بررسى بیان نسبى ژن پراکسیداز و فعالیت آنزیمى در سه گونه و رقم مرکبات در برابر باکتری عامل بلاست مرکبات Pesudomonas syringae pv. syringae

بررسى بیان نسبى ژن پراکسیداز و فعالیت آنزیمى در سه گونه و رقم مرکبات در برابر باکتری عامل بلاست مرکبات Pesudomonas syringae pv. syringae

مهسا خاکساری¹، ولی اله بابایی زاد* ²، حشمت الله رحیمیان  ³، فرید بیگی⁴

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.

^{2 و3} دانشیار و استاد دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.

⁴ استادیار موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، تهران، ایران.

تاریخ دریافت: 11/10/1395، تاریخ پذیرش: 22/04/1396

چکیده

بیماری بلاست مرکبات (Citrus blast) ازجمله بیماری­های شایع در برخی از مناطق مرکبات خیز دنیا به‌استثنای مناطق گرمسیری است که عمدتاً به‌وسیله جدایه­های Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) Van Hall 1902 ایجاد می‌شود. واکنش گیاه به آلودگی توسط عوامل بیماری­زا به‌وسیله‌ی تغییرات متابولیکی همچون، گونه­های اکسیژن فعال و ژن‌های دخیل در مقاومت القایی سیستمیک ابراز می‌شود. سطح بیان ژن پراکسیداز با استفاده ازروش Real time و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز در سه گونه و رقم مرکبات (اوکیتسو، نارنج و لایم کوآت) در بازه‌های زمانی مختلف پس از تزریق باکتری در گلخانه موردبررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد میزان بیان ژن پراکسیداز در اوکیتسو و نارنج با مقاومت بالاتری هستند در 24 ساعت بعد از آلودگی در مقایسه با لایم کوآت به میزان اوج خود رسید درحالی‌که در دورگ حساس لایم کوآت در ساعت 48 بعد از آلودگی به میزان اوج خود رسید. میزان تولید آنزیم پراکسیداز در هر سه ژنوتیپ بعد از آلودگی روند صعودی دارد و در نارنج و اوکیتسو در ساعت 48 و در لایم کوآت در ساعت 72 به بیشترین میزان خود  رسید. دو آنزیم کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز تنها در لایم کوات روند صعودی داشته است. درمجموع بیان ژن پراکسیداز و در پی آن تولید آنزیم در ارقام مقاوم (اوکیتسو و نارنج)، بالاتر از ژنوتیپ حساس (لایم کوآت) است و میزان تولید دو آنزیم کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در ارقام مقاوم کاهش و درنتیجه بیشتر شدن پراکسید هیدروژن و افزایش مقاومت را در پی دارد.

واژگان کلیدى: آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان؛ بیان ژن؛ Pseudomonas syringae pv. syringae؛ بلاست مرکبات.

مقدمه

باکتری‌های بیمارگر گیاهی، اثرات سوء بر رشد و عملکرد گیاه دارند و موجب کاهش  محصول می‌شوند (Vidhyaskaran, 2002). مکانیزم­های گیاهان آن‌ها را قادر می‌سازد که نه‌تنها در برابر استرس‌های محیطی و زخمی شدن مقاومت داشته باشند، بلکه حملات  عوامل بیماری‌زا را نیز به مدیریت خود دربیاورند. واکنش گیاهان به حمله بیمارگرها پیچیده است و القای ژن‌های دخیل در مقاومت را شامل می‌شود (Van Loon et al., 1994; Jwa et al., 2006; Stintzi et al., 1993).

یکی از مکانیسم­های گیاهان، تجمع پروتئین‌های مرتبط با بیماری‌زایی (PR Proteins) در گیاهان در پاسخ به عوامل زنده و یا استرس‌های غیرزنده در گیاهان است (Van Loon and van Strien, 1999; Sayari et al., 2016). بیماری بلاست مرکبات از جمله بیماری‌های شایع در خیلی از مناطق مرکبات خیز دنیا است که عمدتاً ‌بوسیله باکتری Pseudomonas syringae  pv. syringae Van Hall 1902 ایجاد می‌شود. گیاهان از طریق فعال کردن ژن‌های کدکننده پروتئین‌های دفاعی نسبت به بیمارگرهای باکتریایی واکنش نشان می‌دهند. توسعه مقاومت به بیماری در بسیاری از همکنش‌های گیاه-بیمارگر باکتریایی،  با تجمع پروتئین‌های القایی در گیاه مرتبط است (Van Loon et al., 2006). مقاومت اکتسابی سیستمیک (SAR)، پاسخ دفاعی است که به‌صورت موضعی در محلی که موردحمله پاتوژن قرارگرفته است و هم­چنین به‌صورت سیستمیک در بخش‌های دورتر غیر آلوده گیاهی که موردحمله پاتوژن قرارگرفته است القا می‌شود (Zhang and Klessig, 1997). سالیسیلیک اسید باعث فعال شدن مسیرSAR  می‌شود و در القای ژن‌های دفاعی نقش بسیار مهمی دارد. تجمع SA  در بافت‌های گیاهی منجر به القای مستقیم بیان ژن‌های PR به‌صورت سیستمیک و موضعی و دفاع آنزیمی در بافت‌ها است (Van Loon et al., 2006; Zhou et al., 2014). پراکسیدازها یک عضو از گروه بزرگ گلیکوپروتئین­ها هستند که واکنش بین سوبستراهای مختلف و پراکسید هیدروژن را کاتالیز می‌نماید و تقریباً در تمامی موجودات زنده موجود است (Hiraga et al., 2001). این آنزیم عضو گروه مهمی از آنزیم‌هاست که در جریان مقاومت گیاهان علیه بیمارگرهای قارچی (Christensen et al. 1992; Harrison et al., 1995; Curtis et al., 1997)، باکتریایی(Young et al., 1995; Bestwick et al., 1998)، ویروسی (Lagrimini and Rothstein, 1987; Hiraga et al., 2001) و ویروئیدی (Vera et al., 1993)  قدیمی است، القا می‌شوند و شامل سه کلاس مختلف می‌باشند (Van Loon et al., 2006; Ye et al., 1990). کلاس یک درون‌سلولی‌اند، کلاس دو توسط قارچ‌ها تولید می‌شوند، کلاس سه که ترشحی‌اند، در چرخه عملکردی معمول خود با احیا پراکسید هیدروژن سبب تنظیم سطح این ماده در گیاه می‌شوند که این عمل را با گرفتن الکترون از مولکول دهنده مختلف مانند ترکیبات فنولی، پیش سازهای لیگنین، اکسین (de Forchetti and Tigier, 1990; Lagrimini et al., 1997) و یا سوبستراهای ثانویه انجام می‌دهد (Passardi et al., 2004). این آنزیم ها از طریق لیگنینی شدن (Dean and Kolattukudy, 1976, Quiroga et al., 2000) استحکام دیواره آوند چوبی (Hilaire et al., 2001) تولید فرم های فعال اکسیژن (Mittler et al., 2004) سنتز فیتو آلکسین ها (Kristensen et al., 1999; Stoessl, 1967) و ترکیبات فنلی (Lagrimini, 1991) و فعالیت پراکسیداز در تعدادی از همکنش‌های مقاوم گیاه- باکتری افزایش می‌یابد. فعالیت پراکسیداز در برگ برنج مایه‌زنی شده با X. oryzae pv. oryzae افزایش می‌یابد (Matsuyama and Kozaka, 1981).  در تعامل سیب‌زمینی شیرین و باکتری Pectobacterium chrysanthemi نیز افزایش بیان ژن POX مشاهده‌ شد .(Jang et al., 2004) پراکسیداز در ایجاد مقاومت دخیل است، برای مثال تیمار گیاهان با سالیسیلیک اسید و یا عوامل بیوکنترل مثل Trichoderma harzianum (TH)، فعالیت دو آنزیم پراکسیداز و پلی­فنول­اکسیداز در گوجه‌فرنگی آلوده به Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici را افزایش می‌دهد(Ojha and Chandra Chaterjee, 2012).  انفجار اکسیداتیو اولین سیستم دفاعی گیاهان در برابر حمله بیمارگرها است (Rasoulnia et al., 2013; Wojtaszk, 1997). انفجار اکسیداتیو پاسخ متعارف بیمارگرهای باکتریایی بر روی گیاهان‌اند که به تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) منتج می‌شوند .(Gayoso et al., 2004) اگرچه گونه‌های اکسیژن فعال نقش مفیدی در تولید سیگنال و کمک به القای مقاومت در گیاه دارند(Peng and Kuc, 1992; Baker and Orlandi, 1995; Foyer et al., 1997). ممکن است با تأثیر روی مولکول‌های زیستی سلولی به بافت‌های گیاهی آسیب برسانند ( Mandal et al., 2004). بنابراین، یک تعادل آنزیمی منجر به حفظ موازنه تولید و مهار گونه‌های اکسیژن فعال در گیاه می‌شود .(Rasoulnia et al., 2013)

آنتی‌اکسیدانت­ها ­­‌بوسیله میکروارگانیسم‌های هوازی برای خنثی کردن اثر تنش‌های اکسیداتیو ایجادشده بوسیله گونه‌های اکسیژن فعال تولیدشده‌اند (Racchi, 2013). این آنزیم‌ها شامل سوپر اکسید دسموتاز (SOD, EC 1.15.1.1)، پراکسیدازها (POX, EC 1.11.1.7) و کاتالاز (CAT, EC 1.11.1.6) می‌باشند. سوپر اکسید دسموتاز وظیفه تبدیل رادیکال اکسیژن را به آب‌اکسیژنه دارد و محصول واکنش مورد استفاده کاتالاز و پراکسیداز قرار می‌گیرد. در بین پراکسیدازها آسکوربات پراکسیداز(APX, EC 1.11.1.11)، (پراکسیدازهایی که از آسکوربات به‌عنوان دهنده الکترون استفاده می‌کنند و به‌طور عمده در کلروپلاست، سیتوزول و پراکسی زوم تجمع داشته و وظیفه آن‌ها حذف پراکسید هیدروژن تولیدشده در این اندامک‌ها است) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX, EC 1.11.1.9)، (پراکسیدازهای دیگر در تمامی بخش‌های گیاه یافت می‌شوند و از فنول­ها به‌عنوان دهنده الکترون استفاده کرده و در بیوسنتز لیگنین نقش دارند (Diaz, 2001)، نقش مهمی در از بین بردن پراکسید هیدروژن در گیاه دارند (Apel and Hirt, 2004). آلودگی به باکتری Xanthomonas باعث تغییر فعالیت آنزیم‌های آنتی­اکسیدانتی در گوجه‌فرنگی (Chandrashekar and Umesh, 2012)، کام کوات و نارنج (kumar et al., 2011)  می‌شود.

 آنزیم‌های کاتالاز از بین برنده پراکسید هیدروژن در پراکسی زوم بوده درحالی‌که آسکوربات پراکسیداز آنزیم اصلی چرخه آسکوربات-گلوتاتیون است که در سرکوب کردن تجمع پراکسید هیدروژن در کلروپلاست، سیتوزول، پراکسی زوم و آپوپلاست نقش دارد (Shigoeka et al., 2002). مطالعات نشان داد که سالیسیلیک اسید از جاروب شدن پراکسید هیدروژن توسط آسکوربات پراکسیداز سیتوزولی ممانعت نموده و سطح پراکسید هیدروژن را در گیاه بلافاصله بعد از تیمار سالیسیلیک اسید بر روی برگ توتون افزایش می‌دهد. لذا سالیسیلیک اسید می‌تواند تجمع پراکسید هیدروژن را در طی انفجار اکسایشی که به‌وسیله آلودگی با عوامل بیماری‌زا ایجاد می‌گردد، تحریک نماید .(Dempsey et al., 1999)

جهت بررسی مولکولی و آنزیمی بلاست مرکبات، پس از آلوده سازی با باکتری Pss، استخراج RNA از سه رقم لیموترش لایم کوآت (Citrus auarantifolia)، نارنج (C. sinensis) و نارنگی اوکیتسو (C. reticulata) در زمان‌های متفاوت انجام و سپس بیان ژن پراکسیداز بررسی و میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی­اکسیدانتی اندازه‌گیری شد.

مواد و روش‌ها

تهیه و کشت باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

باکتری موردنظر از کلکسیون باکتری موجود در بخش کنترل بیولوژیک موسسه تحقیقات گیاه‌پزشکی کشور واقع در موسسه تحقیقات برنج کشور (معاونت آمل) تهیه و در محیط NAS کشت شد.

تهیه نهال

در این بررسی از سه رقم متفاوت مرکبات؛ نارنگی رقم اوکیتسو (Citrus reticulate var okitso)، گونه نارنج (Citrus aurantium) و دورگ لایم کوآت از گونه لایم (Citrus aurantifolia) یک‌ساله پیوند زده‌شده بر روی پایه نارنج استفاده شد. تمامی نهال‌ها 4 هفته قبل از انجام آزمایش‌ها سر برداری شد. نهال‌های مرکبات تحت شرایط گلخانه‌ای در درجه حرارت 25 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 65 درصد نگهداری شدند.

آزمون بیماری‌زایی

از کشت 1-2 روزه باکتری Pss در محیط کشت  NAS سوسپانسیونی با غلظت 10⁶×7 سلول (Colony-Forming Unit; CFU) در هر میلی‌لیتر تهیه گردید. غلظت سنجی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر با طول‌موج 600 نانومتر انجام شد. برای مایه‌زنی حدود 10 میکرولیتر از سوسپانسیون حاصله به روش مایه‌کوبی به‌وسیله سرنگ مخصوص انسولین به فضای میان‌برگی برگ‌های مرکبات تزریق شد. نهال‌ها، 24 ساعت قبل و بعد از مایه‌زنی گیاهان، با استفاده از کیسه‌های پلاستیکی شفاف پوشیده شدند. نمونه‌برداری در بازه‌های متفاوت انجام و در فریزر70- درجه سانتیگراد نگه‌داری شد.

استخراج RNA و زدودن DNA ژنومی از نمونه‌ها

 محتوی RNA کل از برگ‌های نمونه‌برداری شده در بازه‌های زمانی مختلف با استفاده از کیت RNXplus (شرکت سیناژن) انجام شد. به‌منظور زدودن DNA ژنومی از نمونه‌های RNA، از کیت RQ1 RNase-free DNase ساخت شرکتFermentase  طبق دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد.

 به‌منظور بررسی کیفیت RNA استخراجی از دو روش استفاده شد. نمونه‌های استخراج‌شده، با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد در بافر TAE (40mM Tris acetate, 1 mM EDTA 1X) بررسی شدند. ژل در اتیدیوم­بروماید (μg/mL5/0) به مدت 15 دقیقه رنگ‌آمیزی و بعد از شستشو با آب مقطر با UV دستگاه ژل خوان کداک از آن عکس‌برداری شد. درروش دوم درجه خلوص و غلظت نمونه‌ها در طول‌موج 260 و 280 نانومتر به‌وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی شد.

ساخت و بررسی کیفیت cDNA

ساخت cDNA توسط کیت Revert Aid First Standard cDNA (Fermentase) و بر اساس دستورالعمل، از محتوی RNA کل استخراج‌شده ساخته شد. نمونه‌ها تا زمان استفاده در 20- درجه سلسیوس نگهداری و تکثیر قطعاتcDNA  با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز و جفت آغازگر TEF انجام شد. ارزیابی محصول واکنش  PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد در بافر TBE صورت گرفت.

بررسی میزان بیان ژن‌ها به کمک روش Quantitative Real- time PCR

بیان ژن‌ها به‌وسیلهqRT-PCR ، با استفاده از کیت  Cyber Green و آغازگرهای مربوطه در دستگاه M*3000P (BioRad)  Thermal cycler انجام شد. حدود 2 میکرولیتر از cDNA رقیق‌شده (50 نانوگرم) از هر نمونه به‌عنوان الگو در واکنش‌ها استفاده شد و به ترکیب: 1 میکرو لیتر از هر آغازگر، 5/7 میکرو لیترسایبرگرین، 5/8 میکرو لیتر آب (حجم نهایی 20 میکرو لیتر) افزوده شد. پارامتر دمایی جهت تکثیر مطابق زیر است: 1. مرحله واسرشته سازی اولیه: 4 دقیقه در 95 درجه سلسیوس. 2. مرحله واسرشته سازی: 30 ثانیه در 95 درجه سلسیوس. 3. مرحله اتصال آغازگر: 30 ثانیه در دمای 60 درجه سلسیوس. 4. مرحله تکثیر: 20 ثانیه در دمای 72 درجه سلسیوس. 5. مرحله تکثیر نهایی: 5 دقیقه. در دمای 60 درجه سلسیوس و 40 مرتبه چرخش بین مراحل 2 الی  4. لیست آغازگرهای مورداستفاده در این پژوهش نیز در جدول 1 آمده است. در تمام آزمایش‌ها از ژن tef به‌عنوان ژن خانه‌دار استفاده شد. تمام واکنش‌های PCR  در 3 تکرار انجام گرفت.

تجزیه داده‌ها

 تجزیه داده‌ها با نرم‌افزار Bio-Rad cfx manager انجام شد. نرخ بیان هر ژن در این روش با استفاده از فرمول 2 ^-(ΔΔCT) محاسبه شد (and Schmittgen, 2001 Livak ).

جدول 1. جفت آغازگرها در آزمایش‌های زنجیره‌ای پلی­مراز.

Table 1. Primer pairs used in the present study and their nucleotide sequence.

بررسی فعالیت آنزیمی

روش عصاره گیری برای اندازه‌گیری میزان آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

برای تهیه 50 میلی‌لیتر بافر استخراج، 607/0 گرم تریس را با 05/0 گرم PVP در 40 میلی‌لیتر آب مقطر به‌خوبی حل کرده و سپس با اسیدکلریدریک pH محلول را به 8 تنظیم و بعد از آن محلول را به حجم نهایی 50 میلی‌لیتر رسانده شد و از آن برای عصاره گیری آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی استفاده شد. (بافر تا زمان استفاده در یخچال نگهداری شد). جهت عصاره گیری، ابتدا 5/0 گرم از پودر نمونه‌های برگی از همه بازه‌های زمانی گفته‌شده در بالا در سه تکرار نگهداری شده در فریزر 72- درجه سلسیوس در لوله‌های 5/2 میلی‌لیتری آماده، سپس 2 میلی‌لیتر بافر استخراج  به آن اضافه شد.  مخلوط حاصل را در لوله اپیندورف و به مدت 15 دقیقه با دور 13000 در دمای 4 در جهت سلسیوس سانتریفیوژ نموده و پس‌ازآن فاز بالایی جهت تعیین میزان پروتئین و فعالیت آنزیم‌ها جدا شد. برای تعیین غلظت پروتئین کل از روش برادفورد (Bradford, 1967) استفاده شد.

اندازه‌گیری محلول پراکسیداز (PRX)

برای اندازه‌گیری میزان غلظت کمی این آنزیم از روش چنس و ماهلی(Chance and Maehly) با اندکی تغییرات استفاده شد(Chance and Maehly, 1995). اندازه‌گیری بر اساس میزان اکسید شدن گایکول (Gaiacul) توسط این آنزیم انجام می‌گیرد. در این روش 33 میکرولیتر از عصاره استخراج را با یک میلی‌لیتر از محلول پراکسیداز که شامل 13 میلی مولار گوایکول، 5 میلی مولار پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و 50 میلی مولار بافر فسفات پتاسیم (8 = (PHاست مخلوط نموده و به مدت یک دقیقه با فواصل 10 ثانیه در طول‌موج nm 470 جذب آن خوانده شد. برای ساختن 100 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم، 39 میلی‌لیتر فسفات پتاسیم مونو بازیک 50 میلی مولار را با 61 میلی‌لیتر فسفات پتاسیم دی بازیک 50 میلی مولار ترکیب شد.

اندازه‌گیری محلول آسکوربات پراکسیداز (APX)

برای اندازه‌گیری میزان غلظت کمی این آنزیم از روش ناکانو و آسادا استفاده شد (Nakano and Asda, 1989). بر این اساس 50 میکرولیتر از عصاره استخراج را با یک میلی‌لیتر محلول اندازه‌گیری اسکوربیک پراکسیداز که شامل 50 میلی مول بافر فسفات پتاسیم (8=pH)، 1/0 میلی مول EDTA، 5/0 میلی مولار اسید اسکوربیک (ASA) و 15/0 میلی مولار پراکسید هیدروژن (H₂O₂) است مخلوط شد. سپس جذب آن در طول‌موج nm290 بعد از مدت یک دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. یک واحد آنزیمی اسکوربیک پراکسیداز برابر با تجزیه یک میلی مولار اسید اسکوربیک در یک دقیقه است.

اندازه‌گیری آنزیم کاتالاز (CAT)

برای اندازه‌گیری میزان غلظت کمی این آنزیم از روش دهیندزا (Dhindza, 1981) استفاده شد. بر اساس این روش 50 میکرولیتر از عصاره استخراج را با یک میلی‌لیتر محلول اندازه‌گیری کاتالاز که شامل 50 میلی مول بافر فسفات پتاسیم (7=pH) و 15 میلی مول پراکسید هیدروژن (H₂O₂) است مخلوط گردید. سپس جذب آن در طول‌موج nm240 به مدت یک دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. یک واحد آنزیمی کاتالاز برابر با تجزیه یک میلی مولار پراکسید هیدروژن (H₂O₂) در یک دقیقه است.داده‌ها در صفحه Excel مرتب و آنالیز آماری به کمک نرم‌افزار تجزیه آماری داده‌ها در سه تکرار توسط نرم‌افزار  SPSS انجام شد.

نتایج

گسترش بیماری

پس از آلوده سازی ژنوتیپ­ها، میزان توسعه بیماری مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که رقم اوکیتسو درجه بالایی از مقاومت در برابر P. syringae در مقایسه با نارنج و لایم کوآت بود. اندازه نقاط آب سوخته در اثر بیماری بلاست مرکبات در اوکیتسو تقریباً نصف دو رگ لایم کوات و  در نارنج مقاومت بینابین بود ( شکل1). آنالیز آماری (p values < 0.001) با استفاده از آزمون Tuky تفاوت مشخصی را، بین سه رقم نشان داد(Heydarinezhad et al., 2016).

سطح بیان ژن  POX

سطح بیان ژن پراکسیداز در دو رگ لایم کوات در بازه زمانی 48 ساعت بعد از آلودگی به باکتری Pss،  بیشینه بیان داشت. در گونه نارنج و رقم اوکیتسو 12 ساعت زودتر از لایم کوات، سطح بیان این ژن به اوج ‌رسید. اختلاف معناداری در سطح پنج درصد در زمان 24پس از آلودگی بین رقم اوکیتسو و نارنج و لایم کوآت وجود داشت. سطح بیان این ژن در 48 ساعت بعد از آلودگی در سطح 5 درصد بین نارنج و اوکیتسو معنادار نبوده ولی با لایم کوآت معنادار است که نشان‌دهنده حساس بودن این رقم است.  (شکل2).

فعالیت آنزیم پراکسیداز

نتایج بررسی آماری فعالیت آنزیم پراکسیداز حاکی از وجود تفاوت معنی‌دار بین ارقام حساس و مقاوم قبل از آلودگی به باکتری  Pss بود. لایم کوآت از پتانسیل کمتری در فعالیت این آنزیم برخوردار بود. روند تغییرات میزان تولید آنزیم در رقم اوکیتسو و گونه نارنج تا ساعت 48 بعد از آلودگی صعودی بوده ولی در لایم کوات سیر صعودی تا ساعت 72 و یا بیشتر حفظ شد. میزان تولید آنزیم پراکسیداز از بازه 12ساعت تا 7 روز بعد از آلودگی به باکتری Pss‌  نشان داده شد. نتایج آنالیز آماری نشان‌دهنده وجود تفاوت معنی‌دار در سطح 1 درصد بین ارقام حساس و مقاوم ازنظر میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در هر بازه زمانی پس از آلودگی بود (شکل3).

فعالیت آنزیم کاتالاز

نتایج بررسی فعالیت آنزیم کاتالاز در بررسی نشان داد هرچند تفاوت معنی‌داری در اغلب بازه‌های زمانی در بین ارقام بررسی‌شده وجود ندارد ولی سطح فعالیت آن به‌طور معنی‌داری (در سطح 1 درصد) در بازه زمانی 24 ساعت پس از آلودگی در دو رگ لایم کوات بیشتر بود (شکل4).

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز

تجزیه آماری میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز حاکی از وجود تفاوت معنی‌دار در سطح 5 درصد بین ارقام حساس و مقاوم قبل از آلودگی به باکتری   Pssبود. به‌طوری‌که رقم مقاوم اوکیتسو از پتانسیل کمی برای فعالیت این آنزیم برخوردار بود. میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز بعد از آلودگی به باکتری Pss  در دورگ حساس لایم کوآت روند صعودی داشته و  در ساعت 72 بعد از آلودگی به بیشترین مقدار خود رسید که و در سطح 1 درصد با نارنج و اوکیتسو دیگر اختلاف معنی‌داری داشت. در نارنج و اوکیتسو که مقاومت بالاتری نسبت به لایم کوآت دارند میزان آنزیم کاهش‌یافته و پایین‌ترین سطح در 24 ساعت بعد از آلودگی اتفاق افتاد (شکل5).

بحث

آنزیم‌های پراکسیداز از طریق لیگنینی شدن، استحکام دیواره آوند چوبی، تولید فرم‌های فعال اکسیژن، سنتز فیتوآلکسین­ها و ترکیبات فنولی و فعالیت مستقیم خود در مقاومت گیاه به پاتوژن نقش دارند (Gang et al., 2010).

بر اساس بررسی‌های انجام‌شده توسط محققین، پراکسیدازها می‌توانند به‌عنوان یک آنزیم بیوکنترل عمل نموده لذا پراکسید هیدروژن را در حضور سوبستراهای مختلف اکسید کنند و هم آن را تولید نمایند (Blee et al., 2001). سطح بیان بالا و زودهنگام ژن پراکسیداز پس از اعمال آلودگی در ارقام مقاوم نسبت به حساس توسط (Nagela and Heba, 2011; Sasaki et al., 2004; Heydarinezhad et al., 2016) نیز گزارش ‌شده است.

شکل 1- پیشروی علائم بیماری بلاست در برگ ارقام به ترتیب از راست به چپ لایم کوات، انگشت بودا، نارنج، پرتقال فوکوموتو، لمون فینو، نارنگی اوکیتسو.

Figure 1- Development of disease symptom in leaves of lines, from Right to left: Limequat; fingered citron; sour orange; Fukumoto navel orange; finolemon and Okitso.

شکل 2- بیان نسبی ژن پراکسیداز در لایم کوات، نارنج و اکیتسو بعد از مایه‌زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae. بیان نسبی ژن با استفاده از روش منحنی استاندارد محاسبه شد. میانگین هایی که حرف مشترک دارند از نظر آماری با استفاده از آزمون دانکن (P < 0.05) اختلاف معنی داری ندارند.

Figure 2- Relative expression levels of peroxidase gene in Limequat, sour orange and Okitso after inoculation with Pss. Relative gene expression was calculated using the standard curve method. Means followed by the same letters are not significantly different for P < 0.05 according to the Duncan’s test.

شکل 3- فعالیت آنزیم پراکسیداز در اوکیتسو، نارنج و لایم کوات در بازه‌های زمانی مختلف پس از آلودگی با Pseudomonas syringae pv. Syringae. میانگین هایی که حرف مشترک دارند از نظر آماری با استفاده از آزمون دانکن (P < 0.05) اختلاف معنی داری ندارند.

Figure 3- Peroxidase enzyme activity at different time intervals after inoculation of Limequat, sour orange and Okitso with Pseudomonas syringae  pv. syringae.  Means followed by the same letters are not significantly different for P < 0.05 according to the Duncan’s test.

شکل 4- میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در اوکیتسو، نارنج و لایم کوات در بازه‌های زمانی مختلف پس از آالودگی با Pseudomonas syringae pv syringae . میانگین هایی که حرف مشترک دارند از نظر آماری با استفاده از آزمون دانکن (P < 0.05) اختلاف معنی داری ندارند.

Figure 4- Catalase enzyme activity at different time intervals after inoculation of Limequat, sour orange and Okitso with Pseudomonas syringae  pv. syringae.  Means followed by the same letters are not significantly different for P < 0.05 according to the Duncan’s test.

شکل 5- میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در اوکیتسو، نارنج و لایم کوات در بازه‌های زمانی مختلف پس از آالودگی با Pseudomonas syringae pv syringae. میانگین هایی که حرف مشترک دارند از نظر آماری با استفاده از آزمون دانکن (P < 0.05) اختلاف معنی داری ندارند.

Figure 5- Ascorbate peroxidase enzyme activity at different time intervals after inoculation of Limequat, sour orange and Okitso with Pseudomonas syringae  pv. syringae.  Means followed by the same letters are not significantly different for P < 0.05 according to the Duncan’stest.

بیان ژن POX در نارنج و اوکیتسو در ساعات اولیه، 24 ساعت بعد از تزریق باکتری به اوج رسید (شکل1).  نتایج سایر محققین نشان داد که در چند ساعت بعد از آلودگی مقداری بیان ژن پراکسیداز در گیاه بالا می‌رود تا با تولید گونه‌های اکسیژن فعال، رسوب دادن ترکیبات فنولی و لیگنینی شدن دیواره سلولی از ورود بیمارگر جلوگیری می‌کند (Bhuiyan et al., 2009). نشان داده شد که اوج بیان آن در ساعت 24 بعد از آلودگی دیده می‌شود که با القای مرگ سلولی از پیشرفت بیماری جلوگیری می‌کند(Schweizer, 2008). در لایم کوات میزان بیان این ژن با 12 ساعت تأخیر نسبت به دو گونه و رقم دیگر در ساعت 48 به بیشینه خود رسید که می‌تواند تأییدکننده حساسیت بیشتر این دورگ نسبت به نارنج و اوکیتسو باشد. میزان بیان ژن POX در دورگ لایم کوات در ساعت 72  کاهش داشت اما در بازه 168 ساعت بعد از آلودگی، میزان بیان آن مجدداً افزایش یافت که به نظر می‌رسد به دلیل افزایش تحریک گیاه توسط باکتری بیمارگر در زمان بروز علائم است. در  گونه و ارقام مقاوم‌تر میزان بیان این ژن بعد از اوج گرفتن در ساعت 24 در ساعت 48 کاهش می‌یابد اما نسبت به رقم حساس بیان بیشتری نشان داد که می‌تواند بیانگر واکنش دفاعی موفقیت‌آمیز در این‌گونه و ارقام باشد (Liu et al., 2005).

بررسی عوامل دخیل در مرگ  سلولی نشان داده که یکی از عوامل اصلی ایجادکننده آن، ایجاد گونه‌های اکسیژن فعال است که منجر به تغییر عوامل دخیل در حفظ ترکیبات غشایی، ترکیبات ضد انجماد، آنتی‌اکسیدانت‌ها و فرایندهای متعدد دیگر می‌باشند (Cao et al., 2010). زمانی که گیاه تحت استرس قرار می‌گیرد میزان گونه‌های اکسیژن فعال افزایش می‌یابد (Polle, 2001). افزایش این مواد اگرچه از جمعیت باکتری جلوگیری می‌کند (Peng and cuk, 1992) اما به نوکلوئیک اسید، پروتئین، رنگ‌دانه‌ها و چربی خسارت وارد می‌کند (Mendel, 2001) .گیاهان برای کاهش خسارت ترکیبات اکسیژن فعال دفاع‌های آنتی‌اکسیدانتی آنزیمی یا غیر آنزیمی را فعال می‌کنند (Apel and Hirt, 2004). ازجمله این دفاع‌های آنتی‌اکسیدانتی آنزیمی می‌توان به آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و کاتالاز اشاره کرد (Liu, 2008). همچنین گزارش‌شده که پراکسیداز پس از کاتالاز در درجه دوم اهمیت در حذف پراکسید هیدروژن نقش ایفا می‌کند (Kunz et al., 2004). فعالیت آنزیم پراکسیداز (PRX) به‌عنوان پاسخ اولیه و زودهنگام در تعامل بین گیاه و بیمارگر است، به‌طوری‌که افزایش فعالیت این آنزیم با مقدار پراکسید هیدروژن گیاهان در هنگام تنش رابطه مستقیمی دارد (Sasaki et al., 2004). آلودگی برگ کام کوات به Xanthamonas axopodonis subsp. citri افزایش در میزان پراکسیداز را نشان می‌دهد (Kumar et al., 2011). آلودگی برگ لایم به Xannthomonas citri subsp. citri با افزایش در میزان آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز، پراکسیداز همراه بود (Rasoulnia, 2013). آلودگی برگ گریپ‌فروت به شانکر باکتریایی مرکبات باعث افزایش پراکسیداز و کاتالاز شد (Kumar et al., 2013).

نتایج این بررسی نشان داد میزان آنزیم پراکسیداز در رقم مقاوم اوکیتسو بیشتر از ارقام با حساسیت بیشتر نارنج و لایم است. ازآنجایی‌که بیش‌ترین میزان گونه‌های اکسیژن فعال در مراحل ابتدایی تولید می‌شود گیاهی مقاومت بالاتری خواهد داشت که در همان ساعات اولیه آنزیم بیشتری تولید کند تا از تخریب‌های گونه اکسیژن فعال جلوگیری کند. با توجه به میزان تولید آنزیم پراکسیداز در سه گونه و رقم مشاهده شد که بالاترین سطح آن برای رقم اوکیتسو و گونه نارنج، در ساعت 48 و در دورگ حساس‌تر لایم کوات در ساعت 72 است. میزان اوج بیان ژن POX نیز در رقم اوکیتسو و نارنج در ساعت 24 و در لایم کوات در ساعت 48 بود (شکل 1).  این اختلاف می‌تواند احتمالاً به دلیل تأخیر در تخریب این آنزیم در سلول باشد به‌طوری‌که علی رقم کاهش بیان ژن میزان فعالیت آنزیم در سلول در سطح بالایی باقی می‌ماند. بر اساس نتایج این مطالعه فعالیت بالای آنزیم پراکسیداز می‌تواند به دلیل نقش این آنزیم در اتصالات عرضی و سنتز لیگنین در دیواره سلولی باشد. به‌طوری‌که این گیاهان به‌منظور مقابله با نفوذ بیمارگر با بستن منافذ دیواره سلولی از طریق افزایش قطر دیواره، سطح فعالیت پراکسیدازهای خود را در سلول افزایش می‌دهند و از سویی با تولید پراکسید هیدروژن سبب القای مرگ سلولی، در صورت پیشرفت بیماری می‌گردند، تا از نفوذ و توسعه بیمارگر ممانعت نمایند. میزان آنزیم‌های آنتی اکسیدانت به‌ویژه پراکسیداز در ارقام مقاوم بیشتر از ارقام حساس است (Asthir et al., 2010). بنابراین، این نتایج بیانگر توانایی ارقام مقاوم در القای فعالیت آنزیم پراکسیداز است که با نتایج (Haetach et al., 2008; Mohamad, 2012) مبنی بر افزایش فعالیت آنزیم تحت شرایط تنش مطابقت دارد. نتایج بررسی‌های دیگر محققین نیز بیانگر افزایش فعالیت آنزیم در ارقام مقاوم و حساس پس از آلودگی در گیاهان بود (Clarke et al., 2002).

آنزیم آسکوربات پراکسیداز نقش بسیار مهمی را به‌عنوان واسطه سیگنال دهی برای فعال کردن اتفاقات پایین‌دست ازجمله بیان ژن برای ایجاد مقاومت به استرس بازی می‌نماید (Bowler  and Fluhr, 2002). نتایج این بررسی حاکی از این بود که میزان فعالیت آنزیم در دورگ حساس لایم کوآت بیشتر از گونه و ارقام با مقاومت بالاتر نارنج و اوکیتسو بود. نتایج این بررسی با نتایج (Chen et al., 2006; Rasoulnia et al., 2013; Kumar et al., 2011) مبنی بر افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در رقم حساس در آلودگی بیمارگر هم‌خوانی دارد. اخیراً گزارش‌شده است که در طی تعامل بین گیاه و بیمارگر، بیان آنزیم‌های سم‌زدای گونه‌های اکسیژن فعال مانند آسکوربات پراکسیداز سرکوب می‌گردد که این ممانعت نقش مهمی را در افزایش سطح گونه‌های اکسیژن فعال ایفا نموده و به‌موجب آن سبب القای مرگ سلولی و سایر پاسخ‌های دفاعی در طی حمله بیمارگر می‌گردد (Mittler et al., 1998). اسید سالیسیلیک تولیدشده در طی فوق حساسیت، سبب غیرفعال شدن آنزیم‌های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز می‌گردد (Chen et al., 1993 ). شواهد نشان داد که تجمع سالیسیلیک اسید در طی فوق حساسیت با ممانعت از اکسیداسیون آسکوربات سبب سرکوب نمودن فعالیتcAPX  در گیاه می‌گردند (Chen et al., 1993; Rao et al., 1997). با سرکوب نمودن بیان APX در توتون تراریخت، سبب کاهش فعالیت این آنزیم در جاروب کردن پراکسید هیدروژن موجود در سلول شده که درنهایت این عمل منجر به القای مرگ سلولی در توتون تراریخت در پاسخ به حمله باکتری P. syringae گردید. بر اساس نتایج این بررسی می‌توان استنباط کرد که گونه و ارقام مقاوم احتمالاً سبب فعال شدن مکانیسم SAR و افزایش سیگنالSA  در گیاه شده که می‌تواند منجر به سرکوب نمودن آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاه گردد. با توجه به این موضوع که کاهش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز سبب افزایش سطح پراکسید هیدروژن درون‌سلولی در گیاه شده که می‌تواند به‌عنوان پیامبر ثانویه از طریق فعال‌سازی پاسخ‌های دفاعی سبب القای PR پروتئین‌ها و پروتئین‌های دفاعی دیگر شود (Miller et al., 1999). بنابراین، گونه و ارقام مقاوم احتمالاً با به‌کارگیری این مکانیسم دفاعی سبب القای مقاومت به بلاست در مرکبات می‌شود. 

گیاه توانایی بالایی در استفاده از کاتالاز در تجزیه آب‌اکسیژنه در حمله بیمارگر دارد (Rasoulnia et al., 2013) آنزیم کاتالاز از اهمیت بالاتری نسبت به سایر آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت موجود در گیاه برخوردار‌ است (Kunz et al., 2004). این آنزیم در طی تعامل گیاه با حمله بیمارگر سرکوب می‌گردد. دو حالت مختلف برای بازدارندگی کاتالاز پیشنهادشده که در فوق حساسیت رخ می‌دهد: 1- بازدارندگی فعالیت کاتالاز به‌وسیله سالیسیلیک اسید 2- سرکوب نمودن دائمی کاتالاز در سطح mRNA (Chen et al., 1993). سرکوب نمودن کاتالاز منجر به افزایش  PCD القاشده توسط بیمارگر و القای مکانیسم‌های دفاعی در گیاه می‌گردد (Chen et al., 1993) تفاوتی در میزان بیان ژن کاتالاز در هیچ‌یک از بازه‌های زمانی به‌جز 24 ساعت پس از مایه‌زنی در ارقام متفاوت مرکبات مشاهده نشد. در این مقطع زمانی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در دو رگ حساس لایم کوآت بیشتر از رقم مقاوم‌تر نارنج و اوکیتسو بود. فعالیت بالا از کاتالاز در رقم حساس Alg-S نسبت به رقم مقاوم  Alg-Rنشان داد که افزایش فعالیت کاتالازی با افزایش فعالیت بیمارگر همراه است (Vanaker et al., 1998). بر اساس نتایج این بررسی ارقام موردبررسی از پتانسیل نسبتاً متفاوتی برای القای فعالیت آنزیم کاتالاز برخوردار می‌باشند و رقم حساس با فعالیت بالای کاتالاز در جهت کاهش پراکسید هیدروژن سبب کاهش مرگ سلولی و حمایت از باکتری بیمارگر می‌گردد. مطالعات نشان داد که آنزیم کاتالاز جاروب کننده پراکسید هیدروژن تولیدشده طی اعمال تنش در گیاه است (Chen et al., 2009). اگر چه پراکسید هیدروژن در غلطت بالا برای گیاه می‌تواند سمی باشد اما در غلظت‌های پایین می‌تواند نقش مولکول سیگنال در گیاه داشته باشد. به‌طوری‌که القای پراکسیدهیدروژن در القای مرگ سلولی و فعال‌سازی ژن‌های مرتبط با بیماری‌زایی (PRs) می‌تواند نقش مؤثری ایفا کند. میتلر و همکاران (1998) توتون تراریخت شده را برای کاهش (AS1) CAT1 با باکتری P. syringae القاکننده HR، آلوده نمودند و در گیاهان تراریختAS1، پاسخ‌های فوق حساسیت را به‌ محض آلودگی‌های باکتریایی مشاهده نمودند که نشان داد کاهش آنزیم‌های کاتالاز سبب افزایش PCD القاشده تحت حمله بیمارگر می‌گردد. همچنین در طی HR القاشده توسط بیمارگر میزان بیان ژن کاتالاز در توتون‌های تراریخت شده به‌طور معنی‌داری کاهش یافت. آلودگی دو رگ حساس لایم کوآت به Xannthomonas citri subsp. citri با افزایش در میزان محتویات کلروفیل، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز آپوپلاستی بعد از آلودگی همراه بود (Rasoulnia et al., 2013). بنابراین ارقام مقاوم با کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز پس از آلودگی سبب افزایش سطح فعالیت پراکسید هیدروژن در گیاه می‌گردند. پراکسید هیدروژن تولیدشده می‌توانند به‌عنوان یک سیگنال عمل نموده و سبب فعال‌سازی مسیر SAR در گیاه گردد و بدین ترتیب با القای پاسخ‌های مقاومتی از گیاه در برابر بیمارگر باکتریایی محافظت نمایند.

به‌طورکلی می‌توان نتیجه گرفت سطح بیان ژن‌ مورد مطالعه و میزان فعالیت آنزیمی، در مقاومت رقم اوکیتسو و نارنج دخالت دارند. ژن پراکسیداز بیان زودتری در گیاه نارنج و اوکیتسو نسبت به لایم کوات داشت که خود تأییدی برای اثبات حساس‌تر بودن رقم نارنج و لایم کوات با توجه به مشاهدات مزرعه‌ای است. در بررسی فعالیت آنزیمی، تولید پراکسیداز بیشترین میزان را در اوکیتسو و نارنج در بازه 48 ساعت بعد از آلودگی داشت ولی در لایم کوآت در زمان 72 به میزان اوج رسید که با میزان بیان ژن پراکسیداز همخوانی دارد. در آنزیم کاتالاز ، فقط در بازه زمانی 24 ساعت بعد از آلودگی در دو رگ حساس لایم کوات در مقایسه با دو ژنوتیپ مقاوم معنی‌دار بود. دو رگ لایم کوات با فعالیت بالای کاتالاز در جهت کاهش پراکسید هیدروژن سبب کاهش مرگ سلولی و حمایت از باکتری بیمارگر می‌گردد. آنزیم آسکوربات پراکسیداز همانند کاتالاز در لایم کوات بالاتر از ارقام مقاوم است که احتمالاً میزان کم این آنزیم در ارقام با مقاومت بالاتر با افزایش پراکسید هیدروژن همراه است که به‌عنوان فعال‌کننده PR پروتئین‌ها است.