری قدرتمند برای اهداف مختلف از جمله انگشتنگاری و بررسی تنوع ژنتیکی معرفی نمودهاند.

سپاسگزاری

ﻧﮕﺎرﻧﺪﮔﺎن ﻣﻘﺎﻟﻪ ﻣﺮاﺗﺐ ﺳﭙﺎﺳﮕﺰاری ﺧﻮد را از مؤسسه اصلاح و تهیه بذر چغندرقند ﺑﺪﻟﯿﻞ در اﺧﺘﯿﺎر ﮔﺬاﺷﺘﻦ ﻣﻮاد ﮔﯿﺎﻫﯽ ﺑﻌﻤﻞ ﻣﯽآورﻧﺪ.

جدول 5- مشخصات سه مؤلفه اول بر اساس مشاهدات ISSR.

Table 5- Characteristics of the first three principal components based on ISSR observations.

واریانس تجمعی Cumulative variance	واریانس جزء Proportion variance	مقادیر ویژه Eigenvalues	مولفهها Components
72.67	72.67	14.53	1
78.67	5.99	1.19	2
82.72	4.05	0.81	3

شکل 3- گروهبندی ژنوتیپهای چغندر قند بوسیله سه مولفه اول حاصل از مشاهدات نشانگر ISSR.

Figure 3- Sugar beet genotypes grouping by the first three components based on observations of ISSR markers.

منابع

Abbasi Z, Arzani A, Majidi MM (2014). Evaluation of genetic diversity of sugar beet (Beta vulgaris L.) crossing parents using agro-morphological traits and molecular markers. Journal of Agricultural Science and Technology 16: 1397-1411.

Abdmishani C, Shahnejat- Bushehri AA (1997). Advanced Plant Breeding. Volume 1. Tehran University Press, 133pp.

Askari N, Mohammad Abadi MR, Baghizadeh A (2011). ISSR markers for assessing DNA polymorphism and genetic characterization of cattle, goat and sheep populations. Iranian Journal of Biotechnology 9: 222–229.

Babajanpour AA, Nematzadeh GA, Majidi E, Ebrahimi A, Hajipour A, Hashemi SHR, Alavi SM (2009). Study of variation and genetic relationships among some rice varieties via agronomic traits and RAPD markers. Journal of Crop Breeding 1: 38-49.

Barzan Z, Dehdari M, Amiri Fahliani R (2015). Study of genetic diversity in rapeseed (Brassica napus L.) genotypes using microsatellite markers. Journal of Agricultural Biotechnology 17:29-41.

Basati J, Kolivand M, Neamati A, Zarei A (2003). Evaluation autumn sowing of sugar beet in warm regions of Kermanshah province. Sugar beet magazine 18: 130-119.

Bornet B, Goraguers F, Joly G, Branchard M (2002). Genetic diversity in European and Argentinean cultivated potatoes detected by inter- simple sequence repeats (ISSR). Genome 45: 481-484.

Botstein DR, White L, Skolnick M, Davis (1980). Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. American Journal of Humman Biology 32: 314-331.

Fazli P, HaghMyrza K (2011). Study of genetic diversity in native chickpea mass with markers ISSR. Modern Genetics 6: 104-97.

Francis CY, Cai Yang R (1999). Popgene version 1.31. A joint project development by University of Alberta and Tim Boyle, Centre for International, available at: http://ftp microsoft.com/Softlib/Mslfiles.

Ghasemi M, Baghizadeh A, Mohammadabadi MR (2010). Determination ofgenetic polymorphism in Kerman Holstein and Jersey cattle population using ISSR markers. Australian Journal of Basic Applied Science 4: 5758–5760.

Izzatullayeva V, Akparov Z, Babayeva S, Ojaghi J, Abbasov M (2014). Effciency of using RAPD and ISSR markers in evaluation of genetic diversity in sugar beet. Turkish Journal of Biology 38: 429-438.

Kantetky RV, Zhang X, Bennetzen JL, Zehr BZ (1995). Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Molecular Breeding 1:365–372.

Khajehpor, D. 2011. Industrial plants. Jihad Esfahan University. 326 p.

Li J, Schulz B, Stich B (2010). Population structure and genetic diversity in elite sugar beet germplasm investigated with SSR markers. Euphytica 175:35–42.

Murray GC, Thampson WF (1980). Rapid isolation of high molecular DNA. Nucleic Acid Resources 8: 4321-4325.

Junjian N, Colowitm PM, Mackill D (2002). Evaluation of genetic diversity in rice subspecies by microsatellite markers. Crop Science 42: 601-607.

Naderi H, Shokrpur M, Asghari AS, Kanooni H, Esfandiari AS (2015). Genetic diversity of pea lines using molecular markers ISSR. Iranian Field Crop Science 45: 519-505.

Nematzadeh GH, Talebie R, Khodarahmpour Z, Kiani GH (2003). Study of genetic and geographical variation in rice (Oryza sativa L.) using physiological and agronomical traits. Iranian Journal of Crop Science 5:225-234.

Qiaohong L, Dayou C, Lin Y, Chengfei L, Fanjiang K, Yumei W (2012). Construction of digital fingerprinting and cluster analysis using ISSR markers for sugar beet cultivars (lines). Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering 28: 280-284.

Rao LS, Usha Rani P, Deshmukh PS, Panguluri SK (2007). RAPD and ISSR fingerprinting in cultivated chickpea (Cicer arietinum L.) and its wild progenitor Cicer reticulatum Ladizinsky. Genetics Resources and Crop Evolution 54: 1235-1244.

Saghalli A, Farkhari M, Salavati A, Alamisaeid K, Abdali A (2016). Genetic diversity assessment of Milk Thistle (Silybum marianum L.) ecotypes using ISSR markers. Journal of Agricultural Biotechnology 23: 51-64.

Sen A, Alikamanoglu S. (2012). Analysis of drought-tolerant sugar beet (Beta vulgaris L.) mutants induced with gamma radiation using SDS-PAGE and ISSR markers. Mutation Research (738– 739): 38– 44.

Shahriari Ahmadi FA, Salehi M, Ghasemi Omran VA, Ramezani Moghadam MR (2012). Genetic diversity between some genotypes of cotton (Gossypium sp.) In Iranian germplasm using molecular markers between Ryzmahvarh ISSR. Iranian Journal of Crop Research 10: 680-674.

Smulders MJM, Esselink JD, Everaert I, Riek JD, Vosman B (2010). Characterization of sugar beet (Beta vulgaris L.) varieties using microsatellite markers. BMC Genetics 11: 1-11.

Srivastava S, Gupta PS, Saxena VK, Srivastava HM (2007). Genetic diversity analysis in sugarbeet (Beta vulgaris L.) using isozymes, RAPD and ISSR markers. Cytologia 72: 265–274.

Vigoruroux Y, Mitchell S, Matsuoka Y, Hamblin M, Kresovich S, Smith JSC, Jaqueth J, Smith OS, Doebley J (2005). An analysis of genetic diversity across the maize genome using microsatellite. Genetics 169: 1617-1630.

Wang M, Goldman IL (1999). Genetic distance and diversity in table beet and sugar beet accessions measured by randomly amplified polymorphic DNA. Journal of American Society and Hort Science 124:630–635.

Wu C J, Cheng Huang ZQXQ, Yin SH, Cao KM, Sun CR ( 2004). Genetic diversity among and within population of Oryza granulata from Younnan of China revealed by RAPD and ISSR markers. Implications for the endangered species. Plant Science 167: 35-42.

Zamani P, Akhondi M, Mohammadabadi MR (2015). Associations of Inter-Simple Sequence Repeat loci with predicted breeding values of body weight in Sheep. Small Ruminant Research 132: 123–127.

Zamani P, Akhondi M, Mohammadabadi MR, Saki AA, Ershadi A, Banabazi MH, Abdolmohammadi AR (2011). Genetic variation of Mehraban sheepusing two inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. African Journal of Biotechnology 10: 1812–1817.

Evaluation of genetic diversity in sugar beet (Beta vulgaris L.) genotypes using ISSR markers

Keykhosravi H.¹, Dehdari M.*², Masoumiasl A.³

¹Graduate student of plant breeding, University of Yasouj, Iran.

²Associate Professor, Faculty of Agriculture, University of Yasouj, Iran.

³Assistant Professor, Faculty of Agriculture, University of Yasouj, Iran.

Abstract

Sugar beet is one of the most important plants playing a key role in human food production in the world. Sugar beet has nutritional value as rice, corn, wheat, potato and beans. The estimation of genetic diversity of plant material is the first step for identification, conservation of genetic resources and designing of breeding programs. In order to study the genetic diversity of 20 sugar beet genotypes, 20 ISSR primers were used. After DNA extraction and PCR amplification, using ISSR primers the scores (0 and 1 for absent and present band, respectively) of resulting bands subjected to statistical analyses. Genetic diversity indices of ISSR markers in the studied sugar beet genotypes showed that UBC853 and UBC847 had the highest (0.38) and lowest (0.13) values of polymorphism information content respectively. Also UBC830 locus had the highest rate (4.32) of Shannon diversity index, which represents the genetic diversity among populations, whereas UBC847 had the lowest (0.58) Shannon index. Cluster analysis based on molecular data using Jaccard's similarity coefficient and UPGMA method, classified the sugar beet genotypes into four major groups. Based on the results of principal components analysis, the first three principal components explained 72.67, 5.99 and 4.05 percent of total (82.72%) total variation indicating ISSR markers have good distribution in the whole genome. The classification of the sugar beet genotypes based on the first principal components, had similarities and differences with cluster analysis. Results of this study can be used in breeding programs of sugar beet.

Keywords: Sugar beet, ISSR markers, genetic diversity, polymorphic information content.

* نویسنده مسئول: مسعود دهداری تلفن: 09171432037 Email: adehdari2000@yahoo.com

* Corresponding Author: Dehdari M. Tel: 09171432037 Email: : adehdari@yu.ac.ir

مراجع