بهینه­­سازی کالوس­زایی و باززایی گیاه خیار (Cucumis Sativus L.) با استفاده از ریزنمونه­های کوتیلدون، هیپوکوتیل و برگ

مریم عبدلی نسب¹*

¹استادیار گروه بیوتکنولوژی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم، تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان. کرمان، ایران.

تاریخ دریافت: 28/09/1396، تاریخ پذیرش: 01/03/1397

چکیده

رقم سوپرنیا خیار یکی از ارقام مهم هیبرید وارداتی با عملکرد  بالا می­باشد. به منظور بهینه کردن تکثیر غیرجنسی این رقم از طریق کشت درون شیشه‌ای، ریزنمونه­های مختلف کوتیلدون، هیپوکوتیل و برگ در محیط پایه موراشیگ و اسکوگ MS)) تحت أثر غلظت‌های صفر، 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 میلی‌گرم در لیتر هورمون 1- نفتالن استیک اسید (NAA) در ترکیب با غلظت‌های 1، 2، 3 و 4 میلی‌گرم در لیتر هورمون 6- بنزیل آمینوپورین (BAP) قرار گرفت. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار و تعداد پنج ریزنمونه در هر تکرار انجام گردید. درصد کالوس­زایی، درصد کالوس­های رویان­زا و فراوانی تولید نوساقه در ریزنمونه­های کشت شده مورد ارزیابی قرار گرفت. بیشترین میزان کالوس­زایی (6/86 درصد) در ریزنمونه کوتیلدون در تیمار هورمونی 3/0 میلی‌گرم در لیتر NAA به همراه 3 میلی‌گرم در لیتر BAP، بیشترین درصد کالوس­های رویان­زا (6/61 درصد) در ریزنمونه هیپوکوتیل در تیمار هورمونی 2/0 میلی‌گرم در لیترNAA  به همراه 2 میلی‌گرم در لیتر BAP و بیشترین تعداد نوساقه (08/20) در ریزنمونه کوتیلدون در تیمار هورمونی 3/0 میلی‌گرم در لیتر NAA به همراه 3 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده گردید. نوساقه­های باززا شده جهت القا و تشکیل ریشه­ به محیط MS ½ حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر هورمون NAA منتقل و سپس گیاهچه­های رشدیافته به محیط خارج آزمایشگاه سازگار گردیدند. بر اساس نتایج این مطالعه، استفاده از ریزنمونه کوتیلدون جهت ریزازدیادی و باززایی این ژنوتیپ به­خصوص در مطالعات انتقال ژن توصیه می­گردد.

واژه‌های کلیدی: ریزازدیادی، کشت درون شیشه‌ای، خیار، NAA، BAP.

مقدمه

کدوئیان[1] یکی از مهمترین خانواده‌های گیاهی (Rajagopalan et al., 2005) و هندوانه، کدو، خربزه و خیار چهار محصول اقتصادی مهم این خانواده می‌باشند (Lebeda et al., 2007). خیار (Cucumis Sativus) به عنوان یکی از محصولات مهم این خانواده، اولین گیاه اهلی شده آسیای مرکزی(2013) Abu-Romman et al.  و چهارمین محصول سبزی مهم در جهان بعد از گوجه فرنگی، کلم و پیاز می‌باشد (Lv et al., 2011). این سبزی با وجودی که دارای مقادیر ناچیزی انرژی، مواد معدنی و پروتئین است، به دلیل وجود مواد معطر و مؤثر و اثرات مفیدی که در تغذیه دارد از زمان‌های بسیار قدیم مورد توجه مردمان و اقوام دیارهای مختلف از جمله هندوستان، مصر و یونان بوده‌ است (Milnear, 2000). از چالش­های مطرح در تکثیر این گیاه، دستیابی و فراهم آوردن بذور یکنواخت هیبرید با عمکرد بالا می‌باشد که حدود 30 درصد هزینه تولید این محصول را در بر می‌گیرد (Ugandhar et al., 2011). استفاده از روش‌های تکثیر غیرجنسی به دلیل انتقال صفات گیاهان مادری به طور کامل به نسل بعد جهت تکثیر گیاهان مطلوب مورد انتخاب موردتوجه است. از مهم‌ترین روش‌های تکثیر غیرجنسی گیاه خیار، بالاخص جهت تکثیر گیاهان هیبرید مطلوب و قطع وابستگی به واردات بذور هیبرید، روش تکثیر درون شیشه‌ای[2] است (Ahmad & Anis, 2005). افزون بر این، استفاده از روش‌های کشت بافت و پرورش ریزنمونه گیاهان در محیط کشت مصنوعی، جهت انجام مطالعات بیوتکنولوژی مانند انتقال ژن و دستکاری‌های ژنتیکی Jesmin & Mian   (2016)و دستیابی به تنوع سوماکلونال Jeyakumar & Kamaraj   (2015)اجتناب ناپذیر است. یافتن رقم، نوع ریزنمونه و ترکیب محیط کشت که منجر به بهترین عملکرد در شرایط کشت بافت شود در ریزازدیادی گیاه خیار بسیار حائز اهمیت است (Abu-Romman et al., 2013). مطالعات نشان می‌دهد برهمکنش هورمون‌های گیاهی به­ویژه اکسین و سیتوکنین نقش مهمی در موفقیت باززایی ریزنمونه­ها در شرایط کشت بافت دارند (Custers & Verstappen, 1989). در بررسی اثر هورمون‌های 2,4,D، هورمون 1- نفتالن استیک اسید[3] (NAA)، 6- بنزیل آمینوپورین[4] (BAP) و کینتین[5] (KIN) بر باززایی ریزنمونه کوتیلدونی تعدادی رقم خیار، بیشترین درصد کالوس­زایی در تیمار هورمونی BAP µM 5 + 2,4,D µM 5/0 و بیشترین میزان تولید نوساقه در تیمار هورمونی BAP µM 5 + NAA µM 5/0 گزارش گردید (Kim et al., 2011). در بررسی غلظت‌های مختلف هورمون‌های BAP، KIN، IAA+BAP و IAA+KIN  در بازززایی ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل گیاه خیار، بیشترین درصد تولید نوساقه در تیمار هورمونی IAA mg/L 5/0 +BAP  mg/L 3 مشاهده گردید (Ugandhar et al., 2011). در مطالعه دیگری، بازززایی ریزنمونه گره گیاه خیار رقم دستگردی تحت اثر غلظت‌های مختلف IBA به همراه  KIN مورد بررسی قرار گرفته و بیشترین درصد باززایی در تیمار KIN  mg/L5/1 و بیشترین طول نوساقه در تیمار IBA mg/L 025/0+ KIN mg/L 1 گزارش گردید (Otroshy & Mokhtari, 2014). Hassan Pour et al. (1996) ضمن مقایسه روش‌های جنین‌زایی رویشی، اندام­زایی و کشت تک جوانه در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ Murashige &    Skoog (1962) به همراه هورمون‌های NAA و KIN، روش کشت تک جوانه را برای تکثیر سریع خیار پیشنهاد نمود. .Khoshbakht et al (1995) گزارش کرد ریزنمونه جوانه‌های جانبی خیار رقم طاها و نبیل در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ[6] MS)) حاوی NAA mg/L 1/0 + KIN mg/L 1/0 ریشه‌دار شده و تولید گیاهچه می‌نمایند، ضمن اینکه رقم طاها نسبت به رقم نبیل عکس‌العمل بهتری نشان می‌دهد. Hajibabaei et al. (2010) در بررسی اثر هورمون‌های NAA، BAP و GA₃ در غلظت‌های مختلف بر مراحل پرآوری شاخه و ریشه‌زایی خیار گلخانه‌ای رقم سلطانی از ریزنمونه های جوانه جانبی و جوانه انتهایی استفاده نمودند. نتایج نشان داد در ریزنمونه جوانه جانبی، حداکثر تعداد گره، طول شاخه و طول ریشه و حداقل قطر کالوس تحتانی در محیط کشت فاقد هورمون، حداکثر تعداد ریشه در محیط کشت دارای NAA و حداکثر وزن تر شاخساره در محیط کشت فاقد هورمون و محیط حاویGA₃  mg/L 5/0به دست آمد. در باززایی از ریزنمونه جوانه انتهایی، حداکثر تعداد گره در محیط کشت فاقد  GA₃با و یا بدون BAP و همچنین محیط کشت دارای  BAPوGA₃  mg/L 5/0 حاصل گردید. همچنین در بررسی تاثیر اندازه ریزنمونه­های میانگره، جوانه انتهایی و همچنین شرایط کشت در باززایی گیاه خیار، مشخص گردید ریزنمونه­های بزرگ‌تر و با زاویه کشت مناسب و همچنین ظروف کشت با امکان هوادهی بهتر تاثیر مثبتی در باززایی این گیاه دارند (Custers & Verstappen, 1989). علیرغم گزارشات متعدد از کشت درون شیشه ای گیاه خیار، فراوانی باززایی ریزنمونه­ها بسیار پایین می باشد. مطالعات دقیق­تر نشان می­دهد که موفقیت باززایی از ریزنمونه­­های مختلف این گیاه به میزان زیادی به نوع ژنوتیپ وابسته است (Wehner & Locy, 1981; Kim et al., 2011; Abu-Romman et al., 2013). رقم سوپرنیا (گریفاتون)، رقم زودرس، مقاوم به ویروس موزاییک خیار و ویروس موزاییک خربزه، یکی از ارقام پر محصول وارداتی خیار می‌باشد. با توجه به اهمیت کشت درون شیشه­ای خیار در ازدیاد ارقام پر محصول، در این مطالعه اثر ترکیبات هورمونی NAA و BAP که از پرکاربردترین هورمون‌های اکسین و سیتوکینین می‌باشند، بر کالوس­زایی و باززایی ریزنمونه های مختلف رقم سوپرنیا بررسی می‌گردد تا ضمن تعیین بهترین محیط هورمونی در تقابل با ریزنمونه، شرایط تکثیر آن در شرایط کشت بافت فراهم گردد. به طوری که مشکلات تولید و تکثیر این گیاه به شیوه مرسوم را حل نموده و ضمن تولید گیاهانی با کیفیت بالا و عاری ازعوامل بیماریزا، با تولید انبوه آن با هزینه­ای پایین، از خروج ارز از کشور جهت واردات سالانه بذور هیبرید این رقم پر محصول نیز جلوگیری گردد. همچنین با بهینه­سازی تولید کالوس از ریزنمونه­های مختلف می­توان از آن در جهت برنامه­هایی مانند انتقال ژن و کشت پروتوپلاست استفاده کرد.

مواد و روش­ها

بذور خیار رقم تجاری سوپرنیا از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. بذور به مدت 2 ساعت تحت آب روان قرار گرفته و سپس ﺑـﻪ ﺻـﻮرت ﺳـﻄﺤﻲ ﺑـﺎ ﻫﻴﭙﻮﻛﻠﺮﻳﺖ ﺳﺪﻳﻢ 5 درصد ﺑﻪ ﻣﺪت 15 دﻗﻴﻘﻪ ضدعفونی شدند. بعد از خشک کردن بذور بر روی کاغذ صافی استریل، به محیط جوانه­­زنی MS حاوی 30 گرم در لیتر ساکاروز و 7 گرم در لیتر آگار ﻣﻨﺘﻘﻞﺷـﺪﻧﺪ. ﺑـﺬور ﻛﺸـﺖ ﺷـﺪه، ﺑـﺮ روی ﻣﺤﻴﻂ ﺟﻮاﻧﻪ­­زنی در دﻣﺎی2±25 درﺟﻪ سانتی­گراد ﺑﻪ ﻣﺪت 10 روز ﺗﺤﺖ رژﻳﻢ ﻧﻮری 16 ساعت روشنایی و 8  ساعت تاریکی قرار گرفتند.

ریزنمونه­های هیپوکوتیل، کوتیلدون و برگ جهت باززایی مورد استفاده قرار گرفتند. سه روز پس از کشت، بذور جوانه ‌زدند. پس از گذشت 6 روز از زمان جوانه­زنی بذور، کوتیلدون‌ها به صورت انحنادار از محل اتصال به ساقه به نحوی جدا شدند که هیچ بخشی از جوانه همراه آن نباشد. ریزنمونه­های کوتیلدونی به قطعات mm²5×5 و هیپوکوتیل به قطعات  mm8-6 تقسیم شدند. برگ‌ گیاهچه­های 16 روزه برداشت و به قطعات mm²5×5 تقسیم گردید. ریزنمونه­ها در محیط کشت MS حاوی غلظت‌های مختلف هورمونی NAA و BAP (Duchefa, Netherland) (جدول 1) کشت شدند. این آزمایش با 20 ترکیب هورمونی و سه ریزنمونه به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و تعداد پنج ریزنمونه در هر تکرار اجرا گردید. سپس نمونه‌ها در اتاق رشد با دمای حدود2±24 درجه سانتی­گراد با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی تحت نور فلورسنت سفید نگهداری شده و هر سه هفته یک‌بار واکشت گردیدند.

فراوانی کالوس تولید شده با شمارش تعداد ریزنمونه­هایی که کالوس تولید کردند به تعداد ریزنمونه اولیه به صورت درصد محاسبه گردید. حجم کالوس بر مبنای میزان سطحی که توسط کالوس پوشیده شده بر اساس شاخص هوکر و نی برزHooker & Nabors  (1977) تعیین و درصد کالوس­های رویان­زا در مقایسه با سطح کالوس اولیه به­دست آمد. فراوانی نوساقه­ها، با محاسبه میانگین تعداد نوساقه تولید شده در هر تیمار هورمونی به تعداد کل نوساقه­ها  به­دست آمد. تجزیه واریانس داده‌ها و مقایسه میانگین بر اساس روش استیودنت- نیومن- کلز[7] به کمک نرم افزارV. 9.2  SAS انجام گرفت. قبل از انجام تجزیه واریانس، تست نرمالیته توزیع اشتباهات آزمایشی با محاسبه چولگی[8]، کشیدگی[9] داده­ها و آزمون­های کلموگروف-اسمیرنوف[10]، شاپیرو ویلک[11] و اندرسون دارلینگ[12] به کمک نرم افزار V. 9.2 SAS انجام و در صورت لزوم تبدیل داده انجام گرفت.

جهت ریشه­دار کردن نوساقه های تولید شده،  محیط کشت MS ½ حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر هورمون NAA استفاده گردید. پس از ریشه‌زایی، جهت سازگاری گیاهان با شرایط خارج آزمایشگاه، پس از حذف محیط کشت و شستشو ملایم ریشه­ها، گیاهان ابتدا به پرلیت استریل منتقل و به منظور حفظ رطوبت با سرپوش شفاف پوشانده شدند. پس از یک هفته، سرپوش حذف و گیاهان به گلدان حاوی یک سوم خاک مزرعه، یک سوم ماسه شسته و یک سوم خاکبرگ منتقل گردیدند.

نتایج و بحث

بذور سه روز پس از کشت در محیط MS، جوانه زده و شروع به رشد کردند. کالوس­زایی، ده روز پس از قرار گرفتن ریزنمونه­ها بر روی محیط حاوی غلظت‌های مختلف هورمونی شروع شد. پس از دو دور واکشت کالوس­ها بر روی محیط هورمونی، نوساقه­ها القا گردیدند (شکل1، 2 و 3). نوساقه­های رشد یافته جهت ریشه دهی به محیط ½ MS حاوی هورمون NAA منتقل شدند (شکل4).

نتایج تجزیه واریانس داده­ها  در مورد درصد کالوس­زایی، درصد کالوس­های رویان­زا و تعداد نوساقه در محیط کشت MS دارای غلظت­های مختلف هورمونی نشان داد که از لحاظ صفت کالوس­زایی در سطح احتمال 5% بین اثر متقابل ریزنمونه­های مختلف با تیمارهای هورمونی NAA وBAP  استفاده شده اختلاف معنی­دار وجود دارد. در بررسی درصد کالوس­های رویان­زا و تعداد نوساقه، اثر متقابل ریزنمونه و هورمون NAA در سطح احتمال 5% و مابقی در سطح احتمال 1% اختلاف معنی دار نشان دادند (جدول2).

به منظور برآورد بهتر اثرات عوامل هورمونی مورد مطالعه، مقایسه میانگین داده‌ها برای "درصد کالوس­زایی"، "درصد کالوس­های رویان­زا" و "فراوانی نوساقه" به روش استیودنت-نیومن-کلز انجام گرفت (جدول 3). بیشترین درصد کالوس­زایی هورمونیNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (3 میلی‌گرم در لیتر) مشاهده گردید.

در ریزنمونه هیپوکوتیل بیشترین درصد با میانگین 6/86 درصد در ریزنمونه کوتیلدون در تیمار کالوس­زایی در تیمار هورمونیNAA  (4/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (1 میلی‌گرم در لیتر) با میانگین 70 درصد و در ریزنمونه برگ با میانگین 33/58 درصد در تیمار هورمونیNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (1 میلی‌گرم در لیتر) مشاهده گردید. در بررسی اثر تیمارهای هورمونی استفاده شده بر روی رویان­زایی کالوس­ها، بیشترین درصد کالوس­های رویان­زا با میانگین 6/61 درصد در ریزنمونه هیپوکوتیل در تیمار هورمونیNAA  (2/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراه  BAP (2 میلی‌گرم در لیتر) مشاهده گردید. در ریزنمونه کوتیلدون، بیشترین درصد در تیمار هورمونیNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراه BAP (4 میلی‌گرم در لیتر) با میانگین 3/54 درصد و در ریزنمونه برگ با میانگین 55 درصد در تیمار هورمونیNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (3 میلی‌گرم در لیتر) مشاهده گردید. اثر تیمارهای هورمونی استفاده شده بر روی باززایی نشان داد که بیشترین تعداد نوساقه با میانگین 08/20 در ریزنمونه کوتیلدون در تیمار هورمونیNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (3 میلی‌گرم در لیتر) مشاهده گردید. در ریزنمونه هیپوکوتیل بیشترین میزان در تیمار هورمونیNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (2 میلی‌گرم در لیتر) با میانگین 5/3 و در ریزنمونه برگ با میانگین 76/3 درصد در تیمار هورمونیNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) وBAP  (3 میلی‌گرم در لیتر) مشاهده گردید.

این گیاهچه­ها پس از سازگاری­ در اتاق رشد فیتوترون برای سازگار شدن به  محیط طبیعی، به گلخانه منتقل شدند. حدود 95 درصد از گیاهچه­های تولید شده در شرایط کشت بافت مورد اشاره، در شرایط گلخانه نیز زنده ماندند و رشد مطلوبی از خود نشان دادند.

شکل1- مراحل مختلف باززایی گیاه خیار از ریزنمونه کوتیلدون بر روی محیط کشت MS به همراه غلظت­های مختلف هورمون­های NAA و BAP a: کشت بذور در شرایط درون شیشه­ای جهت تهیه ریزنمونه b: کشت قطعات ریزنمونه کوتیلدون در محیط کشت MS حاوی غلظت­های مختلف هورمون­های NAA و BAP، c: کالوس­دهی ریزنمونه کوتیلدون d: تشکیل نوساقه­ پنج هفته پس از کشت ریزنمونه بر روی محیط.

Fig1: Different stages of cucumber plant regeneration from cotyledon explant on the MS medium supplemented with different concentrations of NAA and BAP hormones a: The seed cultivation in vitro condition to prepare explant b: The culturing of the cotyledon explant segments on the MS medium containing different concentrations of NAA and BAP hormones c: The callus production from the cotyledon explant d: The shoot formation after five weeks of explant culture on the medium.

شکل2- مراحل مختلف باززایی گیاه خیار از ریزنمونه هیپوکوتیل بر روی محیط کشت MS به همراه غلظت های مختلف هورمون­های NAA و BAP e: تشکیل کالوس ­از قطعات ریزنمونه هیپوکوتیل کشت شده بر روی محیط کشت MS حاوی غلظت­های مختلف هورمون­های NAA و BAP f: کالوس­های رویان­زا حاصل از قطعات هیپوکوتیل کشت شده g: تشکیل نوساقه بر روی قطعات هیپوکوتیل کشت شده.

Fig2: Different stages of cucumber plant regeneration from hypocotyl explant on the MS medium supplemented with different concentrations of NAA and BAP hormones. e: The callus production of the hypocotyl explant segments on the MS medium containing different concentrations of NAA and BAP hormones f: The embryonic calli derived of hypocotyl explant segments g: The shoot formation on the cultured hypocotyl fragments.

شکل3-: مراحل مختلف باززایی گیاه خیار از ریزنمونه برگ بر روی محیط کشت MS همراه با غلظت­های مختلف هورمون­های NAA و BAP h: کشت قطعات ریزنمونه برگ در محیط کشت MS حاوی غلظت های مختلف هورمون­های NAA و BAP i: تشکیل کالوس بر روی قطعات برگی کشت شده بر روی محیط j: باززایی قطعات برگی کشت شده.

Fig.3: Different stages of cucumber plant regeneration from hypocotyl explant on the MS medium supplemented with different concentrations of NAA and BAP hormones. h: The culturing of the leaf explant segments on the MS medium containing different concentrations of NAA and BAP hormones i: The callus production from the cultured leaf explant segments on the mediumj: The regeneration of cultured leaf segments.

شکل4- القای ریشه­زایی در نوساقه­های رشد یافته و سازگاری گیاهچه­ها به شرایط برون شیشه­ای :k تشکیل ریشه­ در نوساقه­های انتقال یافته به محیط کشت MS حاوی هورمون اکسین، l: گیاه کامل رشد یافته در شرایط درون شیشه، :m سازگاری گیاهان حاصل از باززایی به شرایط برون شیشه.

Fig.4: Root induction of the grown shoots and adaptation of seedlings to the in vivo conditions. k: Root formation in the transferred shoots to the MS medium containing auxin hormone, l: Full grown plant in vitro condition, m: Adaption of the regenerated plants to in vivo.  

جدول1- غلظت­های مختلف هورمون­های NAA وBAP  جهت کالوس­زایی و باززایی ریزنمونه­های کوتیلدون، هیپوکوتیل و برگ گیاه خیار.

Table 1- Different cocentrations of NAA and BAP hormones for callogenesis and regeneration of cotyledon, hypocotyl and leaf explants in cucumber.

کاربرد بیوتکنولوژی در اصلاح گیاهان به میزان زیادی به القای کالوس و به دنبال آن باززایی گیاه وابسته است (Murphy, 2003). القای کالوس و سپس باززایی مزیت بیشتری نسبت به باززایی مستقیم در انتقال ژن دارد از آنجا که انتخاب مؤثر کالوس­ها منجر به دستیابی به ترانس­ژن های مطلوب می‌گردد (2007 Radhakrishnan et al., ). القای کالوس موفق تحت تاثیر نوع ریزنمونه و شرایط کشت بافت می‌باشد (Ozgen et al., 1998). گونه­های مختلف خانواده کدوییان در ریزازدیادی رفتار متفاوتی دارند، این تفاوت به میزان زیادی تحت تاثیر فاکتورهای مختلف از جمله، نوع ژنوتیپ، ترکیبات محیط کشت به­خصوص نوع و غلظت هورمون­ها، شرایط فیزیکی رشد مانند نور، دما و رطوبت می­باشد (Kathal et al., 1988). اکسین­ها و سیتوکنین­ها از معمول‌ترین هورمون‌های گیاهی در کشت بافت انواع ریزنمونه­های گیاهی هستند.

جدول2- تجزیه واریانس داده‌ها برای صفات ارزیابی شده در کشت درون شیشه ای خیار.

Table 2- Analysis of variance for evaluated traits in vitro culture of cucumber.

^* و ^** به ترتیب اختلاف آماری معنی دار در سطح 05/0 و 01/0

* and* * Statistically significant difference of 0.05 and 0.01 respectively.

جدول3- مقایسه میانگین داده­های درصد کالوس­زایی، درصد کالوس­های رویان­زا و فراوانی نوساقه حاصل از کشت ریزنمونه­های هیپوکوتیل، کوتیلدون و برگ خیار تحت تاثیر تیمارهای هورمونی مختلف.

Table 3- The comparing means analysis of the percentage of callogenesis, embryonic calli and shoot frequency resulting of hypocotyl, cotyledon and leaf explant cultures under the effect of different hormone treatments.

نسبت اکسین به سیتوکنین مسیر تقسیم سلولی و باززایی گیاه را تعیین می‌کند (Davis, 1995). گزارشاتی از باززایی ریزنمونه کوتیلدون (Halder et al., 1982; Gambley & Dodd, 1990; 1991; Singh et al., 1990)، برگ (Burza et al., 1995; Seo et al., 2000; Mishra & Bhatnagar, 1995)، هیپوکوتیل (;Nishibayashi et al., 1996 Raharjo et al., 1996) و گره  Ahmad & Anis  (2005) گیاه خیار تحت تاثیر انواع هورمون‌ها وجود دارد اما فراوانی باززایی اغلب پایین می­باشد. مطالعات دقیق­تر نشان داده است که نوع ژنوتیپ نقش بسیاری مهمی در باززایی گیاه خیار داشته است لذا تلاش­هایی به منظور بهبود شرایط باززایی از انواع ژنوتیپ ها صورت گرفته است (Abu-Romman et al., 2013). در این مطالعه از رقم پرمحصول وارداتی سوپرنیا استفاده شده و اثر هورمون BAP به تنهایی و در ترکیب با غلظت‌های مختلف هورمون NAA در کالوس­زایی و باززایی ریزنمونه­های مختلف این ژنوتیپ مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد هورمون BAP به تنهایی قادر به القای کالوس می‌باشد اما در ترکیب با هورمون NAA  کالوس­دهی بیشتری دارد که این نتیجه با گزارش  Shrivastara & Roy ((2012 مطابقت دارد. با افزایش میزان هورمون اکسین میزان کالوس­دهی افزایش یافت، نتایج حاصل در تطابق با نتایج Lou & Kako (1994) و Ladyzynski et al. (2001) می­باشد. با آگاهی از نقش اکسین در تقسیمات مکرر میوزی و رشد سلولAhsan et al.  (2014) نتیجه موردنظر دور از انتظار نیست. بیشترین درصد کالوس­زایی در ریزنمونه کوتیلدون در تیمارNAA  (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (3 میلی‌گرم در لیتر) و سپس در ریزنمونه هیپوکوتیل و برگ مشاهده گردید. مطالعات قبلی هم نشان می­دهد که کالوس­های به وجود آمده از کوتیلدون که معمولا دارای جوانه­های باززا شده هستند در پاسخ به سطوح بالای اکسین به تنهایی یا در ترکیب با سیتوکنین (معمولا (BAP نسبت به سایر ریزنمونه­ها بیشتر تولید می­شوند (Stripichitt et al., 2005). در ریزنمونه هیپوکوتیل حداکثر درصد کالوس­زایی در تیمار NAA (4/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (1 میلی‌گرم در لیتر) بدست آمد. با افزایش میزانBAP  میزان کالوس­زایی در برخی ریزنمونه­ها کاهش یافت. در بررسی اثر هورمون‌های گیاهی بر کالوس­زایی و باززایی ریزنمونه هیپوکوتیل گیاه خیار Abu-Romman et al. 2013)) عنوان کردند که افزایش میزان هورمون سیتوکینین نسبت به اکسین در کالوس­دهی تاثیر کاهشی دارد. بیشترین میزان باززایی در ریزنمونه کوتیلدونی در تیمار هورمونی NAA (3/0 میلی‌گرم در لیتر) به همراهBAP  (3 میلی‌گرم در لیتر) به­دست آمد. به عنوان یک نتیجه مهم در این آزمایش مشخص شد که هورمون BAP نقش بسزائی در باززائی دارد که با نتایج Ugandhar et al. (2011) که بیشترین میزان باززایی را در محیط حاوی غلظت های مختلف هورمون BAP در ترکیب با غلظت بسیار پایین هورمون اکسین بدست آوردند مطابقت دارد. اثرات چشمگیر این هورمون شاید با تغییرات بافت‎شناسی در بافت‎های القا شده مرتبط باشد (Neibaur et al., 2008). بررسی‏ها نشان می‏دهد حذف اکسین از محیط کشت، پیش‏نیاز خاموش شدن چند ژن و یا سنتز محصولات جدید ژنی می‏باشد که برای نمو رویان لازم است. همچنین نوع و غلظت سیتوکینین بکار رفته به­طور چشمگیری باززایی نوساقه را در ژنوتیپ‏های متفاوت تحت تاثیر قرار می‏دهد (Amini et al., 2013). از طرفی ریزنمونه کوتیلدون کالوس­زایی و باززرایی بهتری نسبت به دو ریزنمونه دیگر نشان داد. این نتیجه نیز در تطابق با یافته‌های Kumar et al. ((2003 در استفاده ریزنمونه­های مختلف برگ، هیپوکوتیل و کوتیلدون، همچنین در تطابق یافته­های Wehner & Locy (1981) وet al.  Alsop (1978) می­باشد. این عکس العمل برتر ریزنمونه کوتیلدون نسبت به سایر ریزنمونه­ها را می­توان به غلظت‌های بالای هورمون اکسین درون‌زا در کوتیلدون و اثر متقابل آن بر ریزنمونه      Gambley & Dodd (1990) و یا پتانسیل ارگانوژنیک بیشتر این ریزنمونه یه دلیل وجود سلول­های مریستمی تولید کننده ساقه در سطح رویی کوتیلدون نسبت داد (et al., 2010  .(Motamedi اما با یافته‌های Jesmin & Mian (2016) در استفاده از ریزنمونه­های مختلف گیاه خیار جهت کالوس­زایی که بیشترین میزان کالوس­زایی را به ترتیب در ریزنمونه­های ساقه، برگ و کوتیلدون گزارش کردند مغایر بود. که این نتیجه متفاوت احتمالا می­تواند به ­دلیل تغییر در تعادل هورمون­های درونی در اندام­های مختلف گیاه بسته به ژنوتیپ باشد (Javadian et al., 2016). به عبارتی هر ژنوتیپ دارای مقادیر خاصی از هورمون­های درونی بوده و غلظت­های هورمونی استفاده شده بیشترین تاثیر را در واکنش نسبت به هورمون­های درونی بافت دارد (Norouzi et al., 2018). چندین عامل بر موفقیت کالوس­زایی و باززایی از کوتیلدون مؤثر است ازجمله ژنوتیپ (1981) Wehner & Locy  سن میوه‌هایی که از آن‌ها بذر گرفته شده است و کوتیلدون­هایی که به خوبی رشد یافته‌اند نسبت به کوتیلدون­هایی که در مرحله رشد اولیه هستند (Lange & Juvik, 1986). نقش BAP  در تحریک فاز جوانه­زنی یا باززائی تایید شده و در این راستا نشان داده شده است که استفاده از BAP در غلظت 3 میلی گرم در لیتر در ترکیب با  3/0 میلی‌گرم در لیتر NAA بهترین تیمار جهت باززایی ژنوتیپ سوپرنیا خیار از ریزنمونه­های کوتیلدون می­باشد.  نتایج حاصل از این بررسی، می­تواند در تولید کالوس و باززایی غیر مستقیم این رقم پرمحصول با اهداف ریزازدیادی، مطالعات سوسپانسیون سلولی و تراریختی به­خصوص در راستای تولید واکسن­های نوترکیب خوراکی در این گیاه راه گشا باشد.