تاثیر محرک متیل‌جاسمونات بر تولید آلکالوئیدهای تروپانی در ریشه‌های مویین تراریخت گیاه شابیزک (Atropa belladonna)

تاثیر محرک متیل­جاسمونات بر تولید آلکالوئیدهای تروپانی در ریشه­های مویین تراریخت گیاه شابیزک (Atropa belladonna)

مریم خردمند پروچ¹، فرج­الله شهریاری احمدی²*، نسرین مشتاقی³

¹کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده­ی کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد، ایران.

²استاد گروه بیوتکنولوژی و به­نژادی گیاهی، دانشکده­ی کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد، ایران.

³دانشیار گروه بیوتکنولوژی و به­نژادی گیاهی، دانشکده­ی کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد، ایران.

تاریخ دریافت: 02/09/1395، تاریخ پذیرش: 21/04/1396

چکیده

آلکالوییدهای پاراسمپاتیک آتروپین و اسکوپولامین در شابیزک (Atropa belladonna) تجمع می­یابند و اهمیت زیادی در صنعت داروسازی دارند. در این تحقیق، با استفاده از نژاد  A4باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز، ریشه مویین تراریخت در گیاه شابیزک تولید گردید. اثر غلظت­های مختلف متیل­جاسمونات (0، 150 و 300 میکرومولار) بر میزان تولید آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین تراریخت به مدت 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. سپس مقادیر دو آلکالویید تروپان، یعنی آتروپین و اسکوپولامین به وسیله­ی روش HPLC اندازه­گیری شد. مقدار آلکالویید­های تروپان به طور معنی­داری در ریشه­های مویین افزایش یافت. نتایج نشان داد که مقدار آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین تراریخت به ترتیب از 12/0 به 715/1 و 0195/0 به 45/0 میلی­گرم در 100 میلی­گرم وزن خشک رسید. متیل­جاسمونات به طور چشمگیری هر دو آلکالویید تروپان، آتروپین و اسکوپولامین را افزایش داد. مقدار آلکالویید­های تروپان در غلظت 300 میکرومولار از متیل­جاسمونات در مقایسه با غلظت 150 میکرومولار و نمونه­ی شاهد افزایش یافت. در نتیجه پیشنهاد می­شود که ریشه­های مویین می­توانند به جای گیاهان به منظور مطالعات بیشتر و تولید آلکالویید­های تروپان در ابعاد اقتصادی و تجاری استفاده شوند.

واژه­های کلیدی: آتروپین، اسکوپولامین، آگروباکتریوم، شابیزک، متیل­جاسمونات.

مقدمه

آلکالوییدهای تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین به عنوان ترکیبات آنتی­کلینرژیک (بازدارنده عملکرد استیل­کولین) روی سیستم اعصاب پاراسمپاتیک عمل می­کنند که منحصرا بوسیله­ی خانواده سولاناسه نظیر Atropa sp  Datura sp, Dubiosia sp,  Hyocyamus sp وsp  Scopolia تولید می­شوند (Mi Kang et al., 2004). اسکوپولامین یکی از آلکالوئیدهای اولیه تخلیص شده از منابع گیاهی است که توسط آلبرت لادنبورگ (Albert Ladenburg) در سال 1880 توصیف شد و همچنین یکی از با ارزش­ترین آلکالوئیدهای تروپانی است که تقاضای جهانی آن 10 برابر بیشتر از مجموع هیوسیامین (پیش ساز آن) و آتروپین (داروی نیمه سنتتیک) می­باشد (Moyano et al., 2003). گیاه شابیزک (Atropa belladona) متعلق به خانواده سولاناسه است ویکی از منابع اصلی تولید آلکالوئیدهای تروپانی محسوب می­شود. جنس آتروپا حاوی 4 گونه­ی Atropa acuminate Royle ،Atropa belladonna L.،baetica Wilk  Atropa Atropa pallidiflora Schönb-Tem است که درمنطقه­ی مدیترانه، جنوب اروپا و آسیا پراکنده هستند (Maqbool et al., 2014). ریشه­های مویین القا شده به وسیله­ی آگروباکتریوم رایزوژنز (Agrobacterium rhizogenes) یک روش کارآمد جهت تولید ریشه­های تراریخت فراهم می­کند که تولید و ذخیره­سازی متابولیت­های ثانویه، پروتئین­های نوترکیب و همچنین مطالعات مربوط به بیان و فعال­سازی پروموتور و ژن را امکانپذیر می­نماید (Harfi et al., 2015)، علاوه بر آن مهمترین مزیت ریشه­های مویین در توانایی آن­ها برای تولید بیشتر متابولیت­های ثانویه در مقایسه با گیاه مادری است. بسیاری از متابولیت­های ثانویه­ی با ارزش در شرایط طبیعی در ریشه تولید می­شوند و اغلب در ارتباط با تمایز ریشه هستند. در برخی موارد ممکن است متابولیت­های ثانویه فقط در بخش­های هوایی یک گیاه تولید و تجمع یابند اما با القای ریشه­های مویین و بررسی آن­ها مشخص شده است که قادر به تولید و تجمع آن متابولیت­ها هستند به عنوان مثال آرتیمیزین فقط در بخش­های هوایی گیاه annua Artemisia تولید و تجمع می­یابد در چندین بررسی مشخص شده است که ریشه­های مویین القاء شده در این گیاه قادر به تولید آرتیمیزین هستند (Kim et al., 2001). همچنین این ریشه‌ها حاوی آنزیم‌های متنوعی بوده که انواعی از فرآیندهایی نظیر گلوکوزیلاسیون و احیا را با استفاده از مواد موجود در محیط کشت به عنوان سوبسترا انجام می‌دهند. از این ویژگی برای تولید وسیع و پایدار مواد دارویی گرانقیمت با افزودن ترکیباتی با قیمت پایین‌تر به محیط کشت استفاده شده که موجب صرفه‌جویی در هزینه­ی تولید دارو شده است (Banerjee et al., 2012). در پژوهشی Norouzi et al (2016) گزارش کردند که مقدار تولید متابولیت ثانویه­ی رزمارینک­اسید در کشت ریشه­های مویین مریم گلی اصفهانی (Salvia reuterana) برابر 2/52 میلی­گرم به ازای هر گرم وزن خشک بود. همچنان که محتوای آتروپین در ریشه­های مویین تیمار شده گیاه Datura metal با نانوذرات نقره 147/1، 117/1 و 42/2 برابر در مقایسه با نمونه­های شاهد (116/0 %، 119/0% و 107/0%) به ترتیب بعد از 12، 24 و 48 ساعت از تیمار افزایش یافت (Shakeran et al., 2015). مشخص شده است که با اضافه کردن اسید جاسمونیک و مشتقات آن مانند متیل­جاسمونات به کشت سلول­های گیاهی و یا گیاهان کامل موجب تحریک تولید مقدار زیادی از متابولیت­های ثانویه می­شوند (Kuzma et al., 2009). مقدار ماده­ی ضد التهابی asiaticoside (اسیاتیکوساید) در تیمار با 1/0 میلی­مولار محرک متیل جاسمونات در محیط کشت ریشه­های مویین گیاه Centella asiatica (L.) به مدت سه هفته به مقدار زیادی (12/7 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) افزایش یافت. همچنین بیان ژن CabAS (β-amyrin synthase) در ریشه­های مویین پس از 12 ساعت تیمار با متیل­جاسمونات به طور معنی­داری متفاوت از نمونه­ی شاهد بود (Kim et al., 2007). در این تحقیق، ریشه­های مویین تراریخت از ریز­نمونه­های برگ گیاه دارویی شابیزک (Atropa belladonna) با استفاده از نژاد A4 آگروباکتریوم رایزوژنز (Agrobacterium rhizogenes) تولید شد و در بخش دیگر این تحقیق سعی شده است اثر غلظت­های مختلف محرک متیل­جاسمونات بر میزان تولید آلکالوییدهای تروپانی بررسی شود.

مواد و روش­ها

بذور گیاه شابیزک از سازمان جنگل­ ها و مراتع تهران تهیه شد. جهت رفع خواب بذر از اسید جیبرلیک[1] (ساخت شرکت کانادایی Merck) با غلظت 500 میلی­گرم در لیتر به مدت 24 ساعت استفاده شد. برای ضدعفونی بذور از الکل 70 درصد (شرکت Merck) و هیپوکلریت سدیم^[2] (ساخت شرکت ایرانی پاکسان) یک درصد به ترتیب به مدت یک دقیقه و بیست دقیقه استفاده شد و در نهایت سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذور ضد عفونی شده در محیط کشت آب-آگار کشت شده و تحت شرایط تاریکی و دمای 25درجه­ی سانتیگراد برای جوانه زنی نگهداری شدند. بذور بعد از حدود چهار روز جوانه زده و به محیط کشت MS ^[3]بدون هورمون حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز (شرکت Merck) و 8 گرم در لیتر آگار (شرکت Merck) با pH حدود 7/5 انتقال یافته و بعد از آن گیاهچه­های استریل 3 هفته‌ای بدست آمد. باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز نژاد A4 که از آزمایشگاه گروه بیوتکنولوژی و به­نژادی گیاهان زراعی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه گردید در محیط کشت مایع LB [4] کشت شده و بر روی شیکر (ساخت شرکت انگلیسی Stuart ) در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار گرفت. در مرحله­ی بعدی به منظور تلقیح، محیط کشت باکتری به فالکون­های استریل 15 میلی­لیتری منتقل و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد با 4500 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ (ساخت شرکت آلمانی Sigma) شد. نهایتاً محلول رویی بیرون ریخته شده و به آن محیط کشت مایع MS استریل اضافه شده و بلافاصله ورتکس (ساخت شرکت ایرانی MX-cell) گردید. سوسپانسیون باکتری با استفاده از سرنگ 2 میلی­لیتری به رگبرگ برگ­های استریل تزریق شد. سپس برگ­های تلقیح شده به محیط کشت جامد  B5انتقال داده شدند و به مدت 72 ساعت هم کشتی انجام شد. سپس ریز نمونه­ها با آب مقطر استریل حاوی 300 میلی­گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم (ساخت شرکت داروسازی جابرابن حیان) شستشو داده شدند و دوباره به محیط کشت جامد B5 حاوی 500 میلی­گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم انتقال یافتند. ریشه­های مویین پس از ظهور (حدود 3 هفته بعد) مدتی در محیط کشت جامد باقی ماندند تا به حد کافی از رشد برسند (حدود 2 الی 3 سانتی­متر). سپس هر کلون ریشه مویین از محل رویش روی برگ جدا شده و به محیط کشت مایع B5 14 1 2'>  با سه تکرار منتقل شدند. ارلن­ها بر روی شیکر (ساخت شرکت آلمانی Memmert) با 90 دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتیگراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند. برای تایید انتقال ناحیه­ی T-DNA­ی آگروباکتریوم رایزوژنز به ریشه­های مویین، از واکنش زنجیره­ای پلی­مراز و تکثیر یکی از ژن­های موجود در این ناحیه یعنی ژن rol­B استفاده شد. آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی که برای تکثیر قطعه­ی 779 جفت بازی ژن  rol­Bاستفاده شد شامل آغازگر رفت با توالی 5̍-ATGGATCCCAAATTGCTATTCCTTCCACGA-3̍ و آغازگر برگشتی با توالی 5̍-TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3̍ بود. شرایط واکنش زنجیره­ای پلی­مراز به این صورت انجام شد که، واسرشت اولیه­ی در دمای 95 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه و سپس 30 چرخه شامل واسرشت در 94 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 35 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 55 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 35 ثانیه و سنتز رشته­ی جدید در دمای 72 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه و بسط نهایی در 72 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد (Sedira et al., 2001). پس از یک ماه که ریشه­های مویین به حداکثر رشد خود رسیدند، جهت اعمال تیمار محرک متیل­جاسمونات (شرکت Merck) استفاده شدند. از مقادیر هم وزن از ریشه­های مویین (2 گرم) در محیط­ کشت مایعB5   14 1 2'> بدون هورمون در 3 سطح 0، 150و 300 میکرو مولار جهت اعمال محرک متیل­جاسمونات استفاده شدند. سپس روی شیکر با سرعت 90 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. 24 ساعت پس از اعمال محرک، ریشه­ها جمع آوری شده و توسط آب مقطر شستشو داده شدند و پس از انجماد خشک^[5] به منظور استخراج آلکالوئید در فریزر منفی 80 (ساخت شرکت کره­ای IIshin) نگهداری شدند. جهت استخراج آلکالوئید از ریشه­های مویین گیاه شابیزک 100 میلی­گرم از پودر ریشه­ی مویین با 30 میلی­لیتر اتانول 96 (شرکت Merck) درصد سائیده شده و به مدت 15 ساعت در شرایط رفلاکس (تقطیر برگشتی) قرار گرفتند. عصاره حاصل توسط کاغذ صافی (واتمن 1) فیلتر شده و توسط دستگاه Rotary evaporate  (شرکت ژاپنی National) خشک شد. به بقایای عصاره خشک شده، 60 میلی­لیتر مخلوط حاصل از مقادیر مساوی اسید سولفوریک (شرکت Merck) پنج درصد (v/v) و دی اتیل اتر (شرکت Merck) اضافه شد. فاز آبی جمع آوری شده و pH آن به وسیله سود (شرکت Merck) 10 نرمال تا حدود 10 بالا برده شد. به مخلوط حاصل 60 میلی­لیتر کلروفرم (شرکت Merck) در 3 مرحله اضافه شد و فاز کلروفرمی حاوی آلکالوئیدها توسط دستگاهRotary evaporate خشک شد و باقیمانده در 500 میکرولیتر متانول حل شد و جهت HPLC استفاده گردید. (et al., 2010 Ahmadian Chashmi). برای جداسازی و اندازه­گیری میزان آلکالوئیدهای تروپان از دستگاه HPLC به مدل Waters، در پژوهشکده­ی گیاهان دارویی کرج شامل ستون Teknokroma-C18 به طول 25 سانتی­متر و قطر داخلی 46/0 سانتی­متر، پمپ WATERS-600E، سرعت جریان یک میلی­لیتر در دقیقه، فاز متحرک بافر فسفات 50 میلی­مولار(pH= 3) استونیتریل (50-20) استفاده شد. در این آزمایش برای مقایسه­ی میزان آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های نرمال و تراریخت آزمون T با دو تکرار در سطح احتمال 5 درصد انجام شد و همچنین به منظور بررسی اثر غلظت­های مختلف محرک متیل­جاسمونات آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با دو تکرار انجام شد. برای محاسبات آماری از نرم افزار JMP نسخه­ی 8 استفاده شد و مقایسه­ی میانگین تیمارها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال 1 درصد انجام گردید. رسم نمودار نیز از طریق نرم­افزار 2010 Excel صورت گرفت.

نتایج و بحث

 پس از گذشت دو هفته از هم کشتی همانطور که در شکل 1 (D)، نشان داده شده علایم اولیه کالوس و ریشه­ی مویین از محل صدمه دیده ظاهر و کلون­های ریشه­ی مویین به فاصله 2 تا 4 روز ظاهر شدند. در بررسی ماهیت تراریختی ریشه­های مویین از واکنش PCR استفاده شد و محصول PCR حاصل از تکثیر این ژن­ها بر روی ژل آگارز (شرکت Merck)، اندازه قطعه­ی مورد انتظار ( شکل2) برای ژن rol­B یعنی 779 جفت بازی را نشان دادند. مقایسه­ی مقدار تولید آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین تراریخت و ریشه­های طبیعی نشان داد که تفاوت معنی­ داری از نظر تولید ماده­ی آتروپین و اسکوپولامین وجود دارد. در جداول 1و 2 مقدار آتروپین و اسکوپولامین به ترتیب در ریشه­های طبیعی برابر با 12/0 و 0195/0 میلی­گرم در 100میلی­گرم وزن خشک بود که این مقدار در ریشه­های مویین تراریخت به ترتیب به 715/1 و 43/0 میلی­گرم در 100میلی­گرم وزن خشک رسید.

شکل 1- A) گیاهچه­ی این­ویترو، B) ریز نمونه برگ، (C ریز نمونه­های تلقیح شده، D) ظهور ریشه­ی مویین، E) استقرار ریشه­های مویین در محیط مایع.

Figure 1- A) In­vitro plantlets, B) Leaf Explant, C) Inoculated explants, D) Emergencing of hairy roots E) Establishment of hairy roots in liquid medium.

بررسی تولید آلکالویید­های تروپان در ریشه­های مویین گیاه شابیزک تحت تاثیر غلظت­های مختلف متیل­جاسمونات (0، 150و 300 میکرومولار) نشان داد که تولید آتروپین و اسکوپولامین در غلظت­های 150 و 300 میکرومولار نسبت به نمونه­ی شاهد به طور چشمگیری افزایش یافت. به طوری که در حضور 150 و 300 میکرومولار متیل­جاسمونات، مقدار آتروپین این ریشه­ها به ترتیب به 39/4 و 455/5 میلی­گرم در 100میلی­گرم وزن خشک رسید که نسبت به نمونه­ی شاهد که مقدار آتروپین آن برابر 715/1 میلی­گرم در 100 میلی گرم وزن خشک بود حدود 5/1 و 1/2 افزایش یافت. همچنین میزان تولید اسکوپولامین در غلظت­های 150 و 300 میکرومولار نسبت به نمونه­ی شاهد افزایش یافت به طوری که در غلظت­های 150 و 300 میکرومولار به 26/0 و 33/0 میلی­گرم در 100 میلی گرم وزن خشک رسید که نسبت به نمونه­ی شاهد که 12/0 میلی­گرم در 100 میلی گرم وزن خشک بود به ترتیب حدود 16/1 و 75/1 افزایش داشت.

شکل 2- نتایج PCR ژن rolB آگروباکتریوم رایزوژنز، (1و8) سایز مارکر kb 1، (2) باند DNA تکثیر شده­ی آگروباکتریوم رایزوژنز (کنترل مثبت)، (3، 4و 5) باند DNA تکثیر شده از ریشه­های مویین، (6) ریشه طبیعی و (7) آب (کنترل منفی).

Figure 2- PCR analysis of rolB gene of A. rhizogenes , (1, 8) 1 kb DNA Ladder, (2) Amplified band in A. rhizogenes , (positive control), (3, 4, 5) Amplified band from the DNA of hairy roots, (6) Normal root and (7) Water (Negative control).

جدول1- مقایسه­ی میزان آتروپین در ریشه­های طبیعی و تراریخت.

Table 1- Comparison of Atropin contents in normal roots and transformed hairy roots (P ≤ 0.05).

جدول 2- مقایسه میزان اسکوپولامین در ریشه­های نرمال و تراریخت .

Table 2- Comparison of Scopolamine contents in normal roots and transformed hairy roots (P ≤ 0.05).

 اگرچه میزان آلکالویید­های تروپانی در غلظت 300 میکرومولار متیل_­جاسمونات نسبت به غلظت 150 میکرومولار افزایش می­یابد اما این تفاوت از لحاظ آماری معنی­دار نمی­باشد (شکل3). ریشه­های مویین حاصل از گیاه شابیزک (Atropa belladonna) با رشد سریع و تولید قابل اطمینان آلکالوییدهای تروپان همراه است و شهرت آن­ها به خاطر تولید بالای متابولیت­های ثانویه می­باشد (Bensaddek et al., 2000) در تحقیق حاضر نیز آلکالوییدهای تروپانی تولیدی توسط ریشه­های مویین بیشتر از ریشه­های طبیعی گیاه شابیزک است همچنین افزودن محرک­ها به محیط کشت سلول­های گیاهی از روش­های رایج برای بالا بردن متابولیسم ثانویه می­باشد. اسید جاسمونیک و مشتق فرار آن یعنی متیل­جاسمونات که جمعاً با هم جاسمونات­ها خوانده می­شوند از هورمون­های تنش گیاهی هستند که به عنوان تنظیم کنند­های پاسخ دفاعی عمل می­کنند. القاء انباشتگی متابولیت ثانویه یک پاسخ تنشی مهمی است که وابسته به جاسمونات­ها به عنوان علامت تنظیمی است (Memelink et al., 2011). در تحقیقی که بر روی تولید اسیدرزمارینک در کشت ریشه­ی مویین گیاه ریحان (Ocimum basilicum) انجام شده است، مقدار این ماده­ی آنتی اکسیدان در ریشه­های مویین تراریخت 3 برابر ریشه­های غیر تراریخت گزارش شده است (Bais et al., 2002). برجسته­ترین مثال افزایش متابولیت­های ثانویه در ریشه­های مویین تراریخت گیاه Vitis amurensis گزارش شد که منجر به افزایش 100برابری تولید ماده­ی ضدسرطان رسوراترول (resveratrol) شد (Kiselev et al., 2007). القای ریشه­ی مویین در گیاه Hyoscyamus muticus موجب تولید کلونی کالوس­زا باقابلیت تولید اسکوپولامین بالا (72/2 میلی­گرم برگرم) شد، به نحوی که این میزان برای ریشه­های مویین این گیاه چشم­گیر بود (Zolala, 2002). در تحقیقی که بر روی تولید سولاسودین در کشت ریشه­ی مویین گیاه Solanum trilobatum L انجام شد. مشاهده شد که مقدار این آلکالویید در ریشه­های مویین تراریخت به 3/3 برابر ریشه­های غیر تراریخت رسید. همچنین با اضافه کردن 4 میکرومولار محرک متیل­جاسمونات به مدت دو هفته به محیط کشت تولید این ماده نسبت به نمونه شاهد و ریشه­های غیر­تراریخت به ترتیب به 9/1 و 5/6 برابر افزایش یافت (Shilpha et al., 2015). در بررسی که به منظور مقایسه­ی تأثیر محرک­های متیل­جاسمونات، عصاره­ی مخمر و الیگوگالاکتورونیدها برانباشتگی آلکالوئیدهای لیتورین، هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین گیاه Datura stramonium انجام شد، نتیجه گرفتند که در حضور محرک متیل­جاسمونات بیش از عصاره مخمر و الیگوگالاکتورونید (متیل­جاسمونات>عصاره مخمر>الیگوگالاکتورونید) تولید آلکالوئیدهای تروپانی در ریشه­های مویین این گیاه افزایش می­یابد (Zabetaki et al., 1999).

شکل3- مقایسه میانگین میزان آتروپین و اسکوپولامین بعد از تیمار غلظت­های مختلف متیل­جاسمونات. حروف متفاوت نشان دهنده­ی تفاوت معنی-دار بین میانگین­هاست. (حروف a و b برای اسکوپولامین و حروفa′، b′ برای آتروپین).

Figure 3- The mean comparison of Atropine and Scopolamine contents after treating by different concentrations of methy­jasmonate. Different letters show significant differences between the means (P ≤ 0.01). (a and b letters for Scopolamine and a^′ and b^′ for Atropine).

جدول 3- تجزیه واریانس مربوط به آتروپین.

Table 3- Variance analysis for Atropin.

^** معنی­دار در سطح احتمال 1%.                                                                  Significant difference at 1% level respectively.

جدول 4- تجزیه­ی واریانس برای اسکوپولامین

Table 4-Variance analysis for Scopolamine.

^** معنی­دار در سطح احتمال 1%.                                                                 Significant difference at 1% level respectively.

در پژوهشی Mehrabani et al. (2013) اثرغلظت­های مختلف (0، 50، 10 و 100 میکرومولار) محرک­های اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات را بر کشت کالوس گیاه چای کوهی (Stachys lavandulifolia Vahi) به منظور افزایش فنول کل مورد بررسی قرار دادند. بیشترین میزان فنول مربوط به تیمار 10 میکرو­مولار متیل­جاسمونات، برابر 81/0 میلی­گرم اسید گالیک بر گرم وزن تر بود.محتوی تروپینون، تروپین و سودوتروپین در گیاه Datura stramonium در تیمار با ^7-10 و ^6-10 مولار متیل جاسمونات افزایش یافت (Deng,2005). بیشترین مقدار اسکوپولامین (بیش از 100% در مقایسه با نمونه شاهد) بعد از 48 ساعت و هیوسیامین (بیش از 700%) بعد از 12 ساعت در تیمار با غلظت دو میلی­مولار متیل­جاسمونات در کشت ریشه­های نابجای گیاه Scopolia parviflora بدست آمد. غلظت یک میلی­مولار متیل­جاسمونات نیز محتوای اسکوپولامین و هیوسیامین افزایش داد اما مقدار آن کمتر از غلظت دو میلی­مولار بود (Mi Kang et al., 2004). در کشت ریشه­های مویین گیاه Salvia miltiorrhiza مقدار رزمارینیک اسید و لیتوسپرمیک اسید در تیمار با 1/0 میلی­مولار محرک متیل­جاسمونات به طور چشم­گیری به ترتیب تقریبا از 25/3 به 02/6 درصد 92/2 و 3/19 درصد وزن خشک افزایش یافت (Xiao et al., 2009) تولید آرتیمیزین (Artemisinin) در ریشه­های مویین Artemisia annua L در تیمار با 2/0 میلی­مولار متیل­جاسمونات و دو میلی­گرم در میلی­لیتر عصاره مخمر به ترتیب 5/1 و 2/0 میکروگرم در میلی­گرم وزن خشک افزایش یافت (Putalun et al., 2007). در تحقیق حاضر نیز در ریشه­های مویین گیاه شابیزک تولید آتروپین و اسکوپولامین در حضور متیل جاسمونات بیشتر از تیمار شاهد است. با توجه به اینکه مقدار تولید آلکالویید­های تروپانی در ریشه­های مویین تراریخت نسبت به ریشه­های طبیعی اختلاف معنی­داری داشت و همچنین کاربرد محرک متیل­جاسمونات در این زمینه موثر بوده است می­توان نتیجه گرفت که تولید ریشه­های مویین به همراه کاربرد محرک­ها برای تولید متابولیت­های با ارزش از جمله آلکالوییدهای تروپانی در ابعاد وسیع قابل توجه می­ باشد.