آنالیز مولکولی و بررسی بیان ژن استیل ترانسفراز مخمریAYT1­­) ­­) جهت سم­زدایی توکسین فوزاریومی DON در لاین­های نسل دوم گندم تراریخته (Triticum aestivum )

مهرداد اسدیان¹، شاهرخ قرنجیک*2، امیر موسوی³، ناصر فرخی²

¹دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعنی شاهرود    

²استادیار دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعنی شاهرود

³دانشیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­فناوری، تهران

تاریخ دریافت: 20/01/1393، تاریخ پذیرش: 16/01/1394

چکیده

            گندم یکی از مهمترین غلات تامین­کننده نیازهای غذایی انسان در کشورهای مختلف جهان، بخصوص کشورهای در حال توسعه است. بلایت فوزاریومی سنبله گندم یکی از بیماری­های رایج و آسیب­رسان به این محصول است که عامل این بیماری قارچ Fusarium graminearum می­باشد. این بیماری علاوه بر تاثیر منفی بر روی عملکرد محصول، با تولید مایکوتوکسین­های خطرناکی نظیر توکسین دی­اکسی­نیوالنول (DON­) بر روی کیفیت دانه­های تولیدی نیز اثرات منفی می­گذارد و خطراتی را برای سلامتی انسان و دام در پی دارد. ایجاد تغییر شیمیایی در ساختار توکسین DON می­تواند از تجمع این توکسین درون دانه بکاهد. ژن ­AYT1­ کدکننده یک آنزیم استیل ترانسفرازی بوده و در کاهش سمیت توکسین DON نقش دارد. در این تحقیق گیاهان نسل دوم گندم تراریخته حاوی این ژن، جهت بررسی تلفیق پایدار و بیان مناسب ژن انتقال­یافته با استفاده از روش­های مولکولی شامل PCR، RT-PCR و روش دورگه سازی سادرن مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج به دست آمده حاکی از حضور پایدار و بیان مناسب ژن AYT1 در اکثر گیاهان نسل دوم گندم تراریخته مورد بررسی بود. واکنش RT-PCR از روی RNA استخراج شده در گیاهان تراریخته، نشان­دهنده رونویسی ژن در سطح RNA در 23 لاین از گیاهان مورد مطالعه بود. نتایج آنالیز دورگه­سازی سادرن جهت بررسی تعداد نسخه‌های ژنی ورودی در گیاهان تراریخته مورد بررسی، حاکی از ورود بیش از یک نسخه از ژن AYT1 در برخی از لاین­های مورد بررسی بود.

کلمات کلیدی: گندم تراریخته، بلایت فوزاریومی، دی­اکسی­نیوالنول­، ژن استیل ترانسفراز مخمری.

مقدمه

در بین جنس­های مختلف غلات، گندم نان (Triticum aestivum) اهمیت زیادی در تامین غذایی انسان دارد و به تنهایی حدود یک پنجم از کالری مورد نیاز انسان را تامین می­کند (Bai & Shaner, 2004). این محصول در سرتاسر جهان و در مناطق مختلف آب و هوایی قابل کشت بوده و 30 درصد از سطح زیر کشت محصولات زراعی را به خود اختصاص داده است (­Bai & Shaner, 2004 ; Bar, 1986). یکی از بیماری­های خسارت زایی که این محصول استراتژیک را تحت تاثیر قرار می­دهد بیماری بلایت فوزاریومی سنبله گندم یا اسکب می باشد که توسط قارچ Fusarium graminearum ایجاد می­شود و در نقاط مختلف دنیا مانند آمریکا و کانادا، اروپا، چین و هند دیده شده و عملکرد گندم را تا حد قابل توجهی کاهش می­دهد (Okubara et al., 2000; Sepahvand et al, 2009). این بیماری علاوه بر کاهش چشمگیر در عملکرد محصول، به دلیل تولید مایکوتوکسین­های خطرناک و تجمع آن­ها در دانه سبب بروز بیماری­ها و عوارض متعدد انسانی و دامی ناشی از مصرف دانه و فرآورده­های آلوده آن می­شود (­Snijders, 2004). فیتوتوکسین­هایی که به وسیله این پاتوژن تولید می­شوند از دسته تریکوتسین­ها هستند (Prandini et al., 2009). تریکوتسین­ها از جمله ترکیبات sesquiterpene می­باشند که مهار کننده فعال مرکز پپتیدیل ترانسفراز ریبوزوم­های یوکاریوتی می­باشند و از سنتز پروتئین در مرحله طویل­شدن و خاتمه جلوگیری می­کنند (Gharanjik et al., 2008). یکی از مهمترین این تریکوتسین­ها، دی­اکسی­نیوالنول (­DON) است. محققین معتقدند که DON احتمالا به عنوان فاکتوری بیماری­زا عمل می­کند و جلوتر از میسیلیوم­های قارچی حرکت کرده و بافت میزبان را جهت تجمع قارچ آماده می­سازد (Mitterbaure et al., 2004). اهمیت ویژه DON، آثار بیماری­زایی آن در انسان و حیوانات است. این مایکوتوکسین در انسان سبب بروز علایمی از قبیل بی اشتهایی، تشنج، تهوع و استفراغ و اختلالاتی در سیستم عصبی و ایمنی می­شود (­Urban et al., 2002). لذا مبارزه با این بیماری یا تلاش در جهت کم کردن مقدار توکسین موجود در دانه ارزش ویژه­ای در تولید غذای سالم در جوامع دارد (Poppenberger et al., 2003).

با توجه به اهمیت این بیماری و آثار نامطلوب توکسین­های ناشی از قارچ عامل بیماری و نیز ناکارآمدی روش­های مختلف کنترل این بیماری، توسعه و ارزیابی ژرم­پلاسم و ایجاد ارقام متحمل از ضرورت ویژه­ای برخوردار است (Falasconi et al., 2005). امروزه با استفاده از تکنیک­های مهندسی ژنتیک، ژن های مسئول مقاومت می­تواند از هر منبعی به گیاه زراعی انتقال داده شود. در مخمر Saccharomyces cerevisiae ژنی به نام AYT1 که محصول آن نوعی آنزیم استیل ترانسفراز بوده، شناسایی شده که به نظر می­رسد در حفاظت مخمر در برابر تریکوتسین ها نقش دارد (Alexander et al., 2002). محققین این ژن از مخمر جدا و به گیاه توتون به عنوان گیاه مدل انتقال دادند (Sanjarian et al., 2009; Irani et al, 2015 ­)، اما از آنجا که گیاه هدف، گیاه گندم و قارچ هدف آن، قارچ F. graminearum می باشد در تحقیق دیگری ژن AYT1 به گیاه گندم نیز انتقال یافت (­Gharanjik et al., 2008­).

اطمینان از تلفیق پایدار ژن انتقال یافته به گیاه تراریخته و نیز رونویسی مناسب از آن در طی نسل های بعدی، از اهمیت ویژه ای بر خوردار است. از طرفی تعداد نسخه­های ورودی به ژنوم گیاهان تراریخته می تواند بر روی سطح بیان ژن وارد شده و پایداری این ژن در ژنوم در طی نسل­های بعدی تاثیر گذار باشد. تحقیقات نشان داده است که در صورت ورود چندین نسخه از یک ژن به درون ژنوم امکان خاموشی آن ژن در گیاه تراریخته وجود دارد. با روش آنالیز دورگه­سازی سادرن می­توان وجود ژن بیگانه در ژنوم و تعداد نسخ آن ژن را در ژنوم گیاه تراریخته مشخص نمود (Young et al., 2003). لذا در این تحقیق با هدف بررسی تلفیق پایدار تراژن مورد نظر در ژنوم گیاه و عدم تفرق در نسل­های بعد و نیز اطمینان از بیان مناسب این ژن، همچنین بررسی تعداد نسخه­های ژنی انتقال یافته، آنالیزهای­ مولکولی با استفاده از روش­های PCR، RT-PCR و روش دورگه­سازی سادرن بر روی گیاهان نسل دوم گندم تراریخته حاوی ژن استیل ترانسفراز مخمری صورت پذیرفت.

مواد و روش ها

در این تحقیق تعداد 40 لاین از بذور جمع­آوری شده از نسل اول گندم تراریخته جهت انجام آنالیز­های مولکولی لازم در داخل گلدان­هایی با قطر 25 سانتی­متر و حاوی خاک استریل با بافت لومی در گلخانه دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی شاهرود و در شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی کشت شدند. نمونه برگی جهت استخراج DNA و RNA در مرحله دو تا سه برگی از گیاهان کشت شده جدا شد.

DNA ژنومی از بافت برگ با استفاده از روش CTAB (Doyle et al., 1987) استخراج گردید. پس از استخراج DNA، رسوب DNA حاصل در 100 میکرولیتر آب دوبار تقطیر حل شده و به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری شد. DNA استخراج شده برای استفاده در مراحل بعدی در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شد. کمیت و کیفیت DNA نیز با استفاده از دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز بر روی ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت. در روش اسپکتروفتومتری، از رقت 1 به 100 نمونه­ DNA در آب مقطر و دستگاه اسپکتروفتومتر مدل 6105 (­S 2000 UV/Vis­­) استفاده شد.

در این آزمایش غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و فرمول زیر محاسبه گردید:

فرمول (1)   ضریب رقت / OD 260 ×50 =غلظت DNA

در روش دوم برای بررسی کیفیت DNA استخراج شده، پنج میکروگرم از نمونه­های DNA همراه با نشانگر وزن مولکولی bp100 بر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز گردید. رنگ آمیزی ژل با استفاده از رنگ DNA safe stain (­CinaGen,Iran­) صورت گرفت.

هر واکنش PCR در حجم 20 میکرولیتر و با شرایط زیر انجام گرفت: دمای واسرشت سازی اولیه 94 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه، سپس 35 چرخه واکنش شامل 94 درجه سانتی­گراد دمای واسرشت­سازی به مدت 45 ثانیه، دمای اتصال 63 درجه سانتی­گراد به مدت 60 ثانیه و دمای طویل شدن 72 درجه سانتی­گراد به مدت 60 ثانیه صورت گرفت. در نهایت دمای 72 درجه سانتی­گراد برای مرحله طویل شدن نهایی به مدت 10 دقیقه اعمال گردید و سپس محصولات تکثیر شده بر روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شدند. طول ژن AYT1 مورد نظر در این تحقیق  1400 جفت باز می­باشد. برای طراحی آغازگر برای ژن AYT1 ابتدا توالی ژن AYT1 مخمری با شماره دسترسی Z73168Y13138 از بانک ژن (­سایت NCBI­) دریافت و سپس با استفاده از دو نرم افزار Primer 3 و Oligo analyzer اقدام به طراحی آغازگر گردید. توالی و مشخصات دو جفت آغازگر رفت و برگشت طراحی شده در جدول 1 نشان داده شده است. جفت آغازگر اول که از ابتدا و انتهای ژن AYT1 طراحی شده است، کل ژن را با اندازه 4/1 کیلو باز تکثیر می­نماید و جفت آغازگر دوم که از بخش داخلی ژنطراحی گردیده است، بخشی از ژن را با اندازه نزدیک به 305 جفت باز تکثیر خواهد کرد.

جدول 1- مشخصات آغازگر­های طراحی شده برای ژن AYT1.

Table 1- Characteristics of primers designed for AYT1 gene

RNA کل گیاه با استفاده از کیت استخراج RNA (RNX- Plus CinaGen, Iran) از بافت برگی گیاه استخراج گردید. cDNA نیز با استفاده از کیت سنتز cDNA (­Vivantis, Indonesia­) و مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده تهیه گردید. شرایط ساخت اولین رشته cDNA عبارت است از: μg 5 RNA کل، 5/0 میکرو مولار Oligo d(T)₁₈، nM20 از هرکدام از dNTP ها و 100 واحد از آنزیم رونویسی معکوس که بمدت 60 دقیقه در دمای 42 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. برای ساخت دومین رشته و تکثیر cDNA، از واکنش PCR با شرایط ذکر شده در بخش قبل استفاده شد. همچنین از آغازگرهای 18S rRNA هم به­عنوان کنترل مثبت در واکنش RT-PCR استفاده شد. این آغازگر قطعه­ای به­طول 600 جفت باز را تکثیر می­کند. مشخصات توالی آغازگرهای رفت و برگشت طراحی شده برای ژن 18srRNA در جدول 2 نشان داده شده است.

جدول 2- مشخصات آغازگرهای طراحی شده برای ژن 18srRNA.

Table 2- Characteristics of primers designed for 18srRNA gene

برای انجام آنالیز دورگه­سازی سادرن، از سه گیاه گندم تراریخت با بیان مناسب (­لاین­های شماره 75، 400 و 207­) استفاده شد. مقدار 30 میکرو­گرم از DNA ژنومی با استفاده از آنزیم Hind III هضم گردید و قطعات هضم شده بر روی ژل آگارز 8/0 درصد از هم جدا شدند و سپس ژل بر روی غشای نایلونی با بار مثبت منتقل گردید. کاوشگر مورد استفاده نیز بر اساس بخشی از ژن به اندازه 305 جفت باز با استفاده از کیت Dig-dUTP  و طبق دستورالعمل شرکت سازنده سنتز شد. عمل دورگه­سازی غشا و کاوشگر در دمای 60 درجه سانتی­گراد بمدت یک شبانه­روز انجام شد. پس از شستشوی غشا در بافرهای مناسب، رنگ­آمیزی غشا توسط محلول سوبسترای رنگ موجود در کیت دورگه­سازی سادرن صورت پذیرفت. پس از حدود 20 دقیقه لکه­های مورد نظر روی غشا پدیدار شدند.

نتایج و بحث

آزمون PCR روی نمونه­های DNA استخراج شده از گیاهان به کمک آغازگرهای اختصاصی AYT1-Fw1 و AYT1-Re2 صورت گرفت و الگوی الکتروفورزی محصولات PCR، نشان­دهنده تکثیر قطعه مورد انتظار با اندازه ­Kb 4/1­ بر روی ژل آگارز بود. این قطعه در گندم غیر­تراریخته به عنوان کنترل منفی مشاهده نشد (شکل1­). حضور ژن AYT1 در 37 لاین (­90 درصد­) از گیاهان نسل دوم گندم تراریخته مورد تایید قرار گرفت. همچنین از آغازگرهای داخلی AYT1-f6 و AYT1-r6 نیز جهت اطمینان استفاده گردید. این آغازگرها باعث تکثیر قطعه­ای معادل 305 جفت باز شدند. نتایج مربوط به این PCR نیز نشان­دهنده حضور ژن AYT1 در 37 لاین از 40 لاین کشت شده بود. RNA کل از برگ گیاهان گندمی که تراریختی آنها در مرحله قبل به اثبات رسیده بود، استخراج و کیفیت آن بر روی ژل اگارز 2 درصد بررسی گردید (شکل 3). الگوی الکتروفورزی نمونه­های استخراج شده باندهای 28srRNA و 18srRNA را بروی ژل آگارز به صورت مطلوب نشان دادند که این موضوع نشان از کیفیت بالای RNA­های استخراج شده داشت.

شکل 1- الگوی الکتروفورزی محصولات PCR برای تایید تراریختی گیاه گندم با استفاده از آغازگرهای AYT1-Fw1 و AYT1-Re2. M: نشانگر اندازه 100 جفت بازی (Vivantis, Malaysia)، 1: لاین GA30، 2: لاین GA76، 3: لاین GA19،  4: لاین GA171،  5: لاین GA15، 6: کنترل منفی با گندم غیرتراریخته.

Figure 1- Electrophoretic pattern of PCR products to confirmation of transgenic wheat plant using AYT1-Fw1 and AYT1-Re2 primers. M: 100 bp Ladder, 1-5 lanes: Transgenic wheat lines, 6: Negative control (untransformed wheat).

شکل2- الگوی الکتروفورزی محصولات PCR با استفاده از آغازگرهای داخلی ژن AYT1. M: نشانگر اندازه 100 جفت بازی (Vivantis, Malaysia) 1: لاین GA75، 2: لاین GA283، 3: لاین GA444، 4: لاین GA158، 5: لاین GA60،  6: لاین GA42، 7: کنترل منفی با گندم غیرتراریخت.

Figure 2- Electrophoretic pattern of PCR products to confirmation of transgenic wheat plant using internal primers. M: 100 bp Ladder, 1-6 lanes: Transgenic wheat lines, 7: Negative control (untransformed wheat).

شکل 3- الگوی الکتروفورزی نمونه­های RNA کل استخراج شده از گیاهان تراریخته. M: نشانگر اندازه 100 جفت بازی ((Vivantis, Malaysia، 1: لاین GA 30.1، 2: لاین GA400، 3: لاین GA105، 4: لاین GA143، 5: لاین GA260.1.

Figure 3- Electrophoretic pattern of total RNA extracted from transgenic plants, M: 100 bp Ladder, 1-5 lanes: Transgenic wheat lines.

واکنش RT-PCR از روی RNA استخراج شده از گیاهان تراریخته با استفاده از آغازگرهای اختصاصی AYT1-Fw1 و AYT1-Re2 نیز قطعه مورد نظر (­با اندازه Kb4/1) را نشان ­داد که نشانگر رونویسی ژن در سطح RNA در 23 لاین (­55 درصد­) گیاهان تراریخته بود. نتایج حاصل از واکنش RT-PCR با استفاده از آغازگرهای AYT1-Fw1 و AYT1-Re2 برای سه گیاه تراریخته حاوی ژن AYT1 به همراه کنترل منفی مربوط به هر واکنش در شکل 4 نشان داده شده است. شایان ذکر است که ژن AYT1 فاقد توالی اینترون است و آلودگی RNA استخراج شده با DNA ژنومی، می­تواند باعث بروز خطا و جواب مثبت کاذب گردد. لذا علاوه بر تیمار نمونه ها با آنزیم DNAase، استفاده از واکنش کنترل منفی، یعنی واکنش RT-PCR در غیاب آنزیم رونویسی معکوس نشان داد که RNA استخراجی فاقد آلودگی با DNA است. همچنین برای واکنش کنترل مثبت از آغازگرهای اختصاصی 18srRNA استفاده گردید و با مشاهده قطعه bp600 مورد نظر کیفیت RNA و واکنش RT-PCR مورد تایید قرار گرفت.

شکل 4- الگوی الکتروفورزی نتایج حاصل از واکنش RT-PCR برای تایید رونویسی از ژن AYT1 در گیاهان تراریخته با استفاده از آغازگرهای AYT1-Fw1 و AYT1-Re2.

M: نشانگر اندازه 100 جفت بازی  (Vivantis, Malaysia)1: لاین GA143، 2: کنترل منفی (­- RT­)،3: کنترل مثبت 18s، 4: لاین GA 30.1، 5: کنترل منفی (­- RT­)، 6: کنترل مثبت .18s

Figure 4- Electrophoretic pattern of RT-PCR products from transgenic wheat plants. M: 100 bp Ladder, 1: transgenic line GA143, 2: negative control (no RT), 3: positive control using 18srRNA primers, 4: transgenic line GA 30.1, 5: negative control (no RT), 6: positive control using 18srRNA primer.

جهت انجام آزمون دورگه­سازی سادرن DNA ژنومی استخراج شده از بافت برگی تعدادی از گیاهان تراریخته به همراه گیاه شاهد (غیرتراریخته) به وسیله آنزیم HindIII مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. این آنزیم DNA را به قطعاتی با اندازه­های مختلف برش می­دهد.

برای مشخص شدن تعداد نسخه­های ژنی ورودی به گیاه تراریخته نیاز است که برای ژن ­AYT1­ کاوشگری طراحی شود که این کاوشگر مکمل ژن AYT1 می­باشد و توانایی اتصال به آن را دارا باشد. لذا با استفاده از آغازگرهای اختصاصی

AYT1-f6 و AYT1-r6 و انجام واکنش PCR اقدام به تهیه کاوشگر نمودیم. در تهیه این کاوشگر بجای استفاده از عناصر رادیواکتیو برای نشاندار کردن توالی DNA مورد نظر، از دنباله غیررادیواکتیو Dig-dUTP استفاده شد که خطرات ناشی از مواد رادیواکتیو را مرتفع می­سازد. همان طور که در شکل 5 مشخص است کاوشگر طراحی­شده از اندازه بزرگتری (­405 جفت باز­) نسبت به قطعه تکثیر شده توسط واکنش معمولی PCR برخوردار می­باشد.

شکل 5-  کاوشگر سنتز شده برای ژن AYT1 با اندازه بزرگتر از سایز معمول.  M : نشانگر اندازه 100 جفت بازی (Vivantis, Malaysia)، 1: کاوشگر طراحی شده به کمک Dig-dUTP، 2: محصول واکنش PCR معمولی

Figure 3- Synthesized probe for AYT1 gene. M: 100 bp Ladder, 1: Designed probe, 2: Normal PCR product.

آنالیز دورگه­سازی سادرن تعداد نسخه­های ژنی ورودی به هر لاین را مشخص نمود. بدین صورت که در یکی از لاین­ها هیچ باندی مشاهده نشد ولی در لاین شماره 400 دو باند و در لاین شماره 207 سه باند دیده شد. کنترل منفی نیز هیچ باندی را نشان نداده است که این موضوع نشان از صحت این آنالیز دارد. از ناقل حاوی ژن AYT1 نیز به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. لکه مشاهده شده در این بخش نیز نشان از صحت کار لکه­گذاری بر روی غشا می­باشد (­شکل 6). تعداد این لکه­ها نشان دهنده تعداد نسخه­های ژنی ورودی به داخل ژنوم گندم تراریخته می­باشد. از آنجا که بین افزایش تعداد نسخه­های ورودی ژن به ژنوم و ایجاد مقاومت در گیاه می تواند رابطه­ عکس وجود داشته باشد، لذا وجود یک نسخه از ژن در ژنوم گیاه مطلوب­تر می­باشد. با این­حال در لاین 400 که دو لکه بر روی غشا ایجاد کرده بود، در آزمون های زیست سنجی، مقاومت خوبی را در برابر قارچ فوزاریوم از خود نشان داد. همچنین لاین شماره 207 نیز که سه لکه بر روی غشا ایجاد نموده بود نیز در برابر قارچ عامل بیماری از خود مقاومت قابل قبولی نشان داد، اما میزان مقاومت آن در مقایسه با لاین شماره 400 کمتر بود.

شکل 6-  آنالیز سادرن بلات. چاهک M: نشانگر اندازه 1 کیلوبازی (Vivantis, Malaysia)،  : لاین 75، 2: لاین 400،  3: لاین 207، 4: کنترل مثبت 5: کنترل منفی

Figure 6- Southern-blot analysis of wheat transgenic plants, M: 1 Kb Ladder, 1-3 lanes: transgenic wheat lines, 4: Positive control (pCAMBIA 3301 + AYT1 gene), 5: negative control (untransformed plant).

بحث

قارچ F. graminearum ترکیبات و متابولیت های ثانویه­ای را تولید می­کند که دارای سمیت زیادی برای انسان و همچنین گیاه هستند (Alizadeh & Saeidi, 2007). بررسی­ها روی سویه­های جمع­آوری شده از ایران نشان می­دهد که آن­ها قادر به تولید مخلوطی از میکوتوکسین­ها از جمله زرالنون و دی اکسی نیوالنول هستند (Alizade & Saeidi,2007). یکی از راه­های مقابله با این عوامل، تغییر در ساختمان آن­ها به وسیله آنزیم­های سم­زدا می­باشد. تولید تریکوتسین­ها تنها عامل بیماری­زایی است که سازوکار عمل آن شناخته شده است و به همین دلیل اولین هدف در راهکارهای زیست فناورانه جهت مقابله با قارچ محسوب می­شود. اگرچه برای بیماری­زایی کامل، ضرورت وجود ژن­های دیگری نیز گزارش شده است. ژن AYT1 که در این تحقیق بررسی شده، DON را بهDON   3-A تبدیل می­کند که سمیت آن بسیار کمتر از DON است (Ruckenbauer et al., 2001). از آنجایی که DON فاکتور تشدید کننده بیماری شناخته شده است بنظر می­رسد بیشترین نقش ژن AYT1 در تحمل به DON و مراحل بعد از آلودگی اولیه مشخص می­شود. به طور کلی کم کردن مقدار DON از طریق سم زدایی آن باعث افزایش کیفیت غلات شده و به نظر می­رسد در مقاومت به قارچ F. graminearum  نیز نقش بسزایی ایفا نماید. گزارشاتی مبنی بر تشدید تحمل به DON در توتون­های تراریخت شده با ژن Fs Tri101 وجود دارد، اما برخی گزارشات نیز نشان داده­اند که لاین­های گندم تراریخت شده با این ژن افزایش معناداری در مقاومت به FHB نشان نمی­دهند که این امر می تواند به دلیل تفاوت در جذب و متابولیسم DON (Higa et al., 2003) و یا مقدار کم بیان این آنزیم (Dahleen et al., 2001) در گیاهان تراریخته باشد. همچنین بررسی­های اخیر نشان داده است که بیان ژن AYT1 موجب افزایش مقاومت به DON در توتون­های تراریخت می­شود (­Sanjarian et al., 2009­). مطالعه حاضر نشان داد که تعداد زیادی از گندم­های تراریخته مورد مطالعه حاوی ژن AYT1، قابلیت بیان ژن در سطح رونویسی را دارا می­باشند، البته در 14 لاین از گیاهان مورد مطالعه (­35 درصد­) که الگوی الکتروفورزی محصول PCR آن­ها نشان­دهنده حضور ژن AYT1 بود، عدم رونویسی و بیان ژن AYT1 مشاهده شد. از دلایل احتمالی این امر می­توان به قرار گرفتن ژن موردنظر در ناحیه هتروکروماتینی ژنوم اشاره نمود، همچنین چون در این تحقیق از روش تفنگ ژنی برای انتقال ژن AYT1 استفاده شده بود، لذا امکان ورود چندین نسخه از ژن و به دنبال آن خاموشی ژن وجود دارد. از طرفی امکان دارد که بیان ژن در تعدادی از لاین­ها به قدری پایین باشد که توسط روش نیمه کمی RT-PCR نتوان بیان آن­ها را تشخیص داد. لذا با استفاده از تشدید کننده­های قوی می­توان بر این مشکل غلبه نمود. پس از انجام آزمون RT-PCR و با اسکن نمودن ژل و بررسی شدت درخشندگی باندها در الگوی الکتروفورزی، می­توان میزان بیان ژن در نمونه های مختلف را مورد مقایسه قرار داد. در این تحقیق، در تعدادی از لاین­ها شدت باند الکتروفورزی بیشتر بود که این موضوع می­تواند بدلیل فعالیت مناسب پیش­بر و مکان مطلوب قرار گرفتن کاست ژنی در ژنوم باشد. جهت بررسی دقیق­تر میزان تغییرات بیان ژن درگیاهان تراریخته مورد بررسی پیشنهاد می­شود که در ادامه کار از روش کمی Real Time PCR استفاده شود. در آنالیز دورگه­سازی سادرن مشاهده گردید که یکی از لاین­ها که قبلا حضور و بیان تراژن مورد نظر در آن تایید شده بود، هیچگونه لکه­ای را نشان نداد. این نکته را می­توان از دو منظر تفسیر نمود. یکی آنکه، ممکن است آنزیم متیل ترانسفراز ناحیه­ای را که توسط آنزیم HindIII برش می­خورد متیله کرده باشد، پس آنزیم HindIII نمی­تواند ناحیه موردنظر را برش دهد. دلیل دیگر؛ این می­تواند باشد که تراژن AYT1 وارد ناحیه هتروکروماتینی ژنوم شده باشد. لذا بررسی محل قرار گرفتن ژن در ژنوم و اینکه بر روی کدام کروموزوم قرار گرفته است توسط آزمون FISH در مراحل بعدی این پژوهش پیشنهاد می­گردد.

منابع

Alexander NJ, McCormick SP, Hohn TM (2002). The identification of the Saccharomyces cerevisiae gene AYT1(ORF-YLL063c) encoding an acetyltransferase. Yeast 19:1425-30.

Alizadeh A, saiedi A (2007). Effect of plant methabolomics in Fusarim Head Blight. Progress report of fusarium nation. SPII. Karaj Iran.

Bai G, Shaner G (2004). Management and resistance in wheat and barley to fusarium Head Blight. Annual Review of Phytopathology 42: 135-61.                                         

Bar N (1986). Gramineaceae. In: Townsend CC. G and E, Al-Raw A. (eds): Flora of Iraq 9: 173-208.

Dahleen LS, Okubara PA, Blechl AE (2001). Transgenic approaches to combat fusarium Head Blight in wheat and barley. Crop Science 41: 628-37.

Doyle JJ, Doyle JL (1987). A rapid DNA isolation  procedure for small quantites of fresh leaf tissue. phytochem Bulletin 19:11-15. 

Falasconi M,  Gobbi E, Pardo M, Sberveglieri G (2005). Detection of toxigenic strains of Fusarium verticillioides in corn by electronic olfactory system. Biochemical 108: 250-257.

Gharanjik Sh,  Moieni A, Mousavi A, Alizadeh H (2008). Designing and cloning of gene constructs containing yeast acetyl transferase gene (Ayt1) in order to transformation of wheat (Triticum aestivum L.). Proceeding of 10 ^th  Iranian Genetics Congress. Tehran Iran.

Higa A, Kimura A, Mimori K, Ochiaifukuda T, Tokai T, Takahashi Ando N, Nihiuchi T, Igawa T, Fujimura M, Hamamoto H, Usami R, Yamaguchi I (2003). Expression in cereal plants of genes that inactivated Fusarium mycotoxins. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 67: 914-918.

Irani Z, Sanjarian F, Azimi M.R (2015). Conversion of Deoxynivalenol to 3-acetyl deoxynivalenol in wheat and tobacco through the expression of Synthetic Acetyltransferase gene. Journal of Agricultural Biotechnology 7: 17-27.

 Mitterbaure R, Poppenberger B, Raditsching A (2004). Toxin dependent utilization of engineered ribosomal protein L3 limits trichothecene resistance in transgenic plants. Plant biotechnology journal 2: 329-340. 

Okubara PA, Blech AE, McCormic SP, Alexander NJ (2000). Engineering deoxynivalenol metabolism in wheat through the expression of a fungal trichotecen acetyl transferase gene. Theoretical and Applied Genetics 106: 74-83.

Poppenberger B, Berthiller F, Lucyshin D, Siebere T, Schuhmacher R, Kuchler K, Luschning C, Adam G (2003). Detoxyfication of Fusarium mycotoxin deoxynivalenol by UDP-glycosyltransferase from Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry 728: 47905-47914.

Prandini A, Sigolo S, Filippi L, Battilani P, Piva G (2009). Review of predictive models for Fusarium head blight and related mycotoxin contamination in wheat. Food Chemical Toxicology 47:927-31.

Ruckenbauer P, Buerstmayr H, Lemmens M (2001). Present strategies in resistance breeding against scab. Euphytica 119:121-127.  

Safipoor Afshar A, Mousavi A, Adam G (2007). Double Mutation in Tomato Ribosomal Protein L3 cDNA Confers Tolerance to Deoxynivalenol (DON) in Transgenic Tobacco. Pakistan Journal of Biological Sciences 10: 2327-2333.  

Sanjarian F, Mousavi A, Alizadeh A, Weindorfer H, Adam G (2009). Evaluation of the acetyltransferse in detoxification of the F.graminearum toxin deoxynivalenol in transgenic plants. Iranian Journal of Biology 19:222-231.

Sepahvand N.A, Heidari F, Totiaei A, Seraj M, Mozafari J (2009). Field and Molecular Evaluation of Resistance of Iranian Bread Wheats to Fusarium Head Blight. Journal of Agricultural Biotechnology 1: 63-79.

Urban M, Daniels S, Mott E, Hammond Kosack K (2002). Arabidopsis is susceptible to cereal ear blight fungal pathogens Fusarium graminearum and Fusarium culmorum. The plant Journal 32: 961-973.                                                                           

 Young JC, Trenholm HL, Friend DW, Prelusky DB (1987). Detoxification of deoxynivalenol with sodium bisulfite and evaluation of the effects when pure mycotoxin or contaminated corn was treated and given to pigs. Journal of Agricultural and Food Chemistry 35: 35:259–261.

Molecular analysis of the second generation of transgenic wheat containing yeast acetyltransferase gene (AYT1)

Asadian M.¹, Gharanjik Sh.*², Mousavi A.³, Farrokhi N.²

¹M.Sc Student of Plant Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahrood University of Technology.

²Assistant professor in Molecular Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Shahrood University of Technology.

³ Associate professor, National Institute of Genetic Engineering & Biotechnology (NIGEB), Tehran, I.R. of Iran

Abstract

Wheat is one of the most important cereals that supply needs of the human food in all countries. Fusarium head blight (FHB), caused primarily by Fusarium graminearum is one of the most destructive diseases of wheat that produces the mycotoxin deoxynivalenol (DON), a protein synthesis inhibitor which is harmful to human and livestock. Chemical modification in DON structure could reduce DON accumulation in the grain. AYT1 gene, encoding an acetyltransferase enzyme plays a major role in reducing the toxicity of DON. In this study, we used molecular techniques such as PCR, RT-PCR and southern blotting to confirm the insertion and proper expression of this transgene in the second generation of transgenic wheat plants. Obtained results showed the presence of Ayt1 gene in most of the evaluated transformed plants, and transgene expression was confirmed by RT-PCR. Moreover, southern blot analysis for evaluation of transgene copy number showed more than one copy in some of the transgenic lines.

Keywords: Fusarium Head bight, Deoxynivalenol, Acetyltransferase gene, Southern blotting.