آنالیز فیلوژنتیکی و تعیین ترادف ژن اینکلوژن بادی دو جدایه ایرانی ویروس خراشک حلقوی میخک

آشنائی, مهناز; جعفرپور, بهروز; ملک زاده شفارودی, سعید

doi:10.22103/jab.2014.1308

تعداد نشریات	27
تعداد شماره‌ها	487
تعداد مقالات	5,127
تعداد مشاهده مقاله	6,646,837
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	4,429,030

آنالیز فیلوژنتیکی و تعیین ترادف ژن اینکلوژن بادی دو جدایه ایرانی ویروس خراشک حلقوی میخک

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 1، دوره 6، شماره 2، شهریور 1393، صفحه 1-14

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2014.1308

نویسندگان

مهناز آشنائی؛ بهروز جعفرپور؛ سعید ملک زاده شفارودی

چکیده

ویروس خراشک حلقوی میخک (Carnation etched ring virus, CERV)، عضو جنس Caulimovirus و خانواده ی Caulimoviridae است. این ویروس به عنوان دومین ویروس مهم میخک پس از ویروس ابلقی میخک محسوب می شود. به منظور شناسایی ویروس مذکور، در طی بازدید از گلخانههای میخک استانهای خراسان رضوی (مشهد) و مرکزی (محلات)، نمونه‌‌های مشکوک به آلودگی جمع‌آوری گردید. تشخیص اولیه CERV با استفاده از آزمون سرولوژیکی الایزای غیر مستقیم صورت گرفت. استخراج DNA از برگهای تازه نمونههای آلوده، با استفاده از بافرCTAB انجام شد. در آزمون PCR پس از به کار‌بردن جفت آغازگرهای اختصاصی قطعه ای به اندازه 1500 جفت‌ باز، واقع در ناحیه اینکلوژن بادی تکثیر شد. ترادف های بدست آمده، همراه با تعدادی از ترادف های کائولیموویروس های موجود در بانک ژن مقایسه شد. دندروگرام با استفاده از ترادف ژن اینکلوژن بادی با نرم افزار MEGA5 و به روش Neighbor joining ترسیم گردید. نتایج حاصل از آنالیزهای فیلوژنی نشان داد که جدایه محلات بیشترین نزدیکی را با جدایه هند (AJ853858) به میزان 4/99% دارد. از طرفی شباهت دو ایزوله ایرانی به یکدیگر 2/92% و با سایر جدایه های موجود در بانک ژن بین 90 تا 4/99% است. در بررسی تغییرات آمینواسیدی جدایه ها، بیشترین تغییرات در جدایه هلند مشاهده گردید. اگرچه تفاوت قابل ملاحظه ای به میزان 9/92-6/60% در سطح توالی های آمینواسیدی مربوط به ناحیه اینکلوژن بادی در بین کائولیموویروسها وجود داشت.

کلیدواژه‌ها

آنالیز فیلوژنتیکی؛ واکنش زنجیره ای پلیمراز؛ ویروس خراشک حلقوی میخک

اصل مقاله

آنالیز فیلوژنتیکی و تعیین ترادف ژن اینکلوژن بادی دو جدایه ایرانی ویروس خراشک حلقوی میخک (Carnation etched ring virus)

مهناز آشنائی*¹، بهروز جعفرپور²، سعید ملک زاده شفارودی³

^1و2 به ترتیب دانشجوی کارشناسی ارشد و استاد گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

³ استادیار گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

تاریخ دریافت: 18/05/1391، تاریخ پذیرش: 24/02/1392

چکیده

واژه‌های کلیدی:. آنالیز فیلوژنتیکی، واکنش زنجیره ای پلیمراز، ویروس خراشک حلقوی میخک.

مقدمه

ویروس خراشک حلقوی میخک (Carnation etched ring virus, CERV)، عضو جنس Caulimovirus می باشد. عضو تیپ این جنس ویروس موزاییک گل کلم است. ویروس های جنس کائولیموویروس دارای پیکره ایزومتریک به قطر 40-50 نانومتر با ضریب رسوب S 200-250 هستند و شامل یک ملکول DNA دو رشته ای به وزن 106×5 دالتون (بطول 8/7-8 کیلو جفت باز) که 17% از وزن پیکره را شامل می شود. از دیگر مشخصات این جنس تولید اندامک های درون سیتوپلاسمی است که بطور مشخص نوعی پروتئین کد شده توسط ویروس می باشد. این اندامک ها در بافت های آلوده تولید شده و اغلب شامل پیکره های ویروس می باشند (Raikhy et al., 2006; Fujisawa et al., 1971). ژنوم کامل ویروس خراشک حلقوی میخک به طول 7932 نوکلئوتید و محتوی CG 4/36% بوده و هفت قالب خواندنی باز را کد می کند(Hull et al., 1986) .

ORF VI در تشکیل ماتریکس پروتئینی اندامکهای درون سلولی[1] و تاثیر بر دامنه میزبانی و گستردگی علائم نقش دارد. این اینکلوژن بادی ها همان ویروپلاسم^{^[2]} هستند که شامل پیکره های بالغ ویروس بوده که در ماتریکسی با تراکم الکترونی بالا قرار گرفته اند (Lawson & Hearon, 1980; Buchen-osmond, 2006) و در کائولیموویروس ها این ساختارها لوله ای شکل می باشند (Chenault & Melcher, 1994). گاه اندازه این ویروپلاسم ها تا 5/4 میکرومتر می رسد و با افزایش سن آلودگی بزرگتر می شوند. وجود این ماتریکس با تراکم الکترونی بالا حاصل فعالیت ریبوزومی می باشد (Lawson & Hearon, 1980). اغلب فرم های ابتدایی تر آنها شامل نواحی کوچک با تراکم الکترونی بالا و حاشیه مشخص بوده که همراه با ریبوزوم ها و پیکره های ویروسی هستند، حال آن که اینکلوژن بادی های ویروس خراشک حلقوی میخک بیشتر شامل پیکره های ویروسی بوده و کمتر شامل ماتریکس تیره می باشد (Rubio-Huertos & Castro, 1972). تجزیه و تحلیل رایانه ای نشان داده که ششمین ORF برای کد کردن پروتئین های بزرگتر از 10 کیلو دالتون توسط رشته مثبت ژنوم ویروس بکار می رود (Raikhy et al., 2006). ORF VI حداقل ناحیه حفاظت شده را (37-5% مشابهت در سطح آمینواسید) در بین دیگر ORF ها دارد و احتمال می رود که میزان تنوع در جدایه های ویروس در ارتباط با تشکیل اینکلوژن بادی ها باشد (Hull & Donson, 1981). همچنین احتمال میرود یک آنالوژی بین ژن ORF VI در Caulimovirus با برخی ویروس های جانوری بر روی میزبان، وجود داشته باشد (Sanger et al., 1991).

این ویروس در ایران تا کنون از استان های مرکزی، خراسان رضوی و شمالی گزارش شده است (Ashnayi et al., 2012; Bayat, 2008). تنها دو گزارش از توالی نوکلئوتیدی کامل این ویروس از هلند و هند در بانک ژن به ثبت رسیده است (Raikhy et al., 2006). از آنجا که تا کنون مطالعه ای در مورد بررسی تنوع در جدایه های ایرانی این ویروس و مقایسه آن با دیگر جدایه ها انجام نشده است، لذا در مقاله حاضر تلاش ما در جهت تعیین میزان شباهت در بخشی از ترادف مربوط به ژن تولیدکننده اینکلوژن بادی و مقایسه تفاوت های آمینواسیدی در این ناحیه از چهار جدایه ویروس می باشد.

مواد و روش ها

نمونه برداری و شناسایی ویروس ها

طی بازدید ازگلخانه های میخک استان های خراسان رضوی (چناران) و مرکزی (محلات) در پاییز و زمستان سال 1389، نمونه برداری از گیاهان میخک که دارای علائمی نظیر نقاط یا خطوط نکروز، کلروز و ابلقی بودند، انجام شد. نمونه ها در شرایط خنک به آزمایشگاه منتقل و تا زمان انجام آزمایش ها در دمای 4 درجه سانتی گراد و به منظور ماندگاری طولانی مدت در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. جهت شناسایی سرولوژیکی ویروس از آزمون الایزای غیر مستقیم[3] استفاده گردید.

آزمون الایزای غیر مستقیم

جهت بررسی وجود ویروس در نمونه ها آزمون سرولوژیکی Indirect-ELISA به روش(Martin, 1990) با استفاده از آنتی سرم چند همسانه ای CERV (تهیه شده از موسسه DSMZ، آلمان) انجام شد. نتایج بر اساس تغییر رنگ حفرات با استفاده از دستگاه الایزا خوان (ELISA Reader, AWARNESS Tech. Inc., Stat fax-2100 USA) و در طول موج 405 نانومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند. با توجه به میزان جذب عصاره برگ سالم (کنترل منفی) و با استفاده از فرمول آستانه جذب گیاهان سالم تعیین گردیده و ارقام بالاتر از این مقدار به عنوان نمونه آلوده مشخص گردید. در این فرمول میانگین جذب شاهدهای منفی بوده و SD انحراف معیار استاندارد بین جذب نوری آن چاهک است.

شناسایی مولکولی ویروس با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز[4]

پس از تایید آلودگی نمونه ها در آزمون الایزای غیرمستقیم، ابتدا دی. ان. ای کل گیاه استخراج و به عنوان DNA الگو مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA به روش ژانگ و همکاران و با استفاده از بافرCTAB^{^[5]} (Zhang et al., 1998) با اندکی تغییرات انجام شد.

برای تشخیص CERV در آزمون PCR، از یک جفت آغازگر اختصاصی IBU / IBD (جدول 1) که مبتنی بر ترادف نوکلئوتیدی ژن کدکننده اینکلوژن بادی بودند، استفاده شد. واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتری شامل یک میکرولیتر از DNA به غلظت 200 نانوگرم بر میکرولیتر، یک میکرولیتر از هر یک از آغازگرها (به غلظت 10 پیکومولار)، 5/2 میکرولیتر از بافر PCR (X10)، یک میکرولیتر MgCl₂ (25 میلی مولار)، 5/0 میکرولیتر از مخلوط نوکلئوتید‌تری‌فسفاتها (dNTPs)(10 میلی مولار) و 3/0 میکرولیتر آنزیم Taq DNA Polymerase (جنت بایو^{^[6]}،کره) با غلظت 5 واحد در میکرولیتر انجام گرفت. برنامه دمایی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل یک مرحله واسرشت‌سازی اولیه به مدت 120 ثانیه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 34 چرخه شامل دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، 57 درجه ‌سانتی‌گراد به مدت 60 ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 120 ثانیه و یک مرحله نهایی به مدت 10 دقیقه در 72 درجه بود. محصول PCR، در ژل آگارز 5/1 درصد و بافر 1X TAE، در حضور نشانگر Gene Ruler™ 100bp DNA Ladder, Fermentase)) الکتروفورز شد و نتایج با دستگاه Gel documentation مشاهده شد. محصول PCR جهت تعیین ترادف به شرکت Macrogen (کره جنوبی) ارسال و با دستگاه Automatic Sequencer ABI 3730XL تعیین ترادف گردید.

آنالیز توالی

نتایج حاصل از تعیین ترادف با استفاده از نرم افزار DNA Baser مورد بررسی قرار گرفتند. توالی نهایی با برنامه ^{^[7]}BLAST در پایگاه اطلاعاتی NCBI بررسی شد. آنالیز فیلوژنتیکی بر ‌اساس ژن اینکلوژن بادی (IB) پس از هم ‌ردیف‌سازی چند‌‌گانه[8] توالی‌های نوکلئوتیدی جدایه‌های CERV با برخی جدایه های موجود در بانک ژن (جدول2 ) با استفاده از نرم‌افزار Mega5 نسخه β و به روش Neighbor joining، با 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap انجام شد. سپس با استفاده از نرم افزار DNAMAN درصد شباهت در سطح توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی به همراه ماتریس فاصله تعیین گردید.

جدول 1- ترادف آغازگرها جهت تکثیر ژن کدکننده اینکلوژن بادی ویروس CERV

Table 1- Sequences of primers used for amplification of inclusion body gene of CERV.

منبع Reference	ترادف آغازگر (´3-´5) Primer sequence	جهت Direction	آغازگر Primer
Raikhy et al., 2006	TCCCCCGGGGGAATGGAACGTCATGAACA	رفت Forward	CERV-IBU
Raikhy et al., 2006	TCCCCCGGGGGATTATTCAGAGTCTGATA	برگشت Reverse	CERV-IBD

جدول 2- شماره دسترسی، اسامی جدایه ‌هایی از ویروس‌های Caulimoviridae و ناحیه ی ژنوم در GenBank.

Table 2- Accession number, strains of virus from Caulimoviridae and region of genome deposited in GenBank.

ویروس virus	جدایه Isolate	شماره دسترسیAccession No.	ناحیه ژنوم Region of genome
Carnation etched ring virus (CERV)	Netherland	NC-003498	Complete genome
Carnation etched ring virus (CERV)	India	AJ853858	Complete genome
Cauliflower mosaic virus (CaMV)	BBC	M90542	Complete genome
Cauliflower mosaic virus (CaMV)	Xinjang	AF140604	Complete genome
Cauliflower mosaic virus (CaMV)	NY8153	M90541	Complete genome
Cauliflower mosaic virus (CaMV)	CMV	M90543	Complete genome
Cauliflower mosaic virus (CaMV)	B29	X79465	Complete genome
Figwart mosaic virus(FMV)	Unknown	NC-003554	Complete genome
Dahlia mosaic virus (DMV)	Unknown	AY291588	Coat protein
Dahlia mosaic virus (DMV)	Holand	EU090955	Coat protein
Dahlia mosaic virus (DMV)	Holand	EU090952	Movement protein
Dahlia mosaic virus (DMV)	D10	HQ416675	Movement protein
Strawberry vein banding virus (SVBV)	Unknown	NC-001725	Complete genome
(Mirabilis mosaic virus (MiMV)	Unknown	NC-004036	Complete genome
Blueberry red rigspot virus (BbRSV)	Unknown	NC-003138	Complete genome
Cestrum yellow leaf curling virus (CYLCV)	Unknown	NC-004324	Complete genome
Peanut chlorotic streak virus (PCSV)	Unknown	NC-001634	Complete genome

نتایج و بحث

شناسایی ویروس در آزمون الایزای غیر مستقیم

از بین نمونه های مثبت در دو منطقه که از نظر جغرافیایی و آب و هوایی کاملا متمایز بودند، دو نمونه با بیشترین غلظت ویروس (OD=2.5)، به عنوان نماینده ای از دو منطقه (استان خراسان رضوی و مرکزی) جهت انجام مطالعات تکمیلی انتخاب شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

به منظور شناسایی سریع و دقیق علاوه بر روش سرولوژیکی، از واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده گردید. DNA کل از نمونه های آلوده به ویروس، استخراج شده و با استفاده از آغازگرهای IBD و IBU (جدول 1) قطعه ای در حدود bp 1500 مربوط به ژن کدکننده اینکلوژن بادی در جدایه های دارای آلودگی از محلات (CERV-M) و چناران (CERV-Ch) تکثیر گردید که با نتایج ریخی و همکاران (Raikhy et al., 2006) یکسان بود (شکل1). شناسایی ویروس خراشک حلقوی میخک با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز با موفقیت صورت گرفت. آغازگرهای اختصاصی IBU/IBD قادر به شناسایی ویروس CERV در عصاره گیاه آلوده بوده و کاملاً اختصاصی عمل کردند، بطوری که با وجود استخراج DNA کل از بافت گیاه، پرایمرهای مربوطه باعث تکثیر ترادف‌های مشابه در گیاه نشدند. عدم تکثیر هیچ قطعه‌ای در نمونه شاهد منفی، این مطلب را تایید کرد

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز 5/1% و مشاهده باندی در محدوده تقریبی bp1500 مربوط به ژن کدکننده اینکلوژن بادی ویروس CERV، M-سایز مارکر bp100، N- شاهد منفی، 1- جدایه محلات، 2- جدایه چناران، 3- شاهد مثبت.

Figure 1- Gel electrophoresis of PCR products in agarose gel (1.5%) showing amplification of ~1.5 kb for inclusion body (IB) gene of CERV. Lane M, 100bp marker, lane N, negative control, lane 1, Mahallat isolate, lane 2, Chenaran isolate, lane 3, positive control.

آنالیز فیلوژنتیکی

پس از اخذ توالی، از هر دو خوانش رفت و برگشت مربوط به هر جدایه با استفاده از نرم افزار DNA Baser، دو توالی نهایی با شماره های دسترسی JX442756 و JX430793 به ترتیب مربوط به بخشی از ژن کد کننده اینکلوژن بادی در پایگاه اطلاعاتی NCBI به ثبت رسیدند. همردیف‌سازی چند‌گانه با استفاده از برنامه ClastalW، به ترتیب برای توالی‌های نوکلئوتیدی و توالی‌های آمینواسیدی جدایه های مورد بررسی (جدایه چناران و محلات) با سایر جدایه‌های مربوط به این ویروس (جدایه هلند و هند) و برخی دیگر از ویروس‌های خانواده Caulimoviridae انجام گرفت (جدول 2). علاوه بر مقایسه توالی نوکلئوتیدی (nt) کدکننده بین جدایه‌های مختلف CERV با هم و با دیگر کائولیموویروس‌ها، مقایسه در سطح توالی‌های آمینواسیدی (aa) نیز انجام گرفت (جدول 3).

جدول 3- درصد شباهت نوکلئوتیدی (اعداد بالای قطر) و آمینواسیدی (اعداد زیر قطر) بین ترادف‌های ژن اینکلوژن بادی مربوط به جدایه‌های ایرانی CERV با دیگر کائولیموویروس ها.

Table 3- Percent nucleotide (above diagonal) and amino acid (below diagonal) sequence similarities between inclusion body gene of different caulimoviruses inclusive of Iranian isolate.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
BbRSV	x	33.5	35.9	34.8	35.8	35.6	46.7	30.1	30.7	33.2	53.2	32.3
CaMV	9.5	x	52.6	51.9	52.4	52.4	31.2	39.9	40	40.9	31.3	37.5
CERV-Mahallat	10.9	30.4	x	90.4	99.4	99.2	30.7	41.1	40.2	41.9	33.7	41.5
CERV-Holland	11.6	30.4	93.8	x	90.4	90	30.7	40.7	40.7	41.1	33.5	41.3
CERV-India	10.9	30.4	100	93.8	x	99.1	30.5	40.9	39.8	41.9	33.3	40.9
CERV-Chenaran	10.9	30.4	98.4	92.2	98.4	x	30.7	41.3	40.4	42.5	32.9	41.3
CYLCV	22.1	5.6	9.3	10.1	9.3	9.3	x	27.7	29.2	30.9	44	27.1
DMV	11.2	15.3	23.4	23.4	23.4	24.2	12.8	x	47	63.2	28.7	43.4
FMV	18.4	18.5	18.7	20.3	18.7	19.5	11.2	21.8	x	48.2	31.1	42.2
MiMV	10.4	14.5	18.5	19.4	18.5	19.4	9.6	50.4	21	x	28.7	42.6
PCSV	18.3	7.9	11.6	12.4	11.6	12.4	17.4	11.2	8.8	7.2	x	33.5
SVBV	7.9	13.6	16.1	14.5	16.1	16.9	7.9	17.6	13.6	18.4	7.1	x

ترادف مربوط به این ژن در دو جدایه ایرانی این ویروس (JX442756 و JX430793) به میزان 2/92% شباهت در سطح نوکلئوتیدی و4/98% شباهت در سطح آمینواسیدی با یکدیگر نشان دادند. جدایه های ایرانی به میزان 4/90-90% (در سطح نوکلئوتیدی) و 8/93-2/92% (در سطح آمینواسیدی) با جدایه هلند و به میزان 4/99-1/99% (در سطح نوکلئوتیدی) و 100-4/98% (در سطح آمینواسیدی) با جدایه هند شباهت نشان دادند. زمانی که ORF VI جدایه های ویروس CERV با دیگر Caulimovirus مقایسه شد، بیشترین شباهت را در دو سطح آمینواسیدی (4/30%) و نوکلئوتیدی (4/52-9/51%) با ویروس موزاییک گل کلم (‌Cauliflower mosaic virus, CaMV) نشان دادند. مقایسه Caulimovirus های مختلف با یکدیگر نشان داد که بیشترین میزان شباهت در هر دو سطح (آمینواسیدی و نوکلئوتیدی) بین دو ویروس DMV و MiMV (به ترتیب 4/50 % و 2/63%) وجود دارد. همچنین کمترین میزان تشابه آمینواسیدی به مقدار 6/13% بین SVBV و CaMV و نیز SVBVو FMV نشان داده شد. نتایج مطالعات قبلی (Ashnayi et al., 2010) بر روی نواحی حفاظت شده از ژنوم ویروس نظیر ژن پروتئین پوششی و ژن پروتئین حرکتی نشان داد که در این نواحی میزان مشابهت بین کائولیموویروس ها خصوصا در سطح آمینواسیدی رقم قابل ملاحظه ای (1/53-1/60%) بوده، حال آنکه در ژن کدکننده اینکلوژن بادی (ORF VI) این مقدار تنها 1/7- 4/30% می باشد که این مطلب با نتایج (Raikhy et al., 2006; Hull & Donson, 1981) مطابقت دارد. آنالیز فیلوژنتیکی بر‌اساس ژن اینکلوژن بادی (IB) پس از هم ‌ردیف‌سازی چند‌‌گانه توالی‌های نوکلئوتیدی جدایه‌های CERV با برخی از ویروس‌های Caulimoviridae با استفاده از نرم‌افزار MEGA 5 و به روش Neighbour joining، با 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap انجام شد (شکل 2). درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده، دو گروه اصلی را تشکیل داد. گروهI شامل تمام ویروس‌های جنس Caulimovirus بوده و گروه II شامل ویروس‌های جنس Soymovirus می‌باشد. در میان گروه I ویروس موزاییک گل کلم Cauliflower mosaic virus,CaMV) ) بیشترین نزدیکی را با جدایه‌های CERV نشان دادند که با نتایج ریخی و همکاران (Raikhy et al. 2006) مطابقت دارد.از بین دو جدایه ی ایرانی ویروس، جدایه محلات بیشترین شباهت را (100% شباهت در سطح آمینواسیدی و 4/99% شباهت در سطح نوکلئوتیدی) با جدایه هند نشان داد و احتمال آن می رود که این جدایه از کشور هند منشاء گرفته باشد. همچنین در بین جدایه های ویروس، بیشترین تغییرات آمینواسیدی و کمترین شباهت در جدایه هلند مشاهده گردید.

شکل 2- درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن کدکننده اینکلوژن بادی CERV، با استفاده از نرم افزار MEGA 5 به روش Neighbor joining (bootstrap- × 1000) (جدایه های توالی یابی شده با علامت ● مشخص شده اند و جهت نام گسترده هر ویروس به جدول 2 رجوع شود).

Figure 2- Phylogenetic tree drawn on the basis of nucleotide sequence of inclusion body gene of CERV, by using MEGA 5 software, neighbor-joining method (bootstrap 1000) (The isolates which have been sequenced have been marked with ● and for extent virus names refer to table 2).

هم ترازی چندگانه بین توالی آمینواسیدی جدایه های ایرانی با دو جدایه هند و هلند، نشان دهنده تغییراتی در موقعیت های خاصی از ژن اینکلوژن بادی بوده و نشان می دهد در بین جدایه های CERV بیشترین تغییرات آمینواسیدی مربوط به جدایه هلند و کمترین این تغییرات مربوط به جدایه هند می باشد (جدول 4). وجود این تغییرات آمینواسیدی احتمالا بدلیل وقوع موتاسیون در توالی نوکلئوتیدی می باشد، که البته گاهی این موتاسیون بصورت حذف یا افزودن یک یا چند نوکلئوتید بوده، که چنانچه مضربی از سه نوکلئوتید باشد، قاب خواندنی دست نخورده مانده و یک یا چند اسید آمینه افزوده[9]یا حذف[10] می شود (Raikhy et al., 2006; Nassaj Hoseini & Shamsbakhsh, 2010). بطوری که وقوع دو موتاسیون از نوع insertion در دو موقعیت از جدایه محلات ویروس CERV قابل تشخیص است (شکل 3). اولین موقعیت بصورت) E[11] (T[12] در موقعیت 377 و 378 ژن و دومین موقعیت بصورت (ET) در فاصله 437 و 438 ژن مشخص شد.

شکل 3- هم‌ ردیف‌سازی چند‌گانه ترادف‌های آمینواسیدی ژن اینکلوژن بادی جدایه‌های CERV که توسط نرم افزار Bioedit ترسیم شده است.

Figure 3- Multiple alignment of amino acid sequences drawn on the basis of inclusion body gene of isolates of CERV by Bioedit software.

مطالعه حاضر که اولین مطالعه مولکولی بر روی تنوع این ویروس در ایران می‌باشد، به هدف بررسی، بر روی بخشی از ژن کدکننده اینکلوژن بادی که باعث تنوع در این گروه می شود، انجام گرفت. مطالعات قبلی (Ashnayi et al., 2010) نشان داد که حفاظت شدگی بالایی در ناحیه پوشش پروتئینی جدایه های CERV وجود دارد، این در حالی است که در مطالعه حاضر ژن کدکننده اینکلوژن بادی، حفاظت شدگی پایینی در ترادف این ژن آشکار کرد که این مطلب با نتایج ریخی و همکاران (Raikhy et al., 2006) مطابقت نشان داد.

جدول 4- تغییرات آمینواسیدی در موقعیت‌های مختلف ژن کدکننده اینکلوژن بادی از جدایه های CERV گزارش شده از ایران، هند و هلند (اسیدآمینه های متفاوت در هر موقعیت با حروف سیاه مشخص شده است).

Table 4- Changes in amino acid at different positions of inclusion body gene encoded by CERV isolates reported from Iran, India and Holland (Different amino acids in any position have been showed in bold).

موقعیت روی ژن	جدایه هند CERV	جدایه هلند CERV	جدایه چناران CERV	جدایه محلات CERV
Position in gene	CERV_India	CERV_Holland	CERV_Chenaran	CERV_Mahallat
311	Prolineپرولین	Leucineلوسین	Leucineلوسین	Leucineلوسین
312	Arginineآرژنین	Lysineلیزین	Lysineلیزین	Lysineلیزین
334	Isoleucineایزولوسین	Isoleucineایزولوسین	Tyrosineتیروزین	Isoleucineایزولوسین
345	Histidineهیستیدین	تریپتوفانTryptophan	Histidineهیستیدین	Histidineهیستیدین
351	Leucineلوسین	سرین Serine	Leucineلوسین	Leucineلوسین
362	Tyrosineتیروزین	Isoleucineایزولوسین	Tyrosineتیروزین	Tyrosineتیروزین
378	------------	------------	------------	ترئونینThreonine
379	------------	------------	------------	گلوتامیک اسید Glutamic acid
381	Threonineترئونین	Tyrosineتیروزین	Threonineترئونین	Threonineترئونین
382	Isoleucineایزولوسین	Tyrosineتیروزین	Isoleucineایزولوسین	Isoleucineایزولوسین
384	Arginineآرژنین	Lysineلیزین	Arginineآرژنین	Arginineآرژنین
389	Asparagineآسپاراژین	گلایسین Glysine	Asparagineآسپاراژین	Asparagine آسپاراژین
390	Isoleucineایزولوسین	Isoleucineایزولوسین	Tyrosineتیروزین	Isoleucineایزولوسین
393	Aspartic acidآسپارتیک اسید	گلوتامیک اسیدGlutamic acid	Aspartic acidآسپارتیک اسید	Aspartic acid آسپارتیک اسید
416	Serineسرین	سیستئینCysteine	Serineسرین	Serineسرین
425	Serineسرین	Serineسرین	Asparagineآسپاراژین	Serineسرین
437	------------	------------	------------	گلوتامیک اسید Glutamic acid
438	------------	------------	------------	ترئونینThreonine
481	Alanineآلانین	Threonineترئونین	Alanineآلانین	Alanineآلانین

منابع

Ashnayi M, Jafarpour B, Malekzadeh Shafaroudi S, Mirshamsi A (2010). Nucleotide sequence comparison of the coat protein gene and movement protein gene of Khorasan isolate of carnation etched ring virus with the other isolate of Genbank. proc. Of 19^th Iranian plant protection congress. Volume II, July- Aug. 31-3, 2010. Tehran, Iran. pp, 744.

Ashnayi M, Jafarpour B, Malekzadeh Shafaroudi S, Mirshamsi A, Heydarinia Z (2012). Detection of Carnation etched ring virus in greenhouses of Khorasan Razavi and Northern Khorasan provinces by ELISA and PCR. Journal of plant protection 26: 171-177.

Bayat H (2008). Serological detection and prevalence of some carnation viruses in greenhouses of carnation in mahallat. proc. Of 18^th Iranian plant protection congress. Volume II, Aug. 24-27, 2008. Hamedan, Iran. pp, 536.

Buchen-Osmond C (2006). Carnation etched ring virus. Retrieved Novamber 7, 2010. from http://www.ictvdb.org/ICTVdB/00.015.0.01.003.htm.

Chenault K D, Melcher U (1994). Phylogenetic relationships reveal recombination among isolates of cauliflower mosaic virus. Journal of Molecular Evolution 39: 496-505.

Fujisawa I, Rubio-Huertos M, Matsui C (1971). Incorporation of thymidine-H into Carnation etched ring virus. Plant Pathology 61: 681- 684.

Hull R, Sadler J, Longstaff M (1986). The sequence of Carnation etched ring virus DNA: comparison with Cauliflower mosaic virus and retroviruses. European Molecular Biology Organization 5: 3083- 3090.

Hull R, Donson J (1981). Physical mapping of the DNAs of Carnation etched ring and Figwort mosaic viruses. Gene Virology 60: 125-134.

Lawson R. H, Hearon S (1980). Carnation etched ring virus inclusion: serology and ultrastructure of alkaline-treated inclusions. Plant Pathology 70:327- 332.

Martin R R (1990). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens, In: ELISA methods for plant viruses. The American phytopathological society, USA.

Nassaj Hoseini M, Shamsbakhsh M (2010). Phylogenetic analysis methods. Haghshenass publication, Rasht, pp, 5.

Raikhy G, Hallan V, Kulshrestha S, Ram R, Zaidi A A (2006). Complete nucleotide sequence of an Indian isolate of Carnation etched ring virus and its homology with other caulimoviruses. Journal of Research Articles 90:176- 187.

Rubio- Huertos M, Castro S (1972). Electron microscopy of the formation of Carnation etched ring virus intracellular inclusion bodies. Gene Virology 15: 257- 260.

Sanger M, Daubert S, Goodman R (1991). The regions of sequence variation in caulimovirus gene VI. Journal of virology 182: 830-834.

Zhang Y P, Uyemoto J K, Kirkpatrick B C (1998). A small-scale procedure for extracting nucleic acids from woody plants infected with various phytopathogens for PCR assay. Virology Method 71: 45-50.

Phylogenetic analysis and sequencing of inclusion body gene of two Iranian isolates of Carnation etched ring virus

Ashnayi M.*¹, Jafarpour B.², Malekzadeh-Shafaroudi S.³

^{1, 2} MSc. Student and Professor, Department of Plant Protection, College of agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Respectively.

³ Assistant Professor, Department of Biotechnology and plant breeding, College of agriculture, Ferdowsi University of Mashhad.

Abstract

Carnation etched ring virus (CERV) is a member of family caulimoviridae, caulimovirus genus. The virus is the second important virus after Carnation mottle virus to infect carnation.

In order to investigate the presence of this virus in greenhouses carnation plants of Khorasan Razavi (Mashhad) and Markazi (Mahallat) provinces samples which have been showed the symptoms were collected. Primary identification of CERV tested by Indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Total DNA was extracted from fresh young leaf tissue by CTAB buffer. Polymerase Chain Reaction (PCR) was carried out using specific primers and fragments of 1500 bp were amplified by PCR. Comparisons were made between these isolates and related sequences of other caulimoviruses available in Genbank. The phylogenetic tree of inclusion body (IB) gene of CERV was drown, by MEGA5 software using Neighbor joining method. The results showed that the maximum similarity of Mahallat isolate was 99.4% to Indian isolate (AJ853858). Comparision of nucleotide sequences was shown the homology of two Iranian isolates together (92.2%) and with the other isolates (90-99.4%). Maximum amino acid changes were indicated in Holland isolate. Although there was a significant difference (60.6-92.9%) in amino acid level between the sequences of the IB region of different caulimovirus.

Keywords: Phylogenetic analysis, Polymerase chain reaction, Carnation etched ring virus.

* نویسنده مسئول: مهناز آشنائی تلفن: 09155515142 E-mail: m.ashnayi64@gmail.com

[1] Inclusion body, IB

[2] Viroplasm

[3] Indirect-Enzyme linked immunosorbent assay (Indirect-ELISA)

[4] Polymerase chain reaction, PCR

[5] Cetyltrimethyl ammonium bromide

[6] Genet bio

[7] Basic Local Alingment Search Tool

[8] Multiple sequence alignment

[9] Insertion

[10] Deletion

[11] Glutamic acid

[12] Threonine

* Corresponding Author: Ashnayi M. Tel: 09155515142 E-mail: m.ashnayi64@gmail.com

مراجع