
تعداد نشریات | 26 |
تعداد شمارهها | 447 |
تعداد مقالات | 4,557 |
تعداد مشاهده مقاله | 5,379,999 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 3,580,063 |
بهینهسازی شرایط تخلیص و بازآرایی پروتئین نوترکیب اندونوکلئاز محدودکننده EcoRI در E.coli | ||
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی | ||
دوره 17، شماره 2، اردیبهشت 1404، صفحه 107-132 اصل مقاله (894.45 K) | ||
نوع مقاله: مقاله پژوهشی | ||
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2025.24329.1626 | ||
نویسندگان | ||
کاملیا کتالانی* 1؛ الهام سلیمانی2؛ قربانعلی نعمت زاده3 | ||
1استادیار، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران. | ||
2دکتری، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران. | ||
3استاد، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران | ||
چکیده | ||
هدف: اندونوکلئازهای محدودکننده نوع دوم، متداولترین نوع آنزیمهای محدودکننده هستند که کاربرد وسیعی در مهندسی ژنتیک بهویژه همسانهسازی ژنها دارند. آنزیم EcoRI از پرمصرفترین آنزیمهای محدودکننده نوع دو در حوزه مولکولی است. روش مرسوم تولید این آنزیمها استفاده از سویههای تغییریافتة باکتری Escherichia coli است که بهمنظور بیش تولید آنزیم EcoRI جهش یافتهاند. خالصسازی آنزیمهای تولید شده با این روش به ستونهای متعدد کروماتوگرافی نیاز دارد که هزینه بر و وقتگیر است. باتوجهبه اینکه آنزیم EcoRI دارای ساختاری ساده و بدون پلهای دی سولفید و بهصورت مونومر است در این مطالعه تولید آنزیم به روش نوترکیب، روش بهینه خالصسازی و بازآرایی این آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش:ژن EcoRI از باکتری اشرشیا کولای (E. coli RY13) جداسازی گردید و بهمنظور بیان ژن بهصورت نوترکیب، در حامل بیانی pET28 همسانهسازی و در باکتری E. coli BL21 (DE3) بیان شد. شرایط بهینه بیان پروتئین باتوجهبه نوع القاگر، غلظت و دما پس از القا مورد بررسی قرار گرفت. بیان پروتئین بهصورت محلول یا اجسام انکلوزیونی با استفاده از ژل SDS-PAGE بررسی شد. خالصسازی و بازآرایی پروتئین نوترکیب با دو روش کروماتوگرافی تمایلی و دیالیز انجام شد. فعالیت آنزیم در مقایسه با آنزیم تجاری EcoRI شرکت ترمو بررسی شد. نتایج: شرایط بهینه بیان EcoRI در غلظت ۸/۰ میلیمولار IPTG، دمای ۲۸ درجه سانتیگراد تعیین شد. نتایج حاصل از بررسی پروتئین نوترکیب بیان شده روی ژل SDS-PAGE نشان داده است که پروتئین نوترکیب به شکل اجسام انکلوزیونی بیان گردید همچنین حلشدن اجسام انکلوزیونی تحت شرایط ملایم واسرشتهسازی اوره ۳ مولار نشان داد که اجسام انکلوزیونی از نوع غیرکلاسیک است. نتایج حاصل از بازآرایی اجسام انکلوزیونی با استفاده از دیالیز و بر روی رزین Ni-NTA مشخص کرد که بازدهی بازآرایی بر روی رزین بیشتر از بازآرایی با استفاده از دیالیز است. واکنش هضم آنزیمی با آنزیم تولیدشده و آنزیم تجاری نشان داد که آنزیم نوترکیب خالصشده مشابه آنزیم تجاری قادر به برش DNA پلاسمیدی است. نتیجهگیری: بازآرایی اجسام انکلوزیونی بر روی ستون منجر به صرفهجویی در وقت و هزینه شده و کارایی بیشتری نسبت به روش دیالیز دارد. | ||
کلیدواژهها | ||
آنزیم EcoRI؛ اجسام انکلوزیونی؛ بازآرایی پروتئین؛ خالصسازی پروتئین | ||
مراجع | ||
Akiba, H., Tsumoto, K. (2016). Expression in Bacteria and Refolding. In: Senda, T., Maenaka, K. (eds) Advanced Methods in Structural Biology. Springer Protocols Handbooks. Springer, Tokyo. https://doi.org/10.1007/978-4-431-56030-2_1 Al-Ayoubi, S. R., Schummel, P. H., Golub, M., Peters, J., & Winter, R. (2017). Influence of cosolvents, self-crowding, temperature and pressure on the sub-nanosecond dynamics and folding stability of lysozyme. Phys Chem Chem Phys, 19(22), 14230-14237. https://doi.org/10.1039/c7cp00705a Belková, M., Koszagova, R., & Nahálka, J. (2022). Active inclusion bodies: The unexpected journey. Journal of microbiology, biotechnology and food sciences, 12(1), e5951-e5951. https://doi.org/10.55251/jmbfs.5951 Blount, Z. D. (2015). The unexhausted potential of E. coli. elife, 4, e05826. https://doi.org/10.7554/eLife.05826 Buckhout-White, S., Person, C., Medintz, I. L., & Goldman, E. R. (2018). Restriction enzymes as a target for DNA-based sensing and structural rearrangement. ACS omega, 3(1), 495-502. https://doi.org/10.1021/acsomega.7b01333 Burnett, M. J., & Burnett, A. C. (2020). Therapeutic recombinant protein production in plants: Challenges and opportunities. Plants, People, Planet, 2(2), 121-132. https://doi.org/10.1002/ppp3.10073 de Marco, A., Ferrer-Miralles, N., Garcia-Fruitos, E., Mitraki, A., Peternel, S., Rinas, U., Trujillo-Roldan, M. A., Valdez-Cruz, N. A., Vazquez, E., & Villaverde, A. (2019). Bacterial inclusion bodies are industrially exploitable amyloids. FEMS Microbiol Rev, 43(1), 53-72. https://doi.org/10.1093/femsre/fuy038 Dyson, M. R., Shadbolt, S. P., Vincent, K. J., Perera, R. L., & McCafferty, J. (2004). Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC biotechnology, 4, 1-18. https://doi.org/10.1186/1472-6750-4-32 Faust, G., Stand, A., & Weuster‐Botz, D. (2015). IPTG can replace lactose in auto‐induction media to enhance protein expression in batch‐cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences, 15(8), 824-829. https://doi.org/10.1002/elsc.201500011 Gholami, S., Goodarzvand Chegini, K., Gheibi, N., Mokhtarian, K., Mohamadi, M., & Falak, R. (2017). Cloning, expression, and spectral analysis of mouse betatrophin. Med J Islam Repub Iran, 31, 102. https://doi.org/10.14196/mjiri.31.102 Goppelt, M., Pingoud, A., Maass, G., Mayer, H., Koster, H., & Frank, R. (1980). The interaction of the EcoRI restriction endonuclease with its substrate. A physico-chemical study employing natural and synthetic oligonucleotides and polynucleotides. Eur J Biochem, 104(1), 101-107. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04405.x Hannig, G., & Makrides, S. C. (1998). Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends Biotechnol, 16(2), 54-60. https://doi.org/10.1016/s0167-7799(97)01155-4 Huang, C. J., Lin, H., & Yang, X. (2012). Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements. J Ind Microbiol Biotechnol, 39(3), 383-399. https://doi.org/10.1007/s10295-011-1082-9 Idalia, V.-M. N., & Bernardo, F. (2017). Escherichia coli as a model organism and its application in biotechnology. Recent Adv. Physiol. Pathog. Biotechnol. Appl. Tech Open Rij. Croat, 13, 253-274. https://doi.org/10.5772/67306 Jungbauer, A., Kaar, W., & Schlegl, R. (2004). Folding and refolding of proteins in chromatographic beds. Curr Opin Biotechnol, 15(5), 487-494. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2004.08.009 Kachhawaha, K., Singh, S., Joshi, K., Nain, P., & Singh, S. K. (2023). Bioprocessing of recombinant proteins from Escherichia coli inclusion bodies: insights from structure-function relationship for novel applications. Prep Biochem Biotechnol, 53(7), 728-752. https://doi.org/10.1080/10826068.2022.2155835 Katalani, C., Nematzadeh, G., Ahmadian, G., Amani, J., Kiani, G., & Ehsani, P. (2020). In silico design and in vitro analysis of a recombinant trivalent fusion protein candidate vaccine targeting virulence factor of Clostridium perfringens. Int J Biol Macromol, 146, 1015-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.09.227 Kato, A., & Ohashi, H. (2021). Quick refolding of high-concentration proteins via microchannel dialysis. Industrial & Engineering Chemistry Research, 60(28), 10076-10082. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.1c00410 Kaur, J., Singh, A., Panda, A. K., & Lal, R. (2021). Protocol for in-vitro purification and refolding of hexachlorocyclohexane degrading enzyme haloalkane dehalogenase LinB from inclusion bodies. Enzyme Microb Technol, 146, 109760. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2021.109760 Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680-685. https://doi.org/10.1038/227680a0 Larentis, A. L., Argondizzo, A. P., Esteves Gdos, S., Jessouron, E., Galler, R., & Medeiros, M. A. (2011). Cloning and optimization of induction conditions for mature PsaA (pneumococcal surface adhesin A) expression in Escherichia coli and recombinant protein stability during long-term storage. Protein Expr Purif, 78(1), 38-47. https://doi.org/10.1016/j.pep.2011.02.013 Larentis, A. L., Nicolau, J. F. M. Q., Esteves, G. d. S., Vareschini, D. T., de Almeida, F. V. R., dos Reis, M. G., Galler, R., & Medeiros, M. A. (2014). Evaluation of pre-induction temperature, cell growth at induction and IPTG concentration on the expression of a leptospiral protein in E. coli using shaking flasks and microbioreactor. BMC research notes, 7, 1-13.https://doi.org/10.1186/1756-0500-7-671 Liu, W., Chen, Y., Watrob, H., Bartlett, S. G., Jen-Jacobson, L., & Barkley, M. D. (1998). N-Termini of Eco RI Restriction Endonuclease Dimer Are in Close Proximity on the Protein Surface. Biochemistry, 37(44), 15457-15465. https://doi.org/10.1021/bi980557f Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., & Murray, N. E. (2014). Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res, 42(1), 3-19. https://doi.org/10.1093/nar/gkt990 Lozano Terol, G., Gallego-Jara, J., Sola Martinez, R. A., Martinez Vivancos, A., Canovas Diaz, M., & de Diego Puente, T. (2021). Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli BL21. Front Microbiol, 12, 682001. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.682001 McCarty, N. S., & Ledesma-Amaro, R. (2019). Synthetic Biology Tools to Engineer Microbial Communities for Biotechnology. Trends Biotechnol, 37(2), 181-197. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.11.002 Oganesyan, N., Kim, S.-H., & Kim, R. (2005). SOn-column protein refolding for crystallization. Journal of structural and functional genomics, 6, 177-182. https://doi.org/10.1007/s10969-005-2827-3 Papaneophytou, C. P., & Kontopidis, G. A. (2012). Optimization of TNF-alpha overexpression in Escherichia coli using response surface methodology: Purification of the protein and oligomerization studies. Protein Expr Purif, 86(1), 35-44. https://doi.org/10.1016/j.pep.2012.09.002 Peternel, S., & Komel, R. (2011). Active protein aggregates produced in Escherichia coli. Int J Mol Sci, 12(11), 8275-8287. https://doi.org/10.3390/ijms12118275 Pingoud, A., Wilson, G. G., & Wende, W. (2014). Type II restriction endonucleases--a historical perspective and more. Nucleic Acids Res, 42(12), 7489-7527. https://doi.org/10.1093/nar/gku447 Pollastri, G., & McLysaght, A. (2005). Porter: a new, accurate server for protein secondary structure prediction. Bioinformatics, 21(8), 1719-1720. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bti203 Qing, R., Hao, S., Smorodina, E., Jin, D., Zalevsky, A., & Zhang, S. (2022). Protein Design: From the Aspect of Water Solubility and Stability. Chem Rev, 122(18), 14085-14179. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.1c00757 Sambrook, J. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Habor Laboratory. Sanchez-Garcia, L., Martin, L., Mangues, R., Ferrer-Miralles, N., Vazquez, E., & Villaverde, A. (2016). Recombinant pharmaceuticals from microbial cells: a 2015 update. Microb Cell Fact, 15, 33. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0437-3 Schildkraut, I. (1984). Screening for and characterizing restriction endonucleases. In Genetic engineering: principles and methods (pp. 117-140). Springer. Schramm, F. D., Schroeder, K., & Jonas, K. (2020). Protein aggregation in bacteria. FEMS Microbiol Rev, 44(1), 54-72. https://doi.org/10.1093/femsre/fuz026 Sen, S., & Nilsson, L. (1999). Structure, interaction, dynamics and solvent effects on the DNA-EcoRI complex in aqueous solution from molecular dynamics simulation. Biophys J, 77(4), 1782-1800. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(99)77024-4 Singh, A., Upadhyay, V., & Panda, A. K. (2015). Solubilization and refolding of inclusion body proteins. Methods Mol Biol, 1258, 283-291. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2205-5_15 Singh, A., Upadhyay, V., Singh, A., & Panda, A. K. (2020). Structure-Function Relationship of Inclusion Bodies of a Multimeric Protein. Front Microbiol, 11, 876. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00876 Singhvi, P., & Panda, A. K. (2022). Solubilization and refolding of inclusion body proteins. In Insoluble proteins: methods and protocols (doi:10.1007/978-1-0716-1859-2_22pp. 371-387). Springer. https://doi.org/doi:10.1007/978-1-0716-1859-2_22 Singhvi, P., Saneja, A., Srichandan, S., & Panda, A. K. (2020). Bacterial Inclusion Bodies: A Treasure Trove of Bioactive Proteins. Trends Biotechnol, 38(5), 474-486. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2019.12.011 Trinh, N. T. M., Thuoc, T. L., & Thao, D. T. P. (2021). Production of PEGylated GCSF from Non-classical Inclusion Bodies Expressed in Escherichia coli. Avicenna J Med Biotechnol, 13(4), 192-200. https://doi.org/10.18502/ajmb.v13i4.7204 Ventura, S., & Villaverde, A. (2006). Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol, 24(4), 179-185. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2006.02.007 Yamaguchi, H., & Miyazaki, M. (2014). Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules, 4(1), 235-251. https://doi.org/10.3390/biom4010235 | ||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 175 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 101 |