جداسازی ملکولی cDNA کدکننده‌ N-methylstylopine hydroxylase از مامیران کبیر (Chelidonium majus L.) و افزایش بیان آن در پاسخ به محرک غیرزیستی شوری

جداسازی ملکولی cDNA کدکننده­  N-methylstylopine hydroxylase از مامیران کبیر (Chelidonium majus L.) و افزایش بیان آن در پاسخ به محرک غیرزیستی شوری

زهرا سلیمانی¹، صدیقه فابریکی اورنگ*²، سودابه مفاخری³

¹ دانش­آموخته کارشناسی ارشد ژنتیک و به­نژادی گیاهی، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی^(ره)، قزوین، ایران.

² استادیار، گروه ژنتیک و به­نژادی گیاهی، دانشگاه بین­المللی امام خمینی^(ره)، قزوین، ایران.

³ استادیار، گروه باغبانی، دانشگاه بین­المللی امام خمینی^(ره)، قزوین، ایران.

تاریخ دریافت: 03/04/1397، تاریخ پذیرش: 30/04/1397

چکیده

مامیران کبیر (Chelidonium majus L.) حاوی ترکیبات آلکالوئیدی مهم از جمله سنگوئینارین است. سنگوئینارین یک آلکالوئید فعال دارای خواص دارویی بالقوه ضدمیکروبی، ضدالتهابی و ضدتوموری می­باشد که به‌طور گسترده در گیاهان خانواده خشخاش وجود دارد. در این تحقیق جداسازی و تعیین توالی cDNA کد کننده آنزیم (s)-cis-N-methylstylopine 14-hydroxylas (MSH) در مامیران­کبیر به‌عنوان یکی از آنزیم‌های کلیدی مسیر تولید سنگوئینارین انجام شد. سپس تغییرات بیان ژن cmMSH در سه اندام‏ ریشه، برگ و ساقه در چهار سطح شوری (صفر، 25، 50 و100 میلی­مولار) به­صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی بررسی شد. در پژوهش حاضر cDNA کد کننده آنزیم cmMSH از بافت ریشه جداسازی، با موفقیت در ناقل پلاسمیدیPTG19-T  درج و سپس در باکتری E .coli همسانه‌سازی شد. پس از تأیید همسانه‌های نوترکیب با روش PCR، پلاسمید باکتری‌های نوترکیب استخراج و قطعه ژنی توالی‌یابی شد. قطعه توالی‌یابی شده دارای 784 نوکلئوتید با یک چارچوب قرائت باز 261 اسیدآمینه‌ای بود و مشخص گردید پروتئین حاصل با داشتن دامین‌های کارکردی helix K region، heme-binding region و aromatic region متعلق به خانواده پروتئینی Cytochrome-P450 می‌باشد. در درخت فیلوژنی، توالی پروتئینی ژن cmMSH جداسازی شده بیشترین شباهت را با آنزیم methylstylopine 14-hydroxylase گیاه خشخاش داشته است. مقایسه میانگین بیان نسبی ژن نشان داد که شوری50 میلی­مولار بیشترین تأثیر را بر افزایش بیان ژن cmMSH در بافت ریشه دارد. همچنین بررسی الگوی تغییرات بیان ژن نشان داد که با افزایش سطح شوری تا 50 میلی­مولار، بیان ژن cmMSH در دو اندام برگ و ریشه زیاد شده و با افزایش شدت شوری به 100 میلی­مولار میزان بیان ژن به­مقدار 35 درصد در هر دو اندام کاهش یافت.

واژه­های کلیدی: آنزیمcmMSH ، بنزیل­ایزوکوئینولین­ها، سنگوئینارین، شوری، مامیران.

مقدمه

متابولیت­های ثانویه گیاهی منابع بی­نظیری برای داروها، افزودنی­های غذایی و ترکیات مهم صنعتی هستند که در مسیرهای بیوشیمیایی مختلفی سنتز می­شوند. افزایش کاربرد گیاهان دارویی و ترکیبات آن­ها و نیز مقادیر پایین متابولیت­های ثانویه (کمتر از یک درصد وزن خشک) در این گیاهان، اهمیت توجه به افزایش کمیت و کیفیت این ترکیبات را موجب می­گردد ((Alamgir, 2017; Singh & Dwivedi, 2018. مامیران یا "مامیران‏کبیر" گیاهی دارویی با نام علمی Chelidonium majus L. از خانواده خشخاش (Papaveraceae) است که گاه گیاه پرستو نیز نامیده می‌شود. تمامی قسمت‏های این گیاه و نیز شیرابه آن مصرف دارویی دارند و حاوی آلکالوئیدهای مختلفی مانند سنگوئینارین[1]، کلیدونین[2]و کلریترین[3] می‌باشد (Meng et al., 2009). مامیران در استان­های شمالی ایران یعنی گیلان، گرگان و مازندران رشد می‌کند (Ghanavi et al., 2015). آلکالوئیدهای گروه بنزیل ایزوکوئینولین^[4] (BIAs) متشکل از 2500 ترکیب نیتروژن‏دار هستند که در گیاهانی از قبیل خانواده خشخاش یافت می‌شوند. بسیاری از این آلکالوئید­ها دارای خاصیت دارویی مانند مرفین و کدئین (مسکن و ضد درد)، نوسکاپین (ضد سرفه و ضدسرطان)، سنگوئینارین و بربرین (ضد میکروب) و پاپاورین (گشادکننده­ی عروق) می­باشند (Farrow et al., 2012). بیوسنتز آلکالوئیدهای BIA با tyrosine آغاز می‏شود و با انجام چند واکنش آنزیمی به (S)-reticuline تبدیل می‌شود. این ترکیب توسط آنزیم BBE^[5] به (S)-scoulerine تبدیل می‌شود که این ماده به نوبه خود در یک مسیر متشکل از چند واکنش آنزیمی به سنگوئینارین تبدیل می‌شود (شکل 1). یکی از آنزیم‌های کلیدی این مسیر (S)-cis-N-methyl stylopine 14-hydroxylase (MSH) می‌باشد که (S)-cis-N-methylstylopine را به Protopine تبدیل می‌کند (Beaudoin & Facchini, 2013). متابولیت‏های ثانویه، مواد آلی با ساختار شیمیایی پیچیده‏ای هستند که گیاهان در طول حیات خود تولید می‏نمایند؛ ولی در رشد و نمو و فعالیت‏های حیاتی گیاهان نقش ندارند و عمدتاً به­منظور دفع آفات، جذب حشرات گرده افشان و مبارزه با بیماری‏های میکروبی تولید می‏شوند (.(Kumar & Gupta, 2008 برخی از این ترکیبات مانند ترکیبات با اثرات ضد سرطانی از ارزش اقتصادی بالایی برخوردارند و قیمت آن‏ها از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر کیلو تغییر می‏کند. تولید انبوه و سریع این مواد پیچیده در مقیاس زیاد از طریق روش‏های شیمیایی عمدتاً مشکل و یا غیر ممکن می‏باشد و از سویی محدودیت‏های مختلف مانع تأمین این مواد از طبیعت است (Bourgaud et al., 2001; Kheradmand et al., 2017; Rao & Ravishankar, 2002; Mulabagal & Tsay, 2004). هر چند امروزه نقش دفاعی متابولیت‏های ثانویه برای همه تقریباً پذیرفته شده است اما هنوز بررسی سازوکار تاثیر تنش‏های محیطی بر تولید این مواد تصویر پیچیده و پر ابهامی پیش روی ما می‏گذارد، شواهد زیادی نشان می‏دهند که در شرایط تنش، تولید برخی از این ترکیب­ها تا چندین برابر افزایش می‏یابد، اما دلایل زیادی نیز وجود دارد که این تاثیر همیشگی نیست (Tripathi & Tripathi, 2003). مطالعات در زمینه گیاهان دارویی بیشتر بر شناسایی مسیر بیوسنتزی و ژن‏های داخلی، به­منظور یافتن راه­کارهای مناسب برای تولید بیشتر با هزینه کمتر متمرکز می‏باشد (Mehrabani et al., 2013). از یک­سو، روشن­سازی مسیرهای بیوسنتزی و تعیین توالی ژن‏ها و مشخص­کردن نقش متابولیت‏های ثانویه در یک اکوسیستم می‏تواند افق جدیدی را در زمینه توسعه کشاورزی پایدار ایجاد کند و از سویی دیگر، با توجه به اهمیت اقتصادی ترکیبات آلکالوئیدی، دست‏ورزی متابولیسم آلکالوئیدهای گیاهی توجه زیادی را در بیوتکنولوژی گیاهی به خود معطوف داشته است. بنابراین، با توجه به اهمیت آلکالوئیدها، در این تحقیق اقدام به شناسایی و جداسازی ژن کد کننده آنزیم (s)-cis-N-methyl stylopine 14-hydroxylas (MSH) از گیاه مامیران­کبیر شد و در قدم بعدی میزان بیان ژن مذکور در اندام‏های مختلف این گیاه تحت تاثیر محرک غیرزیستی تنش شوری مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

به­منظور شناسایی و جداسازی cDNA کدکننده آنزیم MSH نیاز به طراحی آغازگر بود که برای این منظور از کتابخانه­های EST گیاه مامیران استفاده شد. اطلاعات این کتابخانه­ها و توالی­های EST آن­ها از پایگاه اطلاعاتی [6]NCBI به‌دست آمد. به­منظور پیدا کردن توالی­های EST که با ژن cmMSH مرتبط بودند از Blastn استفاده شد. از این‌رو با استفاده از توالی­ ژن­های MSH ،P6H،CYP82X1،CYP82X2، CYP82Y1 گیاه خشخاش (Papave somniferum) EST هایی که با توالی مورد نظر ما شباهت بالایی داشتند را انتخاب و با نرم­افزار EGassembler[7] هم­گذاری انجام شد. چارچوب قرائت باز توالی توافقی به­دست آمده با برنامه ORF finder^[8] به­دست آمد. به­منظور جداسازی cDNA کد کننده آنزیم MSH از گیاه مامیران، برای توالی توافقی به­دست آمده آغازگرهای اختصاصی طراحی و پس از بررسی خصوصیات آغازگرها با استفاده از برنامه Oligo analyzer^[9] سنتز آن­ها توسط شرکت Bioneer (کره جنوبی) انجام شد (جدول 1). برای تهیه نمونه گیاهی به­منظور جداسازی ژن مورد نظر و نیز بررسی بیان آن در اندام­های مختلف؛ بذر گیاه مامیران کبیر تهیه شده از موسسه تحقیقات جنگل­ها و مراتع کشور در گلخانه کاشته شدند. برای بررسی اثرات تنش شوری بر میزان بیان ژن cmMSH در گیاه مامیران، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار سطح شوری (غلظت­های صفر، 25، 50، 100 میلی­مولار) در سه تکرار اجرا گردید. پس از چهار هفته از رشد گیاهان، تنش­ها در سه زمان متوالی به­مدت 14 روز اعمال شد و پس از اعمال آخرین تنش نمونه برداری از اندام­های ریشه، ساقه و برگ انجام گرفت.

جدول 1- توالی جفت آغازگرهای مورد استفاده به‌منظور جداسازی و بررسی بیان ژن cmMSH در گیاه مامیران کبیر.

Table 1- The sequences of primers used for Isolation and cmMSH gene expression in Chelidonium majus L.

استخراج RNA از بافت‏های ریشه، ساقه و برگ با استفاده از بافر استخراج RNA (RNX- Plus Solution, Sinaclon,) طبق دستور­العمل شرکت سازنده انجام شد. ساخت cDNA با استفاده از آنزیم رونوشت­بردار معکوس (Thermofisher scientific, EPO441) و آغازگر الیگو T ₁₈(dT) (Vivantis) انجام شد. پس از یافتن بهترین دمای اتصال جفت آغازگرها، واکنش زنجیره‎ای پلی­مراز برای جداسازی cDNA آنزیم cmMSH از گیاه مامیران با استفاده از مخلوط واکنش PCR (Amplicon) انجام شد. در ادامه پس از خالص­سازی، قطعات DNA از ژل آگارز با استفاده از کیت خالص­سازی Expin^TM Combo GP (GeneAll) انجام گرفت و قطعه تخلیص شده در پلاسمید pTG19  (Vivantis) درج و با روش شوک حرارتی در سلول­های مستعد شدهE. coli  سویه DH5α (با روش کلرید کلسیم) (Sambrook & Russel, 2001) همسانه­سازی گردید. به­منظور غربال اولیه باکتری­های نوترکیب از محیط انتخابگر حاوی آنتی­بیوتیک آمپی‎سیلین استفاده شد و برای اطمینان از حضور قطعه مورد نظر در پلاسمید،PCR  با آغازگرهای اختصاصی انجام شد و توالی­یابی با آغازگرهای عمومی M₁₃ و T₇ توسط شرکت Bioneer انجام گرفت. بررسی نتایج حاصل از توالی‌یابی قطعه مورد نظر، توسط نرم­افزار CLC main workbench (V5.5) انجام گرفت. با استفاده از این نرم­افزار، توالی­های اضافی که شامل توالی ناقل بودند از توالی حذف گردید و توالی نوکلئوتیدی بدست آمده برای بررسی­های بیشتر مورد استفاده قرار گرفت و در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت گردید. مطالعه و مقایسه میزان بیان ژن cmMSH در اندام­های مختلف (ریشه، ساقه و برگ) و تیمارهای مختلف شوری (صفر، 25، 50 و100 میلی­مول بر لیتر) با Real Time-PCR و آغازگرهای اختصاصی و نیز با استفاده از ژن Elangation factor به­عنوان ژن مرجع انجام گرفت.

نتایج و بحث

بیوسنتز متابولیت مهمی نظیر سنگوئینارین در مامیران کبیر در مسیری متشکل از هفت مرحله آنزیمی از (S)-reticulin انجام می‌گیرد (شکل 1). آنزیم N-methylstylopine hydroxylase (MSH) در این مسیر تبدیل (S)-stylopine به پروتوپین را انجام می‌دهد. با توجه به اینکه اطلاعاتی از cDNA کدکننده این آنزیم در مامیران کبیر وجود نداشت؛ در این راستا اقدام به جداسازی آن گردید. لازم به ذکر است که نتایج مطالعات مختلف در گیاهان هم‌خانواده حاکی از این مطلب بود که تجمع رونوشت‌های این ژن در ریشه بیش از سایر اندام‌هاست (Facchini et al., 2013)؛ بنابراین در پژوهش حاضر جداسازی cDNA کد کننده cmMSH از بافت ریشه انجام شد (شکل 2-الف). پس از تأیید همسانه‌های نوترکیب با روش PCR (شکل 2-ب)، نتایج توالی­یابی نشان داد که قطعه مورد نظر دارای 784 نوکلئوتید با یک چارچوب قرائت باز 261 اسیدآمینه‌ای می­باشد که با شماره دسترسی KX646397 در پایگاه داده NCBI ثبت گردید. توالی پروتئینی حاصل دارای دامین اصلی p450 بود که نشان می‌دهد پروتئین مورد مطالعه به خانواده پروتئینی Cytochrome-P450 تعلق دارد. لازم به ذکر است که از ویژگی­های خانواده پروتئینی P450 دامین­های helix K region، heme-binding region و  aromatic region می­باشد که در یوکاریوت­ها حفاظت شده می­باشد (Takemura et al., 2013). دامین­های ذکر شده در توالی اسیدآمینه­ای جداسازی شده در این مطالعه نیز در انتهای کربوکسیل یافت شد. توالی MSH جداسازی شده از مامیران­کبیر (cmMSH) با پروتئین­های P450 دیگر؛ به­ویژه آن ­دسته از پروتئین­ها که در بیوسنتز آلکالوئیدهای ایزوکوئینولین نقش دارند (EcCYP82N2V2, PsCYP719B1, PsCYP82N4, EcCYP80B1V2, PsCYP719A25, EcCYP719A5) مقایسه شدند (شکل 3) (Gesell et al., 2009; Ikezawa et al., 2007; Takemura et al., 2013; Beaudoin and Facchini, 2013).

شکل 1-  مسیر بیوسنتزی سنگوئینارین که در این مسیر S-رتیکولین طی هفت مرحله آنزیمی به ماده نهایی سنگوئینارین تبدیل می­شود (برگرفته از Beaudoin & Facchini, 2013).

Figure 1- Sanguinarine biosynthesis pathway which in this pathway S-reticulin is converted to the sanguinarine in seven enzyme phases (derived from Beaudoin & Facchini, 2013).

شکل 2– الف) قطعه تکثیر شده cmMSH (چاهک 1) از روی cDNA ریشه مامیران کبیر و ب) نتیجه روش  PCRبا همسانه­های رشد کرده روی محیط گزینشگر (Clony PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (M- نشانگر اندازه ملکولی (Vivantis, 1kb)، چاهک 1 الی 3- همسانه­های دارای ناقل نوترکیب، 4- کنترل مثبت (cDNA  ریشه به عنوان الگو).

Figure 2- (a) the amplified segment of cmMSH (well 1) from the root cDNA of greater celandine; b) the result of PCR test with selection cultures grown colons using specific primers (M: ladder, wells 1- 3: clones with recombinant vector, well 4: positive control (root cDNA as template).

از ویژگی­های خانواده پروتئینی CYP82 دنباله آمینواسیدی Gly/Ala در ناحیه helix I می­باشد. از سوی­دیگر دنباله Thr در این ناحیه در پروتئین­های منواکسیژناز P450 حفاظت شده است (شکل 3)؛ بنابراین وجود این دنباله­های آمینواسیدی حفاظت شده در helix I بیانگر این است که پروتئین موردنظر به­عنوان یک آنزیم از نوع منواکسیژناز فعالیت دارد (Takemura et al., 2013). در درخت فیلوژنی ترسیم شده (شکل 4)، cmMSH از خانواده­های پروتئینی CYP80 و CYP719 تفکیک شد. به­طوری­که در بین پروتئین­های P450، پروتئین cmMSH بیشترین شباهت را با PsCYP82N4 (77 درصد یکسانی) سپس با PsCYP82Y1 (59 درصد یکسانی) و PsCYP82X2 (57 درصد یکسانی) داشت. در بین پروتئین­هایی که در بیوسنتز آلکالوئیدهای ایزوکوئینولین نقش دارند، cmMSH بیشترین شباهت را با آنزیم methylstylopine 14-hydroxylase گیاه خشخاش داشت (شکل 4).

نتایج حاصل از داده­های qRT-PCR به­منظور بررسی تأثیر تنش شوری بر بیان ژن cmMSH در اندام­های مختلف (ریشه، ساقه و برگ) گیاه مامیران، بیانگر تنوع بیان ژن مذکور در سطوح مختلف تنش و نیز در اندام‏های مختلف بود. براساس نتایج تجزیه واریانس (جدول 2)، میزان تغییرات بیان ژن cmMSH در سطوح مختلف شوری صفر (شاهد)، 25، 50 و 100 میلی­مولار اختلاف معنی­داری را در سطح احتمال یک درصد (P≤0.01) نشان داد که این امر نشان از تأیید تأثیرگذاری تنش شوری بر بیان ژن مذکور بود. مقایسه میانگین بیان ژن در غلظت­های مختلف شوری نشان داد که شوری50 میلی­مولار بیشترین تاثیر را بر بیان ژن cmMSH دارد و کمترین میزان بیان ژن مربوط به شرایط بدون تنش (شاهد) بود. با بررسی روند تغییرات بیان مشخص گردید که با افزایش میزان شوری تا 50 میلی­مولار (شوری ملایم) بیان ژن cmMSH افزایش یافته و پس از آن با افزایش شدت شوری از میزان بیان ژن کاسته شده است.

شکل 3- همردیفی توالی آمینواسیدی cmMSH جداسازی شده و تعدادی از پروتئین­های خانواده P450. (نواحی مشخص شده با کادر قرمز نشان دهنده دامین­های حفاظت شده پروتئین­های P450 یوکاریوتی است. ناحیه زیرخط­دار مربوط به توالی توافقی helix I است و علامت *: مربوط به دنباله Gly/Ala و Thr حفاظت شده است).

Figure 3- Alignments for amino acid sequence of cmMSH and related P450 proteins family.  (Red boxes indicate the conserved domains of eukaryotic P450 proteins, Underlined indicates Helix I consensus sequence and * sign indicates conserved Gly/Ala and Thr residue).

شکل 4- روابط فیلوژنتیک براساس توالی­های پروتئینی اعضای خانواده­ سیتوکروم P450 با الگوریتم Neighbor Joining (NJ).

Figure 4- Phylogenetic relationships based on protein sequences of the cytochrome P450 family with Neighbor Joining (NJ) algorithm.

بررسی میزان بیان ژن cmMSH در اندام‏های مختلف گیاه مامیران (ریشه، ساقه و برگ)، بیانگر تفاوت اثر اندام در میزان بیان بود (جدول 2). به­طوری­که بیشترین میزان بیان ژن مذکور در ریشه (6/1 برابر برگ و 5/2 برابر ساقه) و کمترین میزان بیان ژن در ساقه مشاهده گردید (شکل 5). در توافق با نتایج حاصل از این تحقیق، در گیاه خشخاش نیز بالابودن فراوانی نسبی رونوشت­های ژن cmMSH در ریشه و به­دنبال آن تجمع سنگوئینارین در ریشه‎های این گیاه گزارش شده است به­طوری­که رونوشت­های این ژن در تمام اندام­ها وجود دارد ولی در ریشه تجمع بیشتری داشته است (Beaudoin & Facchini, 2013) که با نتایج این تحقیق هم­راستا می‎باشد. بر اساس نتایج مشاهده شده فراوانی رونوشت­های cmMSH در تمام اندام­ها در تنش شوری ضعیف افزایش یافت تا این­که به بالاترین میزان خود در تنش ملایم (50 میلی­مولار) در بافت ریشه رسید و سپس با افزایش شدت تنش کاهش یافت که این نتایج با افزایش فراوانی رونوشت­های ژن MSH در اندام­های مختلف گیاه خشخاش تحت تأثیر محرک قارچی Botrytis cinerea مطابقت دارد (Beaudoin & Facchini, 2013).

شکل 5- مقایسه بیان نسبی ژن cmMSH  در اندام­های مختلف (ریشه، ساقه و برگ) گیاه مامیران.

Figure 5- Comparison of the mean relative expression of cmMSH gene in various organs (root, stem and leaf) of greater celandine.

با توجه به گزارش‌های تجمع حداکثری سنگوئینارین در ریشه مامیران کبیر (Holkova et al., 2010; Samanani et al., 2004)، سطح بالای رونوشت ژن­های کنترل کننده این مسیر ازجمله cmMSH  در ریشه آن قابل انتظار بود. البته رونوشت­های این ژن در اندام ساقه که سنگوئینارین قابل تشخیصی در آن تجمع نمی­یابد نیز وجود دارد. در واقع به­نظر می­رسد محل سنتز سنگوئینارین منحصر به ریشه که در آن تجمع می­یابد نباشد و ممکن است در ساقه نیز سنتز شود. در تأیید این موضوع می­توان به سنتز مرفین در ساقه اشاره کرد، که با وجود این­که مرفین فقط در اندام هوایی در درون کپسول تجمع می­یابد (Facchini & De Luka, 1995)، اما آنزیم سالوتاردینول سینتتاز که در بیوسنتز مرفین نقش دارد به­طور گسترده در ریشه و ساقه حتی فعال­تر از کپسول وجود دارد و نشان­دهنده این موضوع است که مرفین در ریشه و ساقه سنتز شده و توسط شیره گیاهی به درون کپسول منتقل می­شود (Gerardy & Zenk, 1993b). در واقع می­توان بیان داشت که بیان یک ژن در یک اندام الزاما به معنای تجمع مواد تولیدی آن در همان اندام نیست. در این راستا، انتقال نیکوتین و هیوسیامین از ریشه توسط آوند چوبی به برگ­ها یک مثال مشهود از آلکالوئیدهایی است که در ریشه سنتز می­شوند و در اندام­های هوایی ذخیره می­شوند (Hashimoto & Yamada, 1992). با توجه به اطلاعات فوق می­توان نتیجه گرفت که ممکن است چنین مکانیسمی برای سنگوئینارین نیز در مامیران وجود داشته ­باشد، به­این­صورت که سنگوئینارین سنتز شده در ساقه به سمت ریشه انتقال بیابد. نتایج تجزیه واریانس اختلاف معنی­داری را در اثر متقابل تنش شوری و اندام­های مختلف گیاه مامیران بر میزان بیان ژن cmMSH نشان داد (جدول 2).

جدول 2- تجزیه واریانس بیان نسبی ژن cmMSH تحت تأثیر تنش شوری در اندام­های مختلف مامیران کبیر.

Table 2- Analysis of variance for cmMSH gene relative expression under salinity stress in greater celandine organs.

** : اختلاف معنی­دار در سطح احتمال یک درصد.

با توجه به الگوی تغییرات بیان ژن در اندام­های مختلف تحت شوری­های متفاوت (شکل 6)، تنش شوری 25 میلی­مولار، بیشترین تأثیر و درصد افزایش را بر بیان ژن cmMSH در اندام ساقه و کمترین تأثیر را بر بیان ژن مذکور در اندام برگ نشان داد؛ به­طوری­که در این سطح از تنش، بیان ژن cmMSH در تمام اندام‏های مامیران نسبت به تیمار شاهد (بدون شوری) افزایش چشم­گیر و معنی­داری داشت (شکل 6). از سوی دیگر در شوری50 میلی­مولار بیان ژن cmMSH نسبت به تیمار شاهد و شوری 25 میلی­مولار در هر دو اندام ریشه و برگ افزایش قابل ملاحظه­ای داشت، در حالی­که در شوری50 میلی­مولار نسبت به شوری 25 میلی­مولار کاهش قابل ملاحظه­ای در بیان این ژن در اندام ساقه مشاهده شد. البته بیشترین میزان بیان ژن در این سطح از تنش شوری (50 میلی­مولار)، مربوط به ریشه و کمترین میزان بیان مربوط به ساقه بود. در جمع­بندی اثر متقابل شوری و اندام همانطور که مشاهده می‏شود (شکل 6) با شوری اولیه، میزان بیان ژن cmMSH در تمام اندام‏ها به‏خصوص در ساقه و با اختلاف معنی­داری از شاهد افزایش یافت. اما با افزایش سطح شوری از 50 میلی­مولار به 100 میلی­مولار میزان بیان این ژن در تمام اندام‏ها سیر نزولی نشان داد؛ که علت آن می­تواند افزایش شدت تنش و مدت زمان طولانی مواجه شدن گیاه با شرایط تنش باشد. البته باید توجه داشت که در شوری 100 میلی­مولار همچنان بیان ژن cmMSH در برگ و ریشه نسبت به عدم شوری (تیمار شاهد) افزایش یافته است (شکل 5). در همین راستا نیز نتایج حاصل از تاثیر محرک زیستی بر بیان ژن DIOX2 (از ژن­های موثر در سنتز سنگوئینارین) حاکی از روند کاهشی بیان ژن فوق­الذکر در ساعات پایانی القاء به­دلیل مواجهه طولانی با محرک­ها در سوسپانسیون سلولی می­باشد Hagel & Facchini, 2010)).

شکل 6- مقایسه اثر متقابل شوری و اندام­های گیاه مامیران بر بیان ژن cmMSH (شاهد: بدون تنش؛ تنش ضعیف: شوری 25 میلی­مولار؛ تنش متوسط: شوری 50 میلی­مولار؛ تنش شدید: شوری 100 میلی­مولار).

Figure 6- Mean comparison of salinity × greater celandine organs interaction on cmMSH gene expression (control: non stress; weak stress: 25 mM salinity; mild stress: 50 mM salinity; severe stress: 100 mM salinity).

نتیجه­گیری

برای اولین بار در این مطالعه cDNA کد کننده cmMSH از گیاه مامیران کبیر جداسازی و توالی­یابی شد. نتایج حاصل از بررسی بیوانفورماتیکی قطعه توالی­یابی شده، دامین­های کارکردی و اصلی خانواده پروتئینی Cytochrome-P450 را در ژن جدا شده نشان داد. از نظر بیانی نتایج حاصل از ریل تایم پی­سی­آر نشان داد که تنش شوری ملایم 50 میلی­مولاری می‏تواند در گیاه دارویی مامیران کبیر باعث افزایش بیان ژن cmMSH با حداکثر میزان در ریشه و سپس برگ گردد.