بر همکنش فرم نوترکیب تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به NADPH (NTR ) از گیاه برنج با تیوردوکسین(Trx) از دو منشا گیاهی و باکتریایی

هدیه اسلام‎پناه¹، آذر شاه‌پیری*²، احسان شیخ الاسلام³

^{3 و1} کارشناس ارشد گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.

² استاد‌یار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.

تاریخ دریافت: 31/05/1391، تاریخ پذیرش: 06/04/1392

چکیده

حفظ تعادل شرایط اکسیداسیون- احیا (ردوکس) در سلول برای انجام متابولیسم‎های مختلف سلولی و فعالیت مسیرهای انتقال پیام بسیار حیاتی است. در موجودات زنده مکانیسم‎های مختلف مولکولی در حفظ این تعادل نقش دارند. سیستم تیوردوکسین وابسته بهNADPH سیستمی متشکل از تیوردوکسین ردوکتاز وابسته بهNADPH ، تیوردوکسین و NADPH می‎باشد که نقش مهمی در انتقال الکترون از NADPH به باندهای دی‎سولفیدی در بسیاری از پروتئین‎های سلولی دارد و بدین ترتیب با تنظیم تبادلات تیول-دی سولفید درحفظ تعادل ردوکس سلولی دخالت دارد. در تحقیق حاضر توالی ژن کد‎کننده‎ی یکی از ایزوفرم‎های  NTRاز گیاه برنج  که قبلا OsNTRB نامیده شده بود، در ناقل بیانی pET28a به همراه شریک الحاقی His₆-tag همسانه‎سازی و پلاسمید نوترکیب به میزبان بیانی اشرشیا کلی ((E.coli سویه Rosetta (DE3) منتقل شد. مقدار قابل توجهی از فرم نوترکیب این پروتئین پس از القا محیط کشت باکتری با IPTG تولید و با استفاده از کروماتوگرافی جذبی خالص‎سازی شد. بیان هترولوگ و خالص‎سازی فرم نوترکیب OsNTRB امکان بررسی برهمکنش این پروتئین را با دو تیوردوکسین موجود از دو منشا مختلف گیاه جو (HvTrxh1) و باکتری اشرشیاکلی ( (EcTrxفراهم ساخت. نتایج نشان داد فرم نوترکیب OsNTRB در محیط این ویترو فعال بوده و در حضور NADPH می‎تواند هر دو تیوردوکسین گیاهی و باکتریایی را احیا نماید. با این حال سرعت برهمکنش آن با تیوردوکسین HvTrxh1 بسیار بالاتر از   EcTrxبوده و تفاوت قابل توجهی نشان داد.

واژه های کلیدی: برنج ، تیوردوکسین ردوکتاز، تیوردوکسین، پروتئین نوترکیب.

مقدمه

تیوردوکسین‌(Trx)‎ها ، پروتئین‎های کوچکی با وزن مولکولی 14-12 کیلودالتون هستند، که به واسطه وجود دو سیستئین در جایگاه فعال خود (WCG/PPC) در احیاء باند‌های دی‎سولفیدی پروتئین‌‌های هدف شرکت‌کننده در فرآیندهای مختلف سلولی نقش مهمی را در سلول ایفا می‌کنند. به عنوان مثال با دادن الکترون به پراکسی‎ردوکسین‎ها به عنوان یکی از پروتئین‎های هدف نقش مهمی در حذف سمیت پراکسید هیدروژن در سلول دارند (Holmgren, 1985; Chae et al., 1999; Elias et al., 2000)). در گیاهان بر خلاف پستانداران، باکتری‎ها و قارچ‎ها ایزوفرم‎های مختلفی از Trx وجود دارد که در قسمت‎های مختلف سلولی مانند کلروپلاست، میتوکندری، سیتوزول و هسته پراکندهاند (Gelhaye et. al., 2005; Meyer et al., 2005). ایزوفرم‎های مختلف Trx، بر اساس ساختمان اولیه و محل استقرار در شش زیر خانواده گروه‎بندی شده‌اند. Trx‎های f، m ، x و y در کلروپلاست ، Trx o در میتوکندری وTrx h در سیتوزول قرار ­دارند (Lemaire et al., 2001; Laloi et al., 2007). با این حالTrx های h در قسمتهای دیگر سلولی مانند هسته، شبکه آندوپلاسمی، میتوکندری و Trxهای f و m نیز در بافتهای غیر فتوسنتتیک شناسایی شده‎اندGelhaye et al., 2005) ). باند دی‎سولفیدی در جایگاه فعال Trxها با سیستم‎های دهنده الکترونی مختلفی احیا میشود. در پلاستیدها، احیائ Trxها ( y، f ،m  ، x) وابسته به نور و به واسطه آنزیم فردوکسین- تیوردوکسین ردوکتاز (FTR) می‎باشد (Buchanan et al., 2002). در خارج از کلروپلاست، Trxهای o و h همانند Trx در باکتری‎ها ، قارچ‎ها و پستانداران به وسیله NADPH به واسطه آنزیم تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به NADPH (NTR) احیا می‎شوند (Dai et al., 1996; Arner et al., 1999; Waksman et al., 1994). ‌‎NTR ها آنزیمهای متعلق به خانواده فلاووپروتئین اکسیدوردوکتازها هستند که ‌شامل پروتئین‎هایی مانند لیپوآمید_دهیدروژناز، گلوتاتیون ردوکتاز و مرکوریک یون ردوکتاز می‌باشند (Mustachich & Powis, 2000).   ‎ NTR ها پروتئین‎هایی دارای دو زیر واحد یکسان می باشند که به دو دسته با وزن مولکولی پایین و وزن مولکولی بالا تقسیم می‎شوند. NTR ها با وزن مولکولی بالا در موجوداتی مانند پستانداران، پرندگان وحشرات یافت می‌شوند که هر ‌زیرواحد دارای وزن مولکولی حدودا 55 کیلودالتون میباشد (Arner et al., 1999).‎ NTR ها در گیاهان شباهت بیشتری به NTR موجود در پروکاریوت‎ها و قارچها دارند و در گروه NTR با وزن مولکولی پایین قرار می‎گیرند. اعضای این خانواده، پروتئینهایی با دو زیر واحد یکسان حاوی 310-330 آمینو‎اسید و وزن مولکولی حدودا 35 کیلو‎دالتون هستند که هر زیر واحد دارای دو دومین، یکی متصل به NADPH و دیگری متصل به  FADHو یک جایگاه فعال CXXC جهت احیا باندهای دی‎سولفیدی میباشد (Dai et al., 1996; Marcos et al., 2010). در سلول در هنگام برهمکنش NTR با Trx، الکترون‎ها از NADPH از طریقFADH  به جایگاه فعال NTR منتقل و در نهایت با انتقال به باند دی سولقیدی موجود در جایگاه فعال Trx h باعث احیای آن می‎شوند.

یکی از سوالاتی که در مورد سیستم NTR/Trx مطرح می‎باشد این است که آیا آنزیم NTR به شکل یکسانی با Trx h ها‎ی مختلف بر‎همکنش دارد و یا این برهمکنش تحت تاثیر ساختمان تیوردوکسین قرار می‌گیرد؟ جهت پاسخ به این سوال در این تحقیق ژن کد‎کننده یکی از ایزوفرم‎های  NTR(OsNTRB) از گیاه برنج که قبلا جدا‎سازی و همسانه‌‌‌‌‌سازی شده بود (Eslampanah et al., 2012) به باکتری اشرشیاکلی (E. coli ) ، منتقل و فرم نوترکیب این آنزیم تولید و خالص‎سازی شد. تولید فرم نوترکیب NTR از گیاه برنج امکان مقایسه برهمکنش این آنزیم را با فرم‎های نوترکیب  Trxموجود با منشا گیاهی مانند Trx h از گیاه جو ((HvTrxh1 و همچنینTrx  از باکتری اشرشیاکلی (EcTrx) را در محیط این ویترو فراهم ساخت.

مواد و روش ها

آنالیز توالی

توالی آمینواسیدی OsNTRB واقع بر لوکوس Os02g48290 مرتبط با گیاه برنج، درپایگاه اطلاعاتیRice genome annotation (http://rice.plantbiology.msu.edu) مورد جستجو قرار گرفت . توالی پروتئینی دیگر NTR‎های گیاهی با استفاده از نرم‌افزار BlastP در پایگاه اطلاعاتی NCBI به‎دست آمد. همردیف‎‎سازی NTRهای گیاهی با استفاده از نرم‌افزارClustalW2 انجام شد.

بیان هترولوگ NTR در باکتری E. coli

به منظور بیان پروتئین نوترکیب، ابتدا پلاسمید نوترکیب  pJET-OsNTRBحاوی ژن کد‎کننده OsNTR (Eslampanah et al., 2012)، با استفاده از آنزیم های برشی EcoRI و HindIII هضم شد و قطعه OsNTR به کمک آنزیم T4DNA- Ligase در دمای 22 درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت و 30 دقیقه، به دو انتهای پلاسمید بیانی pET28a که با استفاده از همین آنزیم های برشی خطی شده بود، متصل شد. محصول الحاق با استفاده از روش الکتروپوریشن در دستگاه Electeroporator به سلولهای مستعد شدهDH5α  منتقل و بر روی محیط کشت  جامد حاوی کانامایسین کشت شد. با استفاده از روش غربالگری سریع، کلون‎های حاوی قطعه ژنی مورد نظر جداسازی و به منظور تایید حضور قطعه همسانه‎سازی شده، استخراج پلاسمید از کلونی‎های مورد نظر انجام و هضم آنزیمی با دو آنزیم برشی EcoRI و HindIII صورت گرفت. در نهایت نمونه‎ها جهت توالی‎یابی فرستاده شدند و از آغازگرهای رفت و برگشتT7  برای توالی‎یابی آنها  استفاده ­شد.

پس از تایید توالی، پلاسمید‎های نوترکیب به باکتری E. coli سویه Rosetta (DE3) منتقل شدند. با توجه به وجود ژن مقاوم به آنتی بیوتیک کانامایسین بر روی پلاسمید pET28a و همچنین مقاومت باکتری‎های Rosetta (DE3) به آنتی بیوتیک کلرامفنیکل، سویه‎های Rosetta (DE3) حاوی پلاسمید‎های نوترکیب بر روی محیط کشت حاوی 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر کانامایسین و 5 میکروگرم بر میلی‎لیتر کلرامفنیکل قادر به رشد بودند. به منظور تولید پروتئین از این سویه‎های نوترکیب، سلول‌‌‌‌‌‌‌های باکتری در دمای 37 درجه سانتی‎گراد در محیط کشت LB حاوی این دو آنتی‎بیوتیک رشد داده شدند. وقتی ₆₅₀ A به 6/0 رسید، 100 میکرومولار IPTG به عنوان القا کننده به محیط کشت اضافه شد و کشت باکتریایی به مدت 4 ساعت دیگر ادامه یافت. سپس سلول‎های باکتری با استفاده از سانتریفیوژ رسوب داده شد و در دمای 20- درجه سانتی‎گراد نگهداری شدند.

جداسازی فاز محلول و خالص‎سازی با استفاده از کروماتوگرافی جذبی

جهت استخراج پروتئین‎های فاز محلول، به ازای رسوب 50 میلی‎لیتری از 250 میلی‌لیتر کشت القاء شده‌ی باکتری، 2500 میکرولیتر ازبافرتریس (10 میلی‎مولار تریس-اسید کلریدریک ، 8 =pH) به رسوب داخل لوله‎های اپندورف50 میلی‎لیتری اضافه شد و رسوب به طور کامل حل گردید. دیواره‌ی باکتری‌ها با استفاده از دستگاه اولتراسونیک (مدل .UP50H ساخت شرکت Hielsher) شکسته ‌شد و در زمان‌های مختلف یک قطره از سوسپانسیون باکتری زیر میکروسکوپ بررسی‌شد تا تقریباً از شکست دیواره‌ی همه‌ِ باکتری‌ها اطمینان حاصل‎‌گردد. لولههای اپندورف به مدت 15 دقیقه در 12000 دور در دقیقه (g18514) سانتریفوژ شدند. فاز بالا به یک لوله‌ی اپندورف 25 میلی‎لیتری تازه منتقل ‌شد و به منظور انجام مراحل بعدی در دمای C°20- نگهداری ‌شدند.

خالص‎سازی پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی جذبی انجام شد. بدین منظور پروتئین محلول استخراج شده از ستون‎های His-Trap HP (ساخت شرکت GE Healthcare ) که از قبل با استفاده از بافر A بارگذاری (ایمیدازول 10 میلی مولار، کلرید سدیم 500 میلی مولار و 30 میلی مولار تریس- اسید کلریدریک، 8 =PH) به تعادل رسیده بودند، عبور داده شدند. جهت شستشوی پروتئین های باند شده غیر اخنصاصی میزان 10 میلی‎لیتر از مخلوط بافر B فیلتر شده سرد شامل (ایمیدازول 400 میلی‎مولار، کلرید سدیم 500 میلی‎مولار و 30 میلی‎مولار تریس- اسید کلریدریک، 8 =PH) و بافرA  فیلتر شده سرد با نسبت 10% بافرB  و 90% بافر A   بر روی ستون بارگذاری گردید و اجازه داده شد تا از ستون خارج گردد. سپس جهت جداسازی پروتئین هدف 10 میلی‎لیتر بافری حاوی 40% بافر B و 60 % بافرA بر روی ستون بارگذاری گردید و هر میلی لیتر خروجی ستون در لوله­های اپندورف 5/1 میلیی لیتری لوله های اپندورف بر روی یخ در دمای C°4 نگهداری شدند. کیفیت خلوص پروتئین خارج شده در ویال‌‌ها با استفاده از SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. غلظت پروتئین نوترکیب His₆-ONTRB با استفاده از روش تعیین جذب در طول موج 280 نانومتر و قانون بیر- لمبرت تعیین شد.

بارگذاری نمونه‎ها بر روی ژل SDS-PAGE

به منظور ردیابی پروتئین‎ نوترکیب مورد نظر، نمونه‎ها بر روی ژل SDS-PAGE بار‎گذاری شدند. بافر بارگذاری X5 (313 میلی‎مولار تریس- اسید کلریدریک (8/6 pH=) ،SDS  10 درصد، گلیسرول 50 درصد، برومو فنول بلو 05/0 درصد) و 4 میکرولیتر دی‎تیو‎تریتول (DTT) X20 با هریک از نمونه‎ها مخلوط گردید و به مدت 10 دقیقه در C°95 جوشانده ‌شدند. سپس نمونه‎ها به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ گردیدند و 14 میکرولیتر از هر نمونه در چاهک‎ها تزریق ‌شد. رنگ آمیزی ژل با استفاده از روش کوماسی بلو 250R- صورت گرفت   (Sambrook et al., 2001).

تعیین سرعت واکنشOsNTRB  با  Trxدر حضور NADPH

مخلوط واکنش در حجم 300 میکرولیتر شامل 100 میلی مولار پتاسیم فسفات (5/7(pH= ، 2/0 میلی مولار EDTA، 1/.0 میلی‎گرم بر میلی‎لیتر بوین سرم آلبومین (BSA)، 200 میکرومولار  DTNB، 200 میکرومولار            NADPHو غلظت 5 میکرومولار از هر کدام از پروتئین های نوترکیب  (Shahpiri et al.2008) HvTrxh1 و EcTrx (خریداری شده از شرکت سیگما) بود. واکنش‎ها با اضافه کردن 40 نانومولار OsNTRBآغاز شد و مقدار جذب نوری در طول موج 415 نانومتربه مدت 30 دقیقه با اسپکتروفتومتر (Beckman DU 530) اندازه گیری و ثبت شد. لازم به ذکر است یک واکنش حاوی تمام ترکیبات ذکر شده در واکنش بدون حضور تیوردوکسین به عنوان واکنش کنترل در نظر گرفته شد.

نتایج

آنالیز توالی آمینواسیدی OsNTRB

توالی آمینواسیدی OsNTRB از 331 آمینواسید تشکیل شده است و دارای وزن مولکولی 67/34 کیلودالتون 18/6= pI می‌باشد. OsNTRB با یکی از ایزوفرم‎های NTR از گیاه جو (HvNTR2) که به عنوان یک ایزوفرم میتوکندریایی/ سیتوپلاسمی قبلا مشخصه‎یابی شده است (Shahpiri et al., 2008)، دارای 91 % شباهت در توالی آمینواسیدی است. در توالیOsNTRB  همانند دیگر ایزوفرم‎های NTR از نوع میتوکندریایی/ سیتوپلاسمی، موتیف‌های متصل ‌شونده به FAD به صورت توالی GXGXA و TXXXXVFAAGD و موتیف متصل ‌شونده به NADPH با توالی  GXGXXA مشاهده می‌شود. منطقه جایگاه ‌فعال نیز حاوی دو سیستئن با توالی CAVC می‎باشد (شکل 1). 

بیان هترولوگ OsNTRB در باکتری E. coli و خالص‎سازی پروتئین نوترکیب

توالی ژن کد کننده‌‌ی OsNTRB که از بافت ساقه گیاه برنج جداسازی و در پلاسمید pJET همسانه سازی شده بود (Eslampanah et al., 2012) و ناقل بیانی pET-28a(+)، هریک تحت واکنش هضمی با دو آنزیم برشی HindIII و EcoRI هضم ‌و خالص‎سازی شدند (شکل 2). پس از اتصال قطعهOsNTR  به ناقل بیانی (شکل 2) و تایید توالی ژنی همسانه‎سازی شده، دستواره مورد نظر به میزبان بیانی Rosetta (DE3) که از سویه‎های باکتری اشریشیا کلی است، منتقل گشت. پس از القای باکتری ها با IPTG، فاز محلول پروتئین از باکتری‎ها استخراج شد و آنالیز کل پروتئین محلول بر روی ژل SDS-PAGE صورت گرفت. قابل ذکر است که نمونه کنترل بدون تلقیح  IPTGدر کنار نمونه اصلی در نظرگرفته شد (شکل 3).

OsNTRB  MEGSAGAPLRTRVCIIGSGPSAHTAAIYAARAELKPVLFEGWLANDIAAGGQLTTTTDVE 60

HvNTR2  MEGSAAAPLRTRVCIIGSGPAAHTAAIYAARAELKPVLFEGWMANDIAAGGQLTTTTDVE 60

        *****.**************:*********************:*****************

OsNTRB  NFPGFPEGILGGELMDRCRAQSLRFGTSIISETVTAVDFSARPFRVASDSTTVLADAVVV120

HvNTR2  NFPGFPTGIMGIDLMDNCRAQSVRFGTNILSETVTEVDFSARPFRVTSDSTTVLADTVVV120

        ****** **:* :***.*****:****.*:***** **********:*********:***

OsNTRB  ATGAVARRLHFAGSDAYWNRGISACAVCDGAAPIFRNKPIAVIGGGDSAMEESNFLTKYG180

HvNTR2  ATGAVARRLYFSGSDTYWNRGISACAVCDGAAPIFRNKPIAVIGGGDSAMEEGNFLTKYG180

        *********:*:***:************************************.*******

OsNTRB  SHVYIIHRRNTFRASKIMQARALSNPKIQVFWDSEVVEAYGGEGGGPLAGVKVKNLVTGK240

HvNTR2  SQVYIIHRRNTFRASKIMQARALSNPKIQVVWDSEVVEAYGGAGGGPLAGVKVKNLVTGE240

        *:****************************.*********** ****************:

OsNTRB  ISDLQVSGLFFAIGHEPATKFLGGQLELDADGYVATKPGSTHTSVKGVFAAGDVQDKKYR300

HvNTR2  VSDLQVSGLFFAIGHEPATKFLNGQLELHADGYVATKPGSTHTSVEGVFAAGDVQDKKYR300

        :*********************.*****.****************:**************

OsNTRB  QAITAAGSGCMAALDAEHYLQEVGAQEGKAD 331

HvNTR2  QAITAAGSGCMAALDAEHYLQEVGAQVGKSD 331

        ************************** **:*

شکل 1- همردیف سازی توالی آمینو اسیدی دو NTR توع سیتوزول/ میتوکندری از گیاه برنج ((OsNTRB و جو(HvNTR2 ). جعبه 1 و4: موتیف اتصال FAD  جعبه 3: موتیف اتصال NADP  جعبه 2: موتیف مربوط به دو سیستئین در جایگاه فعال NTR.

Figure 1- Multiple alignment between cytoplasmic/mitochondrion type NTRs from rice (OsNTRB) and barley (HvNTR2). FAD-binding motifs (Box1 and Box4), NADP-binding motif (Box 3), and two Cys residues in the active site motif (Box 2).

با توجه به وجود منطقه کد‎کننده پلی هیستیدین ((His-tag در بالا دست جایگاه کلون‎سازی در پلاسمید pET28a پروتئین نوترکیب حاصل دارای دنباله پلی‌هیستیدین در انتهای آمینو می‌باشد. وزن مولکولی پیش‎بینی شده برای پروتئین‌های نوترکیب His-OsNTRB 49/38 کیلو دالتون و نقطه‌ی ایزوالکتریک آن 9/6 می‌باشد. وجود باند پلی پپتیدی با وزن مولکولی مورد نظر بر روی ژل، تولید پروتئین نوترکیب His-OsNTRB در مقایسه با سویه کنترل را تایید کرد (شکل 3).

خالص‎سازی پروتئین‌های نوترکیب از دیگر پروتئین‌های باکتری با استفاده از کروماتوگرافی جذبی بر روی ستون های حاوی رزین نیکل (Ni²⁺ (، فراهم گشت و سپس به منظور ارزیابی کیفیت خالص سازی، پروتئین پس از خالص‎سازی بر روی SDS-PAGE بارگذاری شد (شکل 3). عدم وجود باندهای اضافی نشان دهنده کیفیت بالای خالص‎سازی است.

به منظور تعیین غلظت پروتئین نوترکیب خالص شده، ابتدا میزان جذب نمونه پروتئینی در 280 نانومتر اندازه‎گیری شد و ضریب خاموشی مولی آن با استفاده از نرم افزار ProtParam در پایگاه اطلاعاتی Expassy محاسبه شد و نهایتا در فرمول بیر- لمبرت قرار داده شد . غلظت پروتئین نوترکیب 544/21 میکرومولار تخمین زده شد و میزان پروتئین خالص His-OsNTRB به دست آمده به ازای هر لیتر محیط کشت باکتری 5 میلی‎گرم بود.

برهمکنش OsNTRB با دو تیوردوکسین گیاهی و باکتریای

در سلول گیاهان الکترون ازNADPH  به NTR و سپس از NTR به Trx h انتقال می‎یابد. Trx h احیا شده متعاقبا" به عنوان یک عامل احیا‎کننده قادر به احیا کردن تعداد زیادی از پروتئین‌ها می باشد. هولمگرن در سال 1977 (Holmgren, 1977) نشان داد که در محیط این ویترو نیز در صورتی که آنزیم NTR با ِNADPH احیا گردد می‎تواند باعث احیای باند دی‎سولفیدی در جایگاه فعال Trx h گردد. با به کار بردن DTNB در واکنش به عنوان سوبسترای نهایی، Trx h احیا شده آن را احیا نموده و به TNB که یک ماده زرد رنگ است تبدیل می کند. این ماده زرد رنگ در طول موج 412 نانومتر بیشترین جذب را دارد. لذا با اندازه‌گیری میزان شدت رنگ زرد در طول موج412 نانومتر و با ثبت میزان جذب در هر دقیقه، نمودار میزان جذب در زمان را می توان رسم نمود.

شکل 2- آماده سازی قطعه OsNTRB و ناقل بیانی  pET-28aبه منظور همسانه سازی قطعه ORF در وکتور بیانی. 100 bp DNA Ladde :L  :A  ستون 1: قطعه ژن کد کننده   OsNTRBبه طول  bp1008 جدا شده از پلاسمید OsNTRB/pJET  پس از برش با آنزیم‎های HindIII و EcoRI. M :B: نشانگر مولکولی III،  ستون 1 : پلاسمید pET-28a استخراج‌شده از باکتری DH5α  ستون 2:پلاسمید بیانی pET-28a به طول  bp5379 هضم شده با دو آنزیم برشیEcoR I & Hind III. C:  تایید همسانه سازی ژن در پلاسمید pET-28a با استفاده از هضم آنزیمی pET-OsNTRB با آنزیم های HindIII و EcoRI  M: نشانگر مولکولی III   ستون 2: قطعه  OsNTRB به طول  bp1008 جدا شده از پلاسمید pET-OsNTRB پس از برش با آنزیم‎های HindIII و EcoRI  100 bp DNA Ladder : L

Figure 2- Preparation fragment containing gene encoding OsNTRB and Linear vector pET-28a. A: DNA Ladder 100 bp plus (L), Double digestion of pJET- OsNTRB with restriction enzymes Hind III & EcoRI (Lane 1). B: Molecular Marker III (M), Extracted Plasmid pET28a (Lane 1), Digested pET-28a with two restriction enzymes Hind III and I EcoRI (Lane 2). C: ‍‍Confirmation if cloning of gene in pET28a by cutting of pET-OsNTRB with EcoRI and HindIII. Molecular Marker III (M), Double digestion of pET-OsNTRB with restriction enzymes Hind III & EcoRI (Lane 1), DNA Ladder 100 bp plus (L).

شکل3- بررسی بیان و خالص سازی پروتیئن نوترکیب  OsNTRB بر روی ژل SDS-PAGE. M: مارکر پروتئینی چاهک1: پروتئین محلول استخراج شده بدون تلقیح IPTG  چاهک2 : پروتئین محلول استخراج شده پس از 4 ساعت تلقیح IPTG  چاهک 3: پروتین نوترکیب خالص شده His-OsNTRB

Figure 3- Analysis of expression and purification of recombinant OsNTRB by SDS-PAGE. Protein marker (M), Total soluble protein extracted from E. coli before addition of IPTG (lane1), Soluble extracted protein from E. coli 4 hours after addition of IPTG (lane 2), Purified His-OsNTRB (lane 3).

با اندازه گیری شیب خط می‌توان به سرعت اولیه واکنش NTR در برهمکنش با Trx h پی‌برد. در این تحقیق نیز سرعت بر همکنش OsNTRB با دو Trx h ، با استفاده از DTNB به عنوان سوبسترای نهایی برای Trx و همچنین NADPH به عنوان عامل احیا کننده مقایسه شد (شکل 4). یک واکنش حاوی NADPH، OsNTRBوDTNB  بدون حضور Trx، به عنوان واکنش کنترل در نظر گرفته شد. نتایج نشان داد که آنزیم OsNTR تولید شده در این تحقیق فعال بوده و قادر به احیای تیوردوکسین در محیط این ویترو می‎باشد. به طوریکه در مقایسه با نمونه ی کنترل، جذب در طول موج 415 نانومتر در هر دو واکنش افزایش پیدا کرد. با این حال سرعت واکنش OsNTRB با دو تیوردوکسین مختلف کاملا متفاوت بود. سرعت واکنش OsNTRB در واکنش با EcTrx و HvTrxh به ترتیب 006/0 و025/0  ∆412/minبود. بنابراین نتایج نشان می‎دهد که سرعت بر همکنش  NTRبا تیوردوکسین گیاهی به کار برده شده در این تجقیق بسیار بالاتر از سرعت برهمکنش با تیوردوکسین باکتریایی است. برعکس در مطالعه‎ای که قبلا صورت گرفته، نشان داده شده است که فرم نوترکیب NTR باکتری E. coli با Trx از باکتری E. coli با سرعت بالایی برهمکنش دارد (Miranda-Vizuete et al., 1997). بر اساس این نتایج به نظر می‌رسد که NTR از هر موجود زنده با Trx از آن موجود ویا موجودات خویشاوند برهمکنش بهتری در مقایسه با موجودات ناخویشاوند دارد.

بحث

سیستم NTR/Trx به عنوان سیستم ردوکس، نقش مهمی را در مسیرهای مختلف متابولیتی در پروکاریوت ها و یوکاریوت‎ها ایفا می‎کند و دردامنه وسیعی از واکنش‎های حیاتی سلول نقش دارد. چگونگی برهمکنش NTR و Trx با استفاده از ایجاد موتاسیون و جایگزینی آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال این پروتئین ها در باکتری E. coli و ارزیابی برهمکنش این دو پروتئین با استفاده از روش‎های کینتیک آنزیمی، مورد توجه محققان بسیاری قرار گرفته است. به طوریکه در مطالعه‎ای با جایگرینی یک سیستئین با سرین در جایگاه های فعال NTR و Trx از باکتری E. coli کمپلکسی از NTR-Trx با ایجاد یک باند دی سولفیدی دائمی بین آن‎ها ساخته شد و با استفاده از کریستالوگرافی ساختمان سوم این کمپلکس به دست آمد .(Wang et al., 1996; Lenon et al., 2000)  دستیابی به ساختمان سوم تا حدودی آمینواسیدهای در گیر در برهمکنش را شناسایی نمود.  تا کنون مطالعات صورت‎گرفته در این زمینه در گیاهان کمتر بوده است. تولید فرم نوترکیب دو ایزوفرم مختلف NTR از گیاه جو با درصد شباهت بیش از 80 % در توالی آمینواسیدی و همچنین دو ایزوفرم مختلف Trx h از همین گیاه با درصد شباهت 50 % در توالی، امکان برهمکنش ایزوفرم‎های مختلف NTR را با ایزوفرم‎های مختلف تیوردوکسین فراهم ساخت. پارامترهای کینتیکی به دست آمده نشان داد که علی‎رغم شباهت اندک دو ایزوفرم Trx h، هر دو ایزوفرم NTR سرعت و تمایل یکسانی در برهمکنش با هر دو Trx h از گیاه جو دارند  (Shahpiri et al., 2008). بر خلاف این تحقیق، در یونجه نتایج برهمکنش یکی از ایزوفرم‎های NTR با چندین ایزوفرم مختلف Trx h نشان داد که NTR در برهمکنش با ایزوفرم‎های مختلف سرعت متفاوتی دارد Renard et al., 2011)). در تحقیق حاضر فرم نوترکیب NTR از گیاه برنج تولید و برهمکنش آن با دو Trx از گیاه جو و باکتری اشرشیا کلی که فقط 22% شباهت در توالی آمینواسیدی آنها وجود داشت، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاکی از تفاوت معنی‎دار بین سرعت برهمکنش NTR با دو نوع  Trxبود. این نتیجه به خوبی نشان می‎دهد که NTR در برهمکنش با Trx، اختصاصی عمل می نماید و توالی  Trxدر برهمکنش این دو پروتئین تاثیر دارد. بر اساس ساختمان سوم به دست آمده از کمپلکس NTR-Trx از  E. coliبه نظر می‎رسد که آمینواسیدهای خاصی از این دو پروتئین درگیر در برهمکنش می‎باشند. با یافتن این آمینواسیدهای معادل در NTR و Trx‎های گیاهی، شاید بتوان پیش‎بینی نمود که یک NTR خاص گیاهی با کدام Trx برهمکنش بهتری دارد.