
تعداد نشریات | 26 |
تعداد شمارهها | 447 |
تعداد مقالات | 4,557 |
تعداد مشاهده مقاله | 5,380,003 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 3,580,074 |
بهینه سازی تخلیص پروتئین نوترکیب خارج غشایی (OMP) باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات | ||
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی | ||
دوره 14، شماره 1، اردیبهشت 1401، صفحه 175-196 اصل مقاله (1.3 M) | ||
نوع مقاله: مقاله پژوهشی | ||
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2022.18684.1361 | ||
نویسندگان | ||
هاشم کاظم زاده بنه1؛ داود صمصام پور* 2؛ محمدرضا صفرنژاد3؛ سید مهدی علوی4 | ||
1گروه بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی باغبانی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه هرمزگان، بندرعباس، ایران | ||
2*نویسنده مسئول: دانشیار، گروه بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی باغبانی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه هرمزگان، بندرعباس، ایران، | ||
3بخش تحقیقات ویروسشناسی گیاهی - موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، تهران، تهران | ||
4پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک | ||
چکیده | ||
هدف: پروتئین خارج غشایی omp در سطح خارجی پیکره باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات (Candidatus Liberibacter asiaticus) وجود دارد. پروتئین مذکور می تواند به عنوان آنتیژن برای تولید انواع آنتی بادی های مونوکلونال و پلی کلونال مورد استفاده قرار گیرد. با اینحال خالصسازی پروتئینهای غشایی به دلیل وجود ساختارهای آبگریز با مشکلات فراوانی همراه میباشد. در این راستا، هدف از اجرای پژوهش حاضر، بهینه سازی استحصال و تخلیص پروتئین نوترکیب omp می باشد. مواد و روشها: از سازه بیانی باکتریایی pET28a حاوی ژن omp برای تولید نوترکیب این پروتئین استفاده شد. بیان ژن omp در سویه Rosetta باکتری E. coli صورت پذیرفت. با توجه به آبگریز بودن پروتئین omp، خالص سازی آن در شرایط واسرشته مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از غلظتهای مختلف سدیم کلراید، اوره و گوانیدین هیدروکلراید در شرایط اسیدی pH متفاوت استفاده گردید. به منظور دستیابی به پروتئین کاملا خالص نوترکیب، استحصال پروتئین از ژل پلیآکریلآمید با روشهای مبتنی بر سونیکاسیون، شستشوی توسط انتشار و الکتروالوشن صورت پذیرفت. بررسی کمیت و کیفیت پروتئین های خالص شده با انجام الکتروفورز SDS-PAGE و محاسبه غلظت پروتئین با نرم افزار ImageJ انجام گرفت. همچنین برای تایید ماهیت پروتئین خالص شده، آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی صورت پذیرفت. نتایج: نتایج اولیه نشان داد که استفاده از غلظت 500 میلیمولار سدیم کلراید به عنوان یک جزء ضروری در بافرهای استخراج میباشد. همچنین استفاده از اوره به عنوان عامل دناتورهکننده کارایی دو برابری نسبت به گوانیدین هیدروکلراید در میزان پروتئین تخلیص شده داشت و بدین ترتیب بیشترین میزان پروتئین (450 میکروگرم در میلیلیتر) زمانی بدست آمد که غلظت 8 مولار اوره در اجزای بافری تخلیص گنجانده شد. علاوه بر این، نتایج مربوط به جداسازی باند پروتئین از ژل نشان داد که روش الکتروالوشن بهترین کارایی را در بازیابی و جداسازی پروتئین هدف از ماتریکس ژل در مقایسه با روش سونیکاسیون و شستشوی توسط انتشار داشت. نتایج آزمون الکتروفورز پروتئین حاکی از وجود یک پروتئین با اندازه 34 کیلو دالتون متناسب با وزن مولکولی پروتئین omp می باشد. آزمون وسترن بلات نیز موید ماهیت پروتئین نوترکیب در ممبران بود. نتیجهگیری: مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از اوره با غلظت 8 مولار، نمک سدیم کلراید با غلظت 500 میلیمولار به همراه تنظیم بافر الوشن روی (4) pH در مرحله تخلیص پروتئین میتواند به عنوان یک شرایط بهینه برای بدست آوردن بیشترین مقدار پروتئین هدف بکار رود. همچنین، روش الکتروالوشن به عنوان روش کارآمد جهت استحصال باند پروتئینی از روی ژل آکریلآمید معرفی شد. | ||
کلیدواژهها | ||
کلیدوژه؛ کلیدواژه | ||
مراجع | ||
Alibolandi, M, Mirzahoseini H (2001) Chemical assistance in refolding of bacterial inclusion bodies. Biochem Res Int Article ID 631607, 6 pages. doi:10.1155/2011/631607.
Asenjo J, Andrews BA (2009) Protein purification using chromatography: Selection of type, modelling and optimization of operating conditions. J Mol Recognit 22(2), 65-76.
Ausubel F, Brent R, Kingstone (1995) Current protocols in molecular biology. New York, Wiley Interscience.
Babaie M (2020) Proteins separation and purification methods with focus on chromatography: A review study. Journal of Ardabil University of Medical Sciences 20 (2), 151-175 (In Persian).
Ballard J, Bryant A, Stevens D, Tweten RK (1992) Purification and characterization of the lethal toxin (alpha-toxin) of Clostridium septicum. Infect Immun 60, 784-790.
Cellier G. Redondo, C. Cubero J et al. (2020) Comparison of the performance of the main real-time and conventional PCR detection tests for ‘Candidatus Liberibacter’ spp., plant pathogenic bacteria causing the Huanglongbing disease in Citrus spp. Eur J Plant Pathol, https://doi.org/10.1007/s10658-020-02052-3.
Cho SH, Kil EJ, Cho S et al. (2020) Development of novel detection system for sweet potato leaf curl virus using recombinant scFv. Sci Rep 10, 8039.
Dasari Venkata RK (2009) Cloning, high expression and purification of recombinant human interferon β-1b in E. coli. Appl Biochem Biotechnol 158, 140-54.
Duong-Ly KC, Gabelli SB (2014) Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Meth Enzymol 541, 95-103.
Faghihi, M, Salehi M, Bagheri A, Izadpanah K (2009) First report of citrus huanglongbing disease on orange in Iran. Plant Pathol 58, 793 (Absract).
Gu Z, Zhu X, Ni S et al. (2003) Inhibition of aggregation by media selection, sample loading and elution in size exclusion chromatographic refolding of denatured bovine carbonic anhydrase B. J Biochem Biophys Methods 56, 165-175.
Harrington MG (1990) Elution of protein from gels. Meth. Enzymol 182, 488-495.
Hong Y, Luo Y, Yi J et al. (2019) Screening nested-PCR primer for ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ associated with citrus Huanglongbing and application in Hunan, China. PLoS ONE 14 (2), e0212020. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0212020.
Jungbauer A, Hahn R (2009) Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol 463, 349-71.
Khushiramani R, Girisha SK, Karunasagar I (2007). Protective efficacy of recombinant OmpTS protein of Aeromonas hydrophila in Indian major carp. Vaccine 25, 1157-1158.
Kurien BT, Scofield RH (2012) Extraction of proteins from gels-A brief review. Methods Mol Biol 869, 403-405.
Kyte J, Doolittle R (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol 157, 105-132.
Lei Z, Anand A, Mysore KS, Sumner LW (2007) Electroelution of intact proteins from SDS-PAGE gels and their subsequent MALDI-TOF MS analysis. Methods Mol Biol 355, 353-363.
Li GQ, Shao J, Guo CG et al. (2012) A simple monolithic column electroelution for protein recovery from gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 430(1), 24-31.
Llompart B, Llop-Tous I, Marzabal P et al. (2010) Protein production from recombinant protein bodies. Process Biochem 45, 1816-1820.
Mahmood T, Yang PC (2012) Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci 4(9), 429-434.
Mirhosseini SA, Latifi AM, Hosseini HM et al. (2019) The efficient solubilization and refolding of recombinant organophosphorus hydrolyses inclusion bodies produced in Escherichia coli. J Appl Biotechnol 6(1), 20-25.
Murray MG, Thompson WF (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8, 4321-4325.
Retamal CA, Thiebaut P, Alves EW (1999) Protein purification from polyacrylamide gels by sonication extraction. Anal Biochem 268,15-20.
Upadhyay AK, Singh A, Mukherjee KJ, Panda AK (2014) Refolding and purification of recombinant L-asparaginase from inclusion bodies of E. coli into active tetrameric protein. Front Microbiol 15, 1-10.
Vahid R, Mohammad H, Shakeri F et al. (2011) Anti Clostridium septicum alpha toxin antibody. Journal of US-China Medical Science 8(1), 40-45.
Vallejo LF, Rinas U (2004) Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Factories 3 (11), 1-12.
Wang Y, van Oosterwijk N, Ali, AM (2017) A systematic protein refolding screen method using the DGR approach reveals that time and secondary TSA are essential variables. Sci Rep 9355, 1-10.
Yamaguchi H, Miyazaki M (2014) Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules 4 (1), 235-251. | ||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,592 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 417 |