همسانه سازی و بیان ژﻥ پیلین باکتری Xanthomonas citri subsp. citri

همسانه سازی و بیان ژﻥ پیلین باکتری Xanthomonas citri subsp. citri

حمیده رئیسی¹، محمدرضا صفرنژاد*²، سید مهدی علوی³، سید علی الهی نیا⁴، ناصر فرخی⁵

¹ دانشجوی دکتری بیماری‏شناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران.

² دانشیار بخش ﻭﻳﺮﻭﺱ ﺷﻨﺎﺳﻲ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﻴﻘﺎﺕ ﮔﻴﺎﻩ ﭘﺰﺷﻜﻲ ﻛﺸﻮﺭ، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی ایران، ﺗﻬﺮﺍﻥ، ایران.

³ استادیار بخش ﺑﻴﻮﺗﻜﻨﻮﻟﻮژﻱ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﭘﮋﻭﻫﺸﮕﺎﻩ ﻣﻠﻲ ﻣﻬﻨﺪﺳﻲ ژﻧﺘﻴﻚ ﻭ ﺯﻳﺴﺖ ﻓﻦ ﺁﻭﺭﻱ، ﺗﻬﺮﺍن، ایران.

⁴ استاد گروه بیماری‏شناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران.

⁵ استادیار گروه علوم و زیست فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ شهید بهشتی،تهران، ایران.

تاریخ دریافت: 16/08/1396، تاریخ پذیرش: 23/10/1396

چکیده

 بیماری شانکر باکتریایی مرکبات توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می­شود. سیستم ترشحی نوع سه این باکتری دارای یک ساختار خارج سلولی رشته‏ای است که پروتئین­های باکتریایی را به داخل سلول گیاه وارد می­کند. پروتئین پیلین (HrpE) جزء اصلی تشکیل دهنده پیلوس می باشد که توسط ژن HrpE کد می‏شود. تولید پادتن اختصاصی علیه پروتئین پیلین می‏تواند به منظور شناسایی گیاهان آلوده و همچنین به عنوان منبع ژنتیکی مقاومت علیه بیماری مورد استفاده قرار گیرد. غیر‏فعال‏سازی پروتئین HrpE با استفاده از پادتن می‏‏تواند منجر به سرکوب بیماری در گیاه شود. هدف از این تحقیق جداسازی و بیان ژن HrpE و خالص‏سازی پروتئین حاصل از آن بود. برای این منظور، قطعه ژنی HrpE با استفاده از آغازگرهای اختصاصی جدا و در ناقل pTZ57R/T همسانه‏سازی شد. بیان این ژن به‏صورت نوترکیب در ناقل pET28a(+) و در سویه Rosetta باکتری Escherchia coli انجام شد. بهینه‏سازی تولید پروتئین نوترکیب تحت تاثیر زمان‏های مختلف، دمای نگهداری و همچنین غلظت‏های مختلف القا‏کننده مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 30 درجه سلسیوس و طی زمان 16 ساعت و با IPTG یک میلی‏مولار به‏دست آمد. خالص‏سازی پروتئین نوترکیب HrpE با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. نتایج آزمون‏های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از پادتن‏های اختصاصی، صحت بیان و خالص‏سازی پروتئین نوترکیب پیلین را مورد تایید قرار دادند. پروتئین نوترکیب تولید شده می‏تواند به عنوان آنتی‏ژن برای تولید پادتن‏های تخصصی تک همسانه‏ای و چند همسانه‏ای مورد استفاده قرار گیرد.

کلمات کلیدی: شانکر باکتریایی مرکبات، پروتئین نوترکیب، سیستم ترشحی تیپ 3، ژن HrpE، پیلوس.

مقدمه

مرکبات، از محصولات باغی استراتژیک ایران است که مقام اول را در بین تولیدات باغی کشور با سطح زیرکشت 268 هزار هکتار و 3/4 میلیون تن تولید در سال دارد (Ebrahimi, 2009). با توجه به سطح زیر کشت مرکبات، سهم ایران 7/3 درصد از تولید مرکبات جهان می‏باشد که این میزان تولید باعث شده است ایران رتبه هفتم تولید مرکبات در جهان را به خود اختصاص دهد (FAO, 2014).

شانکر باکتریایی مرکبات از بیماری­های مهم مرکبات است که توسط باکتریXanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می­شود (Shaad et al., 2006). لیموترش از میزبان­های این باکتری در جنوب ایران است (Khodakaramian et al., 1999). بیماری شانکر مرکبات اولین بار در اواخر قرن نوزده در ژاپن دیده شد و شرح آن توسط Clara Hasse (1915) پس از ورود به آمریکا نوشته شد (Shaad et al., 2005; Schoulties et al., 1987). در ایران بیماری شانکر مرکبات اولین بار در سال 1369 توسط علیزاده و رحیمیان در کهنوج گزارش شد (Alizadeh and Rahimian, 1990).

عامل شانکر مرکبات دارای پاتوتیپ‏های مختلفی (پاتوتیپ A، A^* و A^w) است که روی گونه­های مرکبات بیماری‏زا هستند. پاتوتیپ A انتشار جهانی داشته و به خاطر قدرت تهاجم زیاد و دامنه میزبانی وسیع بیشترین توجه را به خود اختصاص داده‌است. پاتوتیپ­های A^* و A^w از نظر دامنه میزبانی محدود بوده ولی از نظر نوع علائم مشابه پاتوتیپ A هستند. فرم آسیایی (A^*) این بیماری در ایران روی میوه لیموترش گزارش شده است (Roohani et al., 2012). شانکر آسیایی مرکبات روی ارقام حساس منجر به ریزش برگ، سرخشکیدگی شاخه، ریزش زود هنگام میوه، کاهش بازارپسندی و کاهش قیمت میوه می‌شود (Gottwald et al., 2002; Graham et al., 2004; Duan et al., 1999).

معمولا بیماری‏زایی در باکتری‏ها تحت تاثیر ژن‌های کنترل­کننده بیماری‌زایی می‏باشد که در کلاسترهای بزرگ ژنی قرار دارند. با بررسی توالی کلاسترهای ژنی در انواع مختلف باکتری‌ها، شباهت‌های زیادی بین این نواحی و ژن‌های دخیل در شکل­گیری تاژک دیده می‏شود. ژن‌های دخیل در سیستم‌ ترشح پروتئین نوع سه از جمله نواحی بسیار محافظت شده می­باشند که نقش مهمی در فرآیند بیماری‏زایی در باکتری‏های بیماری‏زای گیاهی دارند و باعث انتقال فاکتورهای بیماری‏زایی به درون سلول‏های گیاهی می‏شود (Cornelis et al., 2000; Mokhtari et al., 2015). در سیستم ترشحی نوع سه، انتقال پروتئین‏های افکتور به درون سلول گیاهی توسط یک ساختار سرنگی شکل تحت عنوان اینجکتوزوم صورت می‏پذیرد. بخش خارج‌سلولی اینجکتوزوم عمدتا شامل پیلوس است که به‏صورت میله­ای نازک و طویل قادر به نفوذ در دیواره سلولی متخلخل گیاه است (Koebnik, 2005). جز اصلی پیلوس، پروتئین پیلین HrpE است که به وسیله­ی قطعه ژنی HrpE کد می­شود (Buttner and Yang, 2009). این قطعه ژنی 282 نوکلئوتید دارد و موتاسیون در آن سبب عدم تشکیل پیلوس و عدم ایجاد بیماری یا واکنش فوق حساسیت (HR) می‌شود. بنابراین تشکیل پیلوس در برهم‌کنش‌های تحت کنترل گیاه- باکتری ضروری است (Weber et al., 2005).

در میان راهبرد­های مورد استفاده در جهت مدیریت بیماری، تولید رقم مقاوم جز موثرترین روش‏های پیش‏گیری بیماری می‏باشد. دستیابی به منابع مقاومت ژنتیکی از راه‏کارهای مهم در تولید ارقام مقاوم به بیماری است (Safarnejad et al., 2011). در تولید ارقام مقاوم علاوه بر غربال­گری منابع ژنتیکی مقاومت موجود، می‏توان از پادتن‏های اختصاصی بر علیه پروتئین­های ضروری پاتوژن استفاده کرد (Swarup et al., 1992). بر این اساس پروتئین HrpE با توجه به وظیفه اصلی که در ایجاد بیماری دارد، می‏‏تواند به عنوان گزینه‏ای مناسب در ایجاد مقاومت بکار گرفته شود. بیان هترولوگ پروتئین نوترکیب ﺩﺭ ﻣﻄﺎﻟﻌﺎﺕ ﻣﺮﺑﻮﻁ ﺑﻪ ﺑﺮﺭﺳﻲ ﻧﻘﺶ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﻭ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺁﻧﺘﻲ‏بادی‏های اختصاصی می‏تواند در این مسیر راه­گشا باشد (Ariannejad et al., 2012). بنابراین هدف از اجرای تحقیق حاضر، جداسازی و بیان ژن HrpE، خالص‏سازی و تولید انبوه پروتئین ژن مذکور بوده است. از پروتئین نوترکیب تولید شده میتوان در پژوهش­های بعدی به منظور تولید پادتن تک همسانه‏ای اختصاصی برای ایجاد مقاومت به بیمارگر با ایجاد گیاهان تراریخته استفاده نمود.

مواد و روش‏ها

سویه‏های باکتری و وکتور

 سویه 88 باکتریX. citri subsp. citri باکتری E. coli DH5α و پلاسمید pET28a (تهیه شده از کلکسیون پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری) مورد استفاده قرار گرفتند.

استخراج DNA باکتری

 باکتری در 10 میلی لیتر محیط مایع LB[1] به مدت 16 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجه سلیسیوس و 150 دور در دقیقه کشت شد. به منظور استخراج DNA باکتری از کیت استخراج (Bioneer, Daejeon, South Korea) مطابق دستورالعمل مربوطه استفاده شد. کیفیت DNAی استخراجی با استفاده از ژل آگارز یک درصد مورد بررسی قرار گرفت.

تکثیر به روش واکنش زنجیره­ای پلیمراز

 جهت جداسازی ژن HrpE، ابتدا آغازگر اختصاصی ژن مربوطه با استفاده از منابع بانک اطلاعاتی NCBI طراحی شد و به منظور تسهیل در فرآیند همسانه‏سازی در وکتور بیانی، قطعات سایت برشی مربوط به آنزیم‏های برشی Xho1/Sal1 در نواحی '5 آغازگرهای پیش‏رو و پس‏رو وارد شد. واکنش PCR در حجم 15 میکرولیتر انجام شد، که شامل 5/1 میکرولیتر بافرPCR (X10) ، 7/0 میکرولیتر کلرید منیزیم 50 میلی‏مولار، 3/0 میکرولیتر dNTP با غلظت 10 میلی‏مولار، یک میکرولیتر از هرکدام از آغازگرهای پیش‏رو و پس‏رو (آغازگر پیــش‏رو '3-TAAAATGTCGACAAATGGAATTATTACCG-'5 و آغازگر پـس‏رو '3-TAAAATCTCGAATTACTGGCCAACGGCTG-'5)، یک میکرولیتر  DNA الگو با غلظت 10 نانوگرم و 2/0 میکرولیتر آنزیمDNA Polymerase  Taq (Fermentas, Pittsburgh PA, USA) بود.

واکنش زنجیره­ای پلیمراز با پنج دقیقه در دمای 94 درجه سلسیوس، 40 سیکل شامل (یک دقیقه در دمای 94 درجه سلسیوس، یک دقیقه در در دمای 60 درجه سلسیوس، 45 ثانیه در دمای 72 درجه سلیسیوس) ده دقیقه در دمای 72 درجه سلسیوس انجام شد. بعد از انجام PCR محصول واکنش به وسیله­ی روش الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد جداسازی شد. باند مورد نظر از روی ژل با استفاده از کیت استخراج از ژل و طبق دستور العمل شرکت مربوطه (Bioneer, Daejeon, South Korea) خالص‏سازی شد.

همسانه‏سازی در وکتور PTZ57R/T

 پس از تأیید محصول PCR بر روی ژل آگارز، قطعه تکثیر شده ژن HrpE در ناقل PTZ57R/T به روش T/A کلونینگ و همسانه‏سازی طبق دستورالعمل شرکت سازنده (InsTAcloneTM PCR Cloning Kit, Fermentas, Vilnius, Lithuania) انجام شد. تأیید همسانه‏سازی، به روش تعیین ترادف توسط آغازگرهای یونیورسال (T7 promoter) توسط شرکت فزاپژوه (تهران، ایران) انجام شد. استخراج پلاسمید بر مبنای کیت (Roche, Mannheim, Germany) و طبق دستورالعمل شرکت مربوطه صورت گرفت.

همسانه‏سازی در وکتور بیانی (+) pET28a

 انتقال قطعه ژنی HrpE به پلاسمید بیانی (+) pET28a به‏صورت زیر انجام شد. برای این منظور سازه‏های pTZ57R/T-HrpE و (+) pET28a به‏صورت جداگانه با آنزیم برشی Xho1/Sal1 برش داده شدند. پس از جداسازی، قطعه مربوطه از روی ژل آگارز خالص‏سازی و الحاق قطعه ژنی HrpE در ناحیه پایینی توالی تکرار شش­تایی هیستیدین ناقل بیانی با استفاده از واکنش آنزیمیT4 DNA ligase صورت پذیرفت و سازه pET28a-HrpE به روش شوک حرارتی به سویه E.coli DH5α وارد شد (Sambrook et al., 1996).

بررسی بیان پروتئین نوترکیب

 جهت بررسی بیان ژن تولیدکننده پیلوس در میزبان باکتریایی، بیان ژن در شرایط مختلف دمایی و تحت غلظت‏های مختلف 5/0 و یک میلی­مولار IPTG و در زمان‏های 3، 6 و 16 ساعت مورد بررسی قرار گرفت (Sadeghi et al., 2011). به منظور ارزیابی میزان بیان ژن HrpE در باکتری در حالات مختلف بیانی، از روش SDS-PAGE استفاده شد. برای این منظور ژل پلی اکریل آمید 12% مورد استفاده قرار گرفت و در نهایت به روش کوماسی بلو رنگ­آمیزی شد (Surendran et al., 2015).

خالص‏سازی پروتئین نوترکیب

 خالص‏سازی پروتئین نوترکیب پس از بهینه‏سازی شرایط بیان و تحت شرایط طبیعی با استفاده از ستون آگارز حاوی یون‏های نیکل صورت پذیرفت. برای این منظور، ابتدا کلنی باکتری E.coli سویه Rosetta حاوی سازه pET28a-HrpE در محیط کشت مایع LB حاوی آنتی‏بیوتیک کانامیسین (50 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 3-2 ساعت کشت شد تا جذب نوری (OD 600nm) آن به 4/0 برسد. به منظور القاء باکتری برای تولید پروتئین نوترکیب، IPTG با غلظت نهایی یک میلی‏مولار اضافه شد و محیط کشت به مدت 16 ساعت در دمای 30 درجه ‏سلسیوس و در انکوباتور با250 دور در دقیقه قرار داده شد. پس از گذشت زمان مورد نظر، جداسازی سلول‏های باکتریایی با انجام سانتریفیوژ در 4000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه انجام شد. رسوب به‏صورت شبانه در 20- درجه سلسیوس نگهداری شد. معلق‏سازی رسوب با استفاده از بافر لیزکننده صورت گرفت و تخریب دیواره سلولی باکتری با استفاده از امواج صوتی اولتراسونیک با توان 200 وات به تعداد هفت دوره 10 ثانیه ای با فواصل میانی 10 ثانیه، بر روی یخ صورت گرفت. سلول‏های تخریب شده به مدت 30 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال دار با دمای 4 درجه ‏سلسیوس و با دور 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و محلول رویی جهت استفاده در ستون دارای رزین نیکل (Ni²⁺) جداسازی شد. با توجه به اینکه قطعه ژنی کلون شده در انتهای آمینی خود دارای دنباله شش تایی هیستیدین [2] است، پروتئین بیان شده HrpE همراه با این دنباله است و می‏‏توان آن را توسط کروماتوگرافی و با استفاده از ستون دارای رزین نیکل (Ni²⁺) تخلیص کرد ( Shahryari et al., 2013). تأیید مرحله بیان و خالص‏سازی پروتئین توسط ژل پلی‏اکریل‏آمید و همچنین آزمون وسترن بلاتینگ انجام شد (Ausubel et al., 1995). به‏منظور ردیابی پروتئین نوترکیب متصل به His-tag از پادتن اولیه anti His-tag و سپس پادتن ثانویه GAM^AP استفاده شد. ظهور باندهای اختصاصی مربوط به پروتئین نوترکیب متصل به ترادف شش تایی هیستیدین با افزودن سوبسترای نیتروبلوتترازولیوم [3](BCIP/NBT) صورت پذیرفت.

نتایج و بحث

با توجه به نقش حیاتی و مهمی که پیلوس در پروسه‏ی بیماری شانکر دارد، جداسازی و تکثیر قطعه ژن کدکننده زیر واحد‏های این ملکول انجام شد. پس از استخراج DNA از کلنی‏های رشدیافته، واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن HrpE انجام شد. باند مربوط به ژن تکثیر شده بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. نتایج حاصله حاکی از جداسازی و تکثیر قطعه‏ای در حدود 282 جفت باز بود. اندازه‏ی قطعه از طریق مقایسه با مارکر ملکولی استاندارد تائید شد (شکل1- الف).

قطعه ژنی تکثیر یافته ﻣﺮﺑﻮﻃﻪ ﺍﺯ ﺭﻭﻱ ژﻝ ﺁﮔﺎﺭﻭﺯ ﺟﺪﺍﺳﺎﺯﻱ ﻭ ﺩﺭ ﻧﺎﻗﻞ pTZ57R/T ﻫﻤﺴﺎﻧﻪ‏ﺳﺎﺯﻱ شد. ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮﺭ ﺑﺮﺭﺳﻲ ﺻﺤﺖ ﻓﺮﺍﻳﻨﺪ همسانه‏سازی، تعیین ترادف انجام و مورد تأیید قرار گرفت. همترازی ترادف مذکور با توالی­های موجود در بانک اطلاعاتی ژن NCBI، حاکی از وجود تشابه بسیار بالا (100-95 درصد) ﺩﺭ ﺗﺮﺍﺩﻑ ﺍﻳﻦ ﻗﻄﻌﻪ ژﻧﻲ ﺩﺭ ﺳﻮﻳﻪ‏ﻫﺎ ﻭ ﻳﺎ ﺣﺘﻲ ﮔﻮﻧﻪ‏ﻫﺎﻱ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺯﺍﻧﺘاﻣﻮﻧﺎﺱ بود. ﺍﻳﻦ ﺗﺸﺎﺑﻪ ﺑﻪ ﺩﻟﻴﻞ ﺍﻫﻤﻴﺖ ﻭﺟﻮﺩ ﺳﺎﺧﺘﺎﺭ ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ﺷﺪﻩ ﺍﻳﻦ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺑﺮﺍﻱ ﺍﻳﻔﺎﻱ ﻧﻘﺶ ﺍﺳﺎﺳﻲ ﺁﻥ ﺩﺭ ﻓﺮﺍﻳﻨﺪ انتقال ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺍﻓﻜﺘﻮﺭ و ﺑﻴﻤﺎﺭﻱ‏ﺯﺍﻳﻲ ﻣﻲ‏باشد (Shiotani et al., 2007;  Nino-Liu et al., 2006).

انتقال قطعه ژنی HrpE به ناقل بیانی pET28a(+) با انجام واکنش هضم آنزیمی (شکل1- ب) و الحاق مجدد توسط آنزیم T4 صورت پذیرفت. ناقل بیانی pET28a(+) به منظور تولید پروتئین نوترکیب در ﻣﻴﺰﺑﺎﻥ ﺑﺎﻛﺘﺮﻳﺎﻳﻲ ﻣﻮﺭﺩ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﻗﺮﺍﺭ گرفت. ﺍﻳﻦ ﭘﻼﺳﻤﻴﺪ ﺩﺍﺭﺍﻱ ﺗﺮﺍﺩﻑ‏ﻫﺎﻱ ﻛﺪ ﻛﻨﻨﺪﻩ ﺩﻧﺒﺎﻟﻪ هیستیدین ﻣﻲ‏ﺑﺎﺷﺪ، وجود این ترادف باعث تسهیل فرآیند خالص‏سازی پروتئین نوترکیب با استفاده از ﺳﺘﻮﻥ ﺁﮔﺎﺭﻭﺯ ﺣﺎﻭﻱ ﺫﺭﺍﺕ ﻧﻴﻜﻞ می­شود (Berlec et al., 2006). تأیید فرآیند همسانه‏سازی با انجام آزمون‏های کلنی PCR و هضم آنزیمی مجدد صورت پذیرفت.

پس از انتقال پلاسمید نوترکیب pET28a-HrpE به سویه بیانی Rosetta باکتری E.coli، تولید پروتئین توسط IPTG بررسی شد. در طی مراحل مختلف بیان و خالص‏سازی پروتئین، ﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎﻳﻲ ﺑﺮﺩﺍﺷﺖ شدﻩ ﻭ ﺍﻳﻦ ﺭﻭﻧﺪ ﺑﺎ ﺍﻧﺠﺎﻡ ﺍﻟﻜﺘﺮﻭﻓﻮﺭﺯ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل2- الف). با توجه به نتایج پروتئین در وزنی حدود 26 کیلو دالتون مشاهده شد که مطابق با وزن پیش‏بینی شده بود. نتایج مربوطه نشان داد که بهترین زمان القاء توسط IPTG برای بالاترین میزان بیان پروتئین، 16 ساعت و غلظت یک میلی مولار از IPTG بود.

در خصوص تولید پروتئین HrpE در E.coli به نظر می‏‏رسد که با توجه به تشابه نوع ﻣﻴﺰﺑﺎﻥ ﻛﻪ ﻫﺮ ﺩﻭ ﭘﺮﻭﻛﺎﺭﻳﻮت هستند، ﻣﺸﻜﻞ ﺧﺎﺻﻲ ﺩﺭ ﺑﻴﺎﻥ ژﻥ ﻣﺮﺑﻮﻃﻪ ﺍﻳﺠﺎﺩ ﻧشد.

شکل 1- الف:تکثیر ژن HrpE به کمک واکنش PCR و مشاهده آن بر روی ژل آگارز یک درصد. چاهک 1: مارکر (DNA Ladder Mix) ، چاهک2: ژن HrpE با طول تقریبی حدود 300 جفت باز. ب: هضم آنزیمی به منظور جداسازی قطعه ژنی HrpE از پلاسمید pTZ57R/T دارای این قطعه ژنی. چاهک 1: مارکر (DNA Ladder Mix) ؛ چاهک 2 و3: واکنش هضم آنزیمی پلاسمید pET28a؛ چاهک 4 و5: واکنش هضم آنزیمی پلاسمید pTZ57R/T دارای قطعه ژنی HrpE و جداسازی قطعه HrpE.

Figure 1- A: Amplification of HrpE gene and its PCR product on 1% (w/v) agarose gel Lane 1: DNA Ladder Mix, lane 2: HrpE gene with length around 300 bp. B: Isolation of HrpE gene from pTZ57R/T- HrpE by double digestion of construct (Lane 1: DNA Ladder Mix, lane 2,3: double digestion of pET28a, lane 4,5: Double digestion of pTZ57R/T-pthA for isolation of HrpE gene.

بنابراین، با توجه به نقش حیاتی این ﻗﺴﻤﺖ ﺍﺯ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺩﺭ ﻓﺮآﻳﻨﺪ ﺑﻴﻤﺎﺭﻱ‏ﺯﺍﻳﻲ، ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻭ ﺧﺎﻟﺺ ﺳﺎﺯﻱ ﺍﻳﻦ ﻗﺴﻤﺖ ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮﺭ ﺗﻬﻴﻪ ﺁﻧﺘﻲ‏ﺑﺎﺩﻱ‏ﻫﺎﻱ ﺍﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ﺻﻮﺭﺕ ﭘﺬﻳﺮﻓﺖ.

ﭘﺲ ﺍﺯ ﺗﺨﺮﻳﺐ ﺳﻠﻮﻝﻫﺎﻱ ﺑﺎﻛﺘﺮﻱ ﻭ ﺁﺯﺍﺩﺳﺎﺯﻱ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦﻫﺎﻱ ﺳﻠﻮﻟﻲ، ﺟﺪﺍﺳﺎﺯﻱ ﻭ ﺧﺎﻟﺺ‏ﺳﺎﺯﻱ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ ﻣﺘﺼﻞ ﺑﻪ ﺩﻧﺒﺎﻟﻪ ﻫﻴﺴﺘﻴﺪﻳﻦ ﺑﺎ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﺳﺘﻮﻥ ﺁﮔﺎﺭﻭﺯ ﺣﺎﻭﻱ ﺫﺭﺍﺕ ﻧﻴﻜﻞ ﺻﻮﺭﺕ ﭘﺬﻳﺮﻓﺖ. ﻧﺘﺎﻳﺞ ﺑﻴﺎﻥ ﻭ ﺧﺎﻟﺺسازی ﺣﺎﻛﻲ ﺍﺯ ﺑﻴﺎﻥ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ HrpE ﺩﺭ ﻣﻴﺰﺑﺎﻥ ﺑﺎﻛﺘﺮﻳﺎﻳﻲ ﻭ ﺧﻠﻮﺹ ﺑﺎﻻﻱ ﺁﻥ ﺩﺭ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺧﺎﻟﺺ ﺷﺪﻩ است (شکل2- ب).

ﺑﺎ ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﺑﺎﻧﺪ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺧﺎﻟﺺ ﺑﺎ ﺑﺎﻧﺪﻫﺎﻱ ﻣﻮﺟﻮﺩ ﺩﺭ ﻧﺸﺎﻧﮕﺮ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ، ﻭﺯﻥ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ نوترکیب در حدود 26 کیلو دالتون تعیین شد که از این مقدار 2/23 مربوط به پروتئین اصلی و مابقی مربوط به دنباله متصل به پروتئین ناشی از پلاسمید بیانی است.

نتایج ردیابی پروتئین نوترکیب با استفاده از پادتن علیه His-tag در مجاورت کنترل منفی و با روش وسترن بلاتینگ، نشان داد که پروتئین نوترکیب HrpE با موفقیت تولید و تخلیص شد (شکل 3).

بیان ژن هترولوگوس در باکتری رایج‌ترین سیستم بیانی استفاده شده برای تولید سطح بالایی از پروتئین‏های نوترکیب برای امور تحقیقاتی و تجاری می‏باشد. E. coli متداول ترین میزبانی است که برای بیان بسیاری از پروتئین­های نوترکیب استفاده می‏شود. از جمله مزایایی این سیستم بیانی تکثیر سریع، میزان بالای بیان پروتئین نوترکیب و قدرت

بالا جهت پذیرش ژن‏های بیگانه می­باشد (Rosano & Ceccarelli, 2014; Ariannejad et al., 2012).

این سیستم‏ها تولید انبوه پروتئین متصل به دنباله هیستیدین و خالص سازی آن به وسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی در شرایط طبیعی را تسهیل می‏‏کنند (Berlec et al., 2005; Fu et al., 2007). موارد متعددی از استفاده از این سیستم جهت بیان ژن‏های خارجی در میزبان باکتریایی برای تولید پروتئین نوترکیب گزارش شده است (Perrie et al., 2008; Khatabi et al., 2012; Safarpur et al., 2012; Shahryari  et al., 2013; Thaitrong et al., 2013).

در این تحقیق جهت تولید پروتئین نوترکیب از سازه‏های pET28a-HrpE استفاده شد که تحت کنترل پروموتر قدرتمند T7 بوده و تولید پروتئین با غلظت بالا در این سیستم صورت می‏پذیرد (Nanni et al., 2013). بیان ژن در سازه‏های مورد نظر در سویهRosseta  باکتری E. coli صورت پذیرفت. بیان انواع پروتئین‏ها در سویه Rosseta به دلیل داشتن tRNA های برای کدون‏های نادر امکان پذیر است و در نتیجه این سویه دارای توانایی تولید پروتئین نوترکیب با کارایی و میزان بیان بالاتر نسبت به سایر سویه‏های بیانی مانند سویه BL21 است (Tegel et al.,  2010; Rosano & Ceccarelli, 2014).

در این تحقیق برای اولین بار ژن HrpE از سویه ایجاد کننده فرم A^* بیماریی شانکر مرکبات جداسازی، بیان و خالص‏سازی گردید. سیستم تخلیص پروتئین نشان دهنده خلوص بالای پروتئین بود که در صورت استفاده از پروتئین به عنوان آنتی ژن از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است، زیرا از مراحل کلیدی در طراحی روش‏های تشخیص بیماری­های گیاهی، تخلیص آنتی‏ژن است. پروتئین‏های ضروری در بیماری‏زایی عامل بیمارگر از گزینه‏هایی هستند که به عنوان آنتی‏ژن‏های ایمنی‏زا و محافظتی شناخته شده‏اند. از آنتی‏ژن خالص‏سازی شده می‏توان در تولید آنتی‏بادی علیه بیمارگر در گیاه استفاده کرد.

شکل 2- الف: بررسی بیان ژن HrpE در شرایط مختلف القایی بر روی ژل SDS-PAGE (چاهک 1: نمونه قبل از القاء؛ چاهک 2: میزان بیان سه ساعت پس از القا با IPTG 1 میلی مولار؛ چاهک 3: نشانگر پروتئینی 1170 کیلو دالتون؛ چاهک 4: بیان شش ساعت پس از القا با IPTG 1 میلی مولار؛ چاهک 5: بیان 16 ساعت پس از القا با IPTG 5/0 میلی مولار؛ چاهک 6: بیان 16ساعت پس از القا با IPTG 1 میلی مولار). ب: ﺧﺎﻟﺺﺳﺎﺯﻱ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺍﻓﻜﺘﻮﺭ ﺑﻪ ﺻﻮﺭﺕ ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ ﻣﺘﺼﻞ ﺑﻪ ﺩﻧﺒﺎﻟﻪ ﺷﺶ‏ﺗﺎﻳﻲ ﻫﻴﺴﺘﻴﺪﻳﻦ ﺑﺮ روی ستون نیکل (چاهک 1: نمونه قبل از القا با IPTG؛ چاهک 2: نمونه بعد از القا با IPTG یک میلی مولار؛ چاهک 3: مرحله شستشو؛ چاهک 4، 5، 6 ،7 و 9: پروتئین تخلیص شده HrpE با وزن 27 کیلو دالتون؛ چاهک 8: نشانگر وزن ملکولی پروتئین).

Figure 2- A: SDS-PAGE analysis  of HrpE expression in different IPTG concentrations and induction period. Proteins were analyzed by (Lane 1: uninduced cells, lane 2: 3 h post induction at 1 mM IPTG, Lane 3: 170 kDa protein marker; lane 4: 6 h post induction at 1 mM IPTG, Lane 5: 16 hpost induction at 0.5 mM IPTG, Lane 6: 16 h post induction by 1 mM IPTG). B: Purification of efector protein as fussed to 6×-His tag on nickel column (Lane 1: uninduced cells by IPTG, Lane 2: induction by 1 mM IPTG, Lane 3: washing stage , Lane 4, 5, 6,7 and 9: Purified HrpE protein with molecular weight around 27 kDa, Lane 8: protein molecular ladder).

شکل 3- آزمون وسترن بلات با استفاده از پادتن اختصاصی دنباله هیستیدین (چاهک1، 2 و 4: بیان قطعه ژنی HrpE بعد القا با IPTG 1 میلی مولار؛ چاهک 3: نشانگر پروتئینی؛ چاهک 5: نمونه قبل از افزودن IPTG).

Figure 3- Western analysis by applying anti his-tag antibody (Lane 1, 2 and 4: HrpE expression after induction by 1 mM IPTG, lane 3: prestained marker, Lane 5: non-induced cells by IPTG).

      با توجه به این که بیان آنتی­بادی در گیاه یک ابزار قوی برای سرکوب بیمارگر­های گیاهی است، تولید و بیان پادتن علیه پروتئین‏های ضروری بیمارگر و انتقال قطعات پادتن تولید شده به گیاه روش مناسبی جهت بیان پادتن در گیاه و در نتیجه سرکوب بیماری است (Le Gall et al, 1998; Fischer et al., 2001; Huang et al., 2011; Shahryari  et al., 2013). در نتیجه با توجه به دارا بودن خصوصیت آنتی­ژنی پروتئین نوترکیب HrpE تولیدی، می­توان از طریق پادتن تک همسانه‏ای نوترکیب (recombinant monoclonal antibodies) بر علیه این پروتئین، مانع از تشکیل پیلوس شد و در نتیجه مانع انتقال افکتور پروتیئن به داخل سیتوسل سلول گیاهی و ایجاد بیماری شد که این هدف به منظور ایجاد مقاومت بر علیه بیماری با استراتژی مقاومت وابسته به پلنتی‏بادی مورد استفاده قرار می‏گیرد.