حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل با استفاده از روش‎های کشت مریستم، گرمادرمانی و برق‎درمانی

حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل با استفاده از روش‎های کشت مریستم، گرمادرمانی و برق‎درمانی

ثریا تورنگ¹، مسعود شمس بخش*²، احمد معینی³

¹دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

²دانشیار گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

³دانشیار گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی،  دانشگاه تربیت مدرس.

تاریخ دریافت: 01/07/1393، تاریخ پذیرش: 29/08/1394

چکیده

گل گلایل (Gladiolus sp.) جزء شش گل برتر صادراتی در دنیا می‎باشد و در ایران نیز مقام دوم تولید گل شاخه‎بریده را به خود اختصاص داده‎است. ویروس موزاییک خیار (Cucumber mosaic virus, CMV) از جمله ویروس‎های شایع گل گلایل است. از آنجاییکه گلایل به روش رویشی از طریق پداژه تکثیر می‎شود، آلودگی ویروسی به آسانی به نسل بعد منتقل می‎شود. از این‎رو کنترل ویروس‎های گلایل از طریق استفاده از گیاهان مادری سالم دست‎یافتنی است. در تحقیق حاضر روش‎های کشت مریستم و کشت مریستم همراه با گرمادرمانی و برق‎درمانی برای حذف CMV از گیاهان آلوده به‎کار گرفته و کارایی این روش­ها مقایسه­شد. در مجموع ردیابی CMV با استفاده از آزمون الایزا نشان داد که 73 درصد از گیاهان باززایی شده عاری از ویروس بودند درحالیکه ردیابی با آزمون RT-PCR نشان دادکه 42 درصد گیاهان عاری از ویروس شدند. بهترین نتیجه حذف ویروس از کشت مریستم گرمادرمانی شده در اندازه 5/0 میلی‎متر بدست آمد که در نتیجه همه­ی گیاهان تیمارشده عاری از ویروس شدند. این اولین گزارش از کاربرد برق‎درمانی برای حذف CMV از گیاهان گلایل آلوده می‎باشد، بهترین نتیجه برق درمانی از تیمار شدت جریان 15 میلی آمپر همراه با کشت مریستم به مدت 15 دقیقه به دست آمد. همچنین نتایج به­دست‎آمده نشان داد که گرمادرمانی همراه با کشت مریستم روش مناسب­تری برای حذف CMV از گیاهان گلایل آلوده بود.

واژه‎های کلیدی: گلایل، ویروس موزاییک خیار، ویروس زدایی.

مقدمه

گل زینتی گلایل (Gladiolus sp.) متعلق به خانواده Iridaceae با بیش از 180 گونه است که گونه‌های اصلاح شده آن از جمله مهم­ترین گیاهان زینتی شاخه بریده و تک‎لپه‌ای در دنیا بشمار می­رود و جزء شش گل برتر صادراتی می‌باشد (Dubey & Singh, 2010). در ایران نیز تولید گل گلایل اهمیت زیادی داشته و پس از گل رز رتبه دوم تولید گل شاخه‎بریده را به خود اختصاص می­دهد (Anonymous, 2010).

ویروس موزاییک خیار Cucumber mosaic virus متعلق به جنس Cucumovirus و خانواده  Bromoviridae می­باشد. این ویروس توسط 60 گونه شته به‎صورت ناپایا منتقل می­شود و بیش از 1300 گونه گیاهی متعلق به 500 جنس و بیش از 100 خانواده شامل انواع سبزی­ها، گیاهان زینتی، علف­های هرز و سایر گیاهان را آلوده می­کند (Duarte et al., 2013). علایم بیماری ناشی از ویروس بستگی به استرین بیمارگر، رقم گلایل و شرایط آب و هوایی متفاوت­است و شامل موزاییک، کوتولگی، کلروز، رگه‎های زرد در برگ‎ها، شکستگی رنگ گلبرگ‎ها، کاهش میزان گلدهی و ریزبودن پداژه می­باشد (Duarte et al., 2013; Raizada et al., 1989).

قارچ­ها و باکتری­های بیمارگر معمولآ علایم مشخصی روی پداژه‎ها ایجاد‎ می‎کنند، بنابراین پداژه‌های آلوده به­هنگام کاشت شناسایی و حذف می‎شوند یا عوامل بیماری‎زای آن‎ها توسط قارچ‎کش و باکتری‎کش کنترل می‎شوند. به‎دلیل عدم بروز علایم مشخص آلودگی ویروسی روی پداژه‎های گلایل، آلودگی به ویروس‎ها مخفی می­ماند و سبب خسارت می‎شود. بعلاوه، تکثیر ارقام گلایل از طریق اندام رویشی (پداژه) است و در نتیجه ویروس­ها از نسلی به نسل بعد منتقل و باعث افزایش شدت خسارت بیماری از سالی به سال دیگر می‎شوند و همچنین انتقال پداژه‎ها‎‎‎‎ی آلوده به ویروس به نقاط مختلف دنیا سبب اشاعه ویروس می­شود. بنابراین، استفاده از مواد گیاهی سالم مناسب­ترین و مؤثرترین راه‎ مدیریت بیماری­های ویروسی به شمار می‎رود و از جمله روش‎های رایج در تولید اندام‎های تکثیری عاری از ویروس کشت مریستم، گرمادرمانی و کشت مریستم همراه با گرمادرمانی و برق درمانی است.

از روش کشت مریستم به منظور حذف ویروس­های مختلفی از میزبان­های متنوعی استفاده شده است به­عنوان مثال برای حذف ویروس‎های موزاییک نیشکر (Sugarcane mosaic virus, SCMV)، ویروس موزاییک سورگوم (Sorghum mosaic virus, SrMV)، ویروس موزاییک رگه‎ای نیشکر  (Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV) و ویروس زردی برگ نیشکر (Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) از گیاه نیشکر آلوده (Cheong et al., 2012)، حذف ویروس موزاییک آلسترومریا (Alstromeria mosaic virus, AIMV) ازگیاه آلسترمریا (Fuji et al., 2005) و حذف ویروس برگ بادبزنی مو (Grapevine fanleaf virus, GFLV) از دو رقم انگور ایرانی (سیاه و بی دانه) (Salami et al., 2005) استفاده شده است. روش کشت مریستم انتهایی برای حذف CMV از اندام‎های تکثیری گلایل توسط محققین مورد استفاده قرار‎گرفته‎است که سبب حذف ویروس از این گیاهان شده است (Lilien-kipnis et al., 1997; Selvarajan et al., 1999; Mangal et al., 2003).

استفاده از روش گرمادرمانی تواَم با کشت مریستم انتهایی سبب حذف ویروس موزاییک زرد لوبیا از گلایل (Sharifi Nezamabad et al., 2015)، حذف دو ویروس لکه سبزرد برگ سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) و ساقه شیاری سیب (Apple stem grooving virus, ASGV) از درختان دانه‎دار (Wang et al., 2006)، حذف ویروس ابلقی میخک (Carnation mosaic virus, CarMV) (Sepahpour et al., 2009)، حذف ویروس‎های ساقه ‎‎‎‎آبله آلو (Plum pox virus, PPV) و نقش حلقوی نکروتیک هسته‌داران (Prunus necrotic ring spot virus, PNRSV) (Manganaris et al., 2003) و حذف PPV از زردآلو (Koubouris et al., 2007) شده است. از روش گرمادرمانی تواَم با کشت مریستم انتهایی جهت تولید گیاهان گلایل عاری از ویروس­های موزاییک زرد لوبیا و موزاییک خیار استفاده‎‎شده‎است، پداژه‎ها‎‎‎‎ی گلایل پس از گرمادرمانی با آب گرم 50 درجه سلسیوس، مریستم در اندازه 7/0 -5/0 میلی‎‎‎متر جدا شد و در محیط‎کشت MS2/1 با ترکیبات هورمونی ویژه کشت شدند. این روش در حذف هر دو ویروس مؤثر عمل کرده است و سبب حذف 80 تا 100 درصد گیاهان حاصل شده است (Mangal et al., 2003).

استفاده از روش برق­درمانی تواَم با کشت مریستم سبب حذف ویروس ای سیب زمینی (Potato virus A, PVA) و وای سیب‎زمینی (Potato virus Y, PVY) (Emami Meybodi et al., 2011)، حذف ویروس ای انگور (Grapvine virus A, GVA) از انگورهای آلوده به این ویروس (Bayati et al., 2011)، حذف PVY از سیب‎زمینی (Almaarri et al., 2012)، حذف ویروس ایکس سیب زمینی (Potato virus X, PVX) ازسیب زمینی (Gonzales et al., 2004) وحذف CarMV از میخک‎های آلوده به این ویروس (Sepahpour et al., 2009) شده‎است. از این روش تا کنون برای حذف CMV از گلایل استفاده­نشده­است.

با توجه به اهمیت گل گلایل، آلودگی ‎ آن به ویروس موزاییک خیار و نحوه تکثیر این گل، تولید پداژه‎ها‎‎‎‎ی عاری از ویروس و ارائه آن به پرورش­دهندگان گل و گیاه امری ضروری است. از این‎رو هدف از انجام تحقیق حاضر مقایسه کارآیی روش­های کشت مریستم انتهایی، کشت مریستم همراه با گرمادرمانی و‎ کشت مریستم همراه با برق‎درمانی برای حذف ویروس موزاییک خیار از گیاه گلایل می­باشد.

مواد و روش‎ها

نمونه‎های گیاهی آلوده

طی ماه‎های تیر تا آبان سال 1391 از گلخانه‎های پاکدشت و مراکز توزیع پداژه‎ها‎‎‎‎ی گلایل در استان‎های تهران و البرز نمونه‎برداری انجام‎شد. پداژه‎ها‎‎‎‎ کاملاَ تصادفی انتخاب و در گلدان‎های پلاستیکی حاوی نسبت مساوی خاک و ماسه کاشته و در دمای 23-18 درجه سلسیوس نگه­داری شدند.

آزمون الیزا(Enzyme-linked immunosorbent assay)

برای ردیابی ویروس آزمون سرولوژیکی به روش الیزا غیرمستقیم با استفاده از آنتی‎سرم چندهمسانه‎ای (تهیه شده از مرکز تحقیقات بیماری‎های ویروسی غلات، دانشگاه شیراز) با رقت 1:1000 انجام گرفت. برای این منظور یکدهم گرم از برگ هر نمونه گیاه، کنترل منفی و کنترل مثبت در سه میلی لیتر بافر استخراج  عصاره‎گیری شد. هفتادوپنج میکرولیتر از عصاره گیاهی به همراه 25 میکرولیتر از بافر پوششی در چاهک‎های تشتک الیزا ریخته شد. سه چاهک با بافر عصاره‎گیری پر شد و تشتک به مدت یک شب در دمای چهار درجه سلسیوس نگهداری شد. پس از تخلیه چاهک‎ها و شست‎و‎شو توسط بافر ، 100 میکرولیتر بافر حائل (Blocking buffer)  به هر چاهک اضافه شد و به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس شست‎و‎شو مانند مرحله قبل انجام گرفت. آنتی‎سرم چندهمسانه‎ای به نسبت 1:1000 در بافر کانجوگیت رقیق شد و به میزان 100 میکرولیتر به هر چاهک اضافه شد. در این مرحله تشتک به مدت چهار ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس شست‎و‎‎شو مانند مراحل قبل انجام و آنتی بادی متصل شده به آنزیم آلکالین‎فسفاتاز به عنوان آنتی بادی ثانویه (Goat anti-rabbit-IgG-alkaline phosphatase conjugate) به نسبت 1:7500 در بافر کانجوگیت رقیق شد و به میزان 100 میکرولیتر به هر چاهک اضافه شد و تشتک به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس شست‎و‎شو مانند مراحل قبل انجام گرفت. در مرحله بعد 10 میلی‎گرم پارانیتروفنل‎فسفات به‎عنوان سوبسترای آنزیم آلکالین‎‎‎‎‎‎فسفاتاز در 10 میلی‎لیتر بافر سوبسترا حل و به مقدار 100 میکرولیتر از آن به هر چاهک اضافه شد. برای بررسی نتایج آزمون الیزا هر 15 دقیقه یکبار به مدت یک ساعت میزان تغییر رنگ چاهک‎ها در طول موج 405 نانومتر با دستگاه الیزا خوان Anthos 2020  ساخت کشور اتریش اندازه گرفته شد. چاهک‎هایی که میزان جذب نوری آنها بیش از دوبرابر میانگین جذب نوری چاهک‎های کنترل منفی (گیاه عاری از ویروس) بود، به عنوان نمونه مثبت تلقی شدند (Dijkstra & Jager,1998).

نسخه­برداری معکوس - واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)

جهت استخراج آر‎ان‎ای کل (Total RNA) از برگ‎های گلایل حاصل از کشت مریستم با استفاده از محلول RNX-Plus سیناژن (تهران، ایران) بر اساس دستوالعمل شرکت سازنده با تغییراتی به شرح زیر انجام ‎شد؛ یکدهم گرم از بافت برگ در ازت مایع پودر، سپس یک میلی­لیتر محلول RNX-Plus  اضافه و پس از تکان دادن، 400 میکرولیتر فنل اشباع به آن اضافه شد. بعد از مخلوط کردن، نمونه‎ها به مدت یک دقیقه با سرعت 13000 دور سانتریفیوژ شدند،  رونشین به میکروتیوب جدید منتقل و 200 میکرولیتر فنل اشباع و200 میکرولیتر کلروفرم به هر نمونه اضافه شد. پس از مخلوط کردن، نمونه‎ها به مدت یک دقیقه با سرعت 13000 دور سانتریفیوژ شد، رونشین به میکروتیوب جدید منتقل و 400 میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه شد. مجددا نمونه‎ها مخلوط و به مدت یک دقیقه با سرعت 13000 دور سانتریفیوژ شدند، رونشین به لوله جدید منتقل و دو برابر حجم فاز رویی اتانول سرد اضافه شد و به مدت یک شب در فریزر نگه­داری شد، نمونه‎ها در سانتریفیوژ یخچال‎دار به مدت 10 دقیقه با سرعت 13000 دور و در دمای چهار درجه سلسیوس سانتریفیوژ شدند و سپس با 500 میکرولیتر اتانول سرد 70 درصد شست‎وشو شد، پس از خشک کردن رسوب در دمای 37 درجه سلسیوس  25 میکرولیتر آب اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در دمای 55 درجه سلسیوس قرارداده‎شد. آر ان ای استخراج شده تا زمان استفاده در دمای منفی 70 درجه سلسیوس نگه­داری شد. آر‎ان‎ای استخراج شده با کمک آغازگرهای اختصاصی برای ساخت cDNA (دی‎ان‎ای مکمل) استفاده شد. ساخت cDNA با استفاده از کیت hyperScript RT premix (GeneAll, South Korea) طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده انجام شد. برای انجام این واکنش از هفت میکرولیتر آب، ده پیکومول از آغازگر اختصاصی معکوسCMV-R  (5'- GCG CGA AAC AAG CTT CTT ATC -3') (De Blass et al., 1984)، دو میکرولیتر آران‎ای کل استخراج شده از گیاهان مورد آزمایش و 10 میکرولیتر RT premix  استفاده شد. واکنش در دمای 55 درجه سلسیوس به مدت یک ساعت با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (ep Gradient Termocycler، اپندورف، ساخت کشور آلمان) انجام‎شد. برای انجام واکنش زنجیره‎ای پلیمراز از آغازگرهای CMV-F (5'- GTA GAC ATC TGT GAC GCG A -3') و CMV-R استفاده‎شد (De Blass et al., 1984). برای انجام واکنش زنجیره‎ای پلیمراز، 3/16 میکرولیتر آب مقطر استریل، 5/2 میکرولیتر بافر PCR (×PCR buffer 10) 2/1 میکرولیتر MgCl₂با غلظت 50 میلی‎مولار، 5/1 میکرولیتر dNTPs (dATP، dGTP، dTTP،dCTP) با غلظت 10 میلی‎مولار، یک میکرولیتر از هر کدام از آغازگرها با غلظت 10 پیکومول، پنج واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و دو میکرولیتر از cDNA ساخته‎شده CMV در لوله‎های 2/0 میلی‎لیتری سترون ریخته‎شد و با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (ep Gradient Termocycler، اپندورف، ساخت کشور آلمان) انجام ‎شد. برنامه حرارتی استفاده شده شامل یک چرخه دمایی 94 درجه سلسیوس به مدت دو دقیقه، 35 چرخه دمایی شامل 94 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، 58 درجه سلسیوس به مدت 35 ثانیه، دمایی 72 درجه سلسیوس به مدت 80 ثانیه و در آخر یک چرخه دمایی 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. تفکیک محصولات PCR، با استفاده از الکتروفورز محصول واکنش در ژل آگارز 2/1 درصد در بافر 1×TAE  (تریس باز 48/0 گرم، استیک اسید 11/0 میلی‎لیتر و اتیلن دی‎آمین تترا استات 5/0 مولار با اسیدیته 8 ،2/0 میلی‎لیتر) انجام ‎شد. برای بررسی اندازه باندهای تشکیل شده از نشانگر دی‎ان‎ای یک کیلوبازی(GeneRuler™ 1kb DNA ladder, Fermentas) استفاده‎شد.

گرمادرمانی

آزمایش در دو دما (دمای اتاق و دمای 37 درجه سلسیوس) و با دو سطح مریستم (نیم و یک میلی‎متر) با نه تکرار به مدت سه هفته طراحی شد. گیاهان گلایل آلوده به ویروس موجود در گلخانه، به اتاق رشد با دمای اولیه 28 درجه سلسیوس، منتقل و به منظور سازگار کردن گیاهان با دمای 37 درجه سلسیوس، هر روز دو درجه دما افزایش داده شد، سپس گیاهان به مدت سه هفته در دمای 37 درجه سلسیوس نگه­داری ‎شدند.

برق‎درمانی

آزمایش برق درمانی  با دو فاکتور؛ مدت زمان (با 2 سطح 10 و 15 دقیقه) و شدت جریان ( با سه سطح صفر، 10 و 15 میلی‎آمپر) با 17 تکرار انجام شد. برای ضد عفونی سطحی، قطعه­های ساقه‎ با اندازه 5-2 سانتی‎متری از گیاهان آلوده به ویروس جدا وبه مدت 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 05/0 قرارداده‎شدند و سپس با آب مقطر سترون شست­وشو شدند. ساقه‎ها درون دستگاه الکتروفورز افقی حاوی بافر 1×TBE (تریس باز 8/10 گرم، بوریک اسید 5/5 گرم و اتیلن دی آمین تترا استات 4 میلی‎لیتر) در معرض جریان الکتریکی قرارداده‎شدند. قلمه‎ها پس از تیمار الکتریکی بلافاصله به‎صورت سطحی سترون و پس از جدا کردن مریستم با اندازه 7/0 میلی‎متر به محیط‎کشت منتقل شدند.

کشت مریستم

این آزمایش با سه سطح از اندازه مریستم 5/0، 7/0 و 1 میلی‎متر انجام شد. برای انجام کشت مریستم از محیط‎کشت MS (Murashige & Skoog, 1962) استفاده ‎شد. نوع و غلظت هورمون‎ها، میزان آگار و ساکارز اضافه شده به محیط در مراحل مختلف در جدول 1 آمده است.

جدول 1- نوع و غلظت هورمون‎ها، میزان آگار و ساکارز اضافه شده به محیط کشت در مراحل مختلف کشت مریستم.

Table 1- Type and concentration of hormones, agar and sucrose added to medium in the different steps of meristem culture.

نتایج

نمونه‎برداری

از مجموع 486 پداژه گلایل بررسی شده با آزمون الایزا، تعداد 246 پداژه به ویروس موزاییک خیار آلوده بودند. درصد آلودگی نمونه‎های جمع‎آوری‎شده به ویروس موزاییک خیار 61/50 درصد بود. نتایج حاصل از نمونه‎برداری از نظر آلودگی به ویروس موزاییک خیار در جدول 2 آمده است.  

ردیابی ویروس در گیاهان حاصل از کشت مریستم و کشت مریستم توام با گرمادرمانی و برق‎درمانی

نتایج حاصل از ردیابی ویروس از گیاهان باززایی شده با آزمون الایزا نشان داد که در مجموع 73 درصد گیاهان عاری از ویروس شده بودند در صورتیکه در ردیابی ویروس از گیاهان باززایی شده با آزمون RT-PCR  42 درصد گیاهان عاری از ویروس شده بودند. واکنش RT-PCR با آغازگرهای اختصاصی CMV (De Blass et al., 1984) منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار به اندازه 519 جفت باز شد که تایید کننده آلودگی گیاهان بود (شکل 1). بهترین نتیجه حذف ویروس از کشت مریستم با اندازه 5/0 میلی‎متر از نمونه­های تیمار شده با گرمادرمانی بدست آمد که در نتیجه همه­ی گیاهان تیمارشده عاری از ویروس شدند و بهترین نتیجه باززایی گیاهان از کشت مریستم با اندازه یک میلی‎متر بدست آمد که در نتیجه آن 75 درصد گیاهان باززایی شدند (جدول 3).

جدول 2- نتایج آزمون الایزای پداژه‎های گلایل در بررسی آلودگی به ویروس موزاییک خیار.

Table 2- Results of ELISA for survey of gladiolus corm infection with CMV.

شکل 1- الگوی الکتروفورزی محصول RT-PCR ویروس موزاییک خیار با استفاده از آغازگرهای اختصاصی CMV-F و CMV-R در ژل آگارز 2/1% همراه با شاهد مثبت و منفی.

Figure 1- Electrophoresis pattern of products amplified by RT- PCR of CMV using CMV-F and CMV-R primers on 1.2% agarose gel.  Lane M, molecular weight marker (GeneRuler^TM 1kbp DNA ladder, Fermentas); Lane C^- ,negative control; Lane C⁺, positive control;  Empty lanes depict healthy samples and lanes with bands depict infected samples.

جدول 3- حذف CMV از گلایل با استفاده از روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم.

Table 3- CMV elimination from Gladiolus by thermotherapy along with meristem culture.

بررسی روش تلفیقی گرمادرمانی با کشت مریستم روی تولید گیاهچه‎های عاری از ویروس موزاییک خیار گلایل

باززایی، ریشه‎زایی، القای پداژه و حذف ویروس 18 مریستم گرمادرمانی شده و 14 مریستم گرما­درمانی نشده در اندازه نیم و یک میلی‎متر از پداژه‎های گلایل آلوده به CMV بررسی شد.  نتایج به­دست­آمده نشان داد که از 18 مریستم گرمادرمانی شده 10 گیاه باززایی شد و از این تعداد چهار گیاهچه عاری از ویروس بودند در حالیکه از 14 مریستم گرما­درمانی نشده هفت گیاه باززایی شد و از این تعداد دو گیاهچه عاری از CMV بودند. جزئیات نتایج در جدول 3 آورده  ‎شده‎است.

بررسی روش تلفیقی برق‎درمانی با کشت مریستم روی تولید گیاهچه‎های عاری از ویروس گلایل

حذف CMV از گلایل با استفاده از روش برق‎درمانی همراه با کشت مریستم پس از اعمال تیمار الکتریکی و سپس کشت مریستم  بررسی شد. از تعداد 34 نمونه که به مدت 10 دقیقه تحت اثر شدت جریان قرار داده شد پنج نمونه و از همین تعداد که به مدت 15 دقیقه تیمار شد تعداد شش نمونه عاری از ویروس شدند. جزئیات نتایج این آزمایش در جدول 4 آمده ‎است.

جدول4- حذف CMV از گلایل با استفاده از روش برق‎درمانی همراه با کشت مریستم ­هایی به اندازه 7/0 میلی­متر بر اساس نتیجه  RT-PCR.

Table 4- Elimination of CMV from Gladiolus by electrotherapy along with meristem culture from meristem with 0.7 mm in size based on RT-PCR.

بررسی تاَثیر روش کشت مریستم روی تولید گیاهچه‎های گلایل عاری از ویروس موزاییک خیار

باززایی، ریشه‎زایی، القای کورم و حذف ویروس از اندازه­های 5/0، 7/0 و یک میلی­مترمریستم‎های کشت‎شده در محیط‎کشت MS نشان داد که مریستم کشت شده با اندازه یک میلی­متر قادر به حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل نبود در حالیکه از مریستم­های کشت شده در اندازه 5/0 و 7/0 میلی­متردو نمونه عاری از ویروس شدند. نتایج این آزمایش در جدول 5 نشان داده‎شده‎است.

جدول 5- حذف CMV از گلایل با استفاده از روش کشت مریستم.

Table 5- CMV elimination from Gladiolus by meristem culture.

بحث

در این پژوهش به طور کلی میزان آلودگی پداژه‎های گلایل به ویروس موزاییک خیار در نمونه‎های جمع‎آوری شده ازپاکدشت 44/53 درصد و در نمونه‎های جمع‎آوری شده از کرج 26 درصد تعیین شد. بررسی میزان آلودگی پداژه‎های جمع‎آوری شده از تهران، کرج و محلات به ویروس موزاییک زرد لوبیا حاکی از 35/80 درصد آلودگی بوده­است. همچنین نتایج آن پژوهش نشان داده­است که پداژه‎های جمع‎آوری شده به ویروس موزاییک خیار، ویروس موزاییک توتون  و ویروس رگه‎ای توتون آلوده نمی­باشد (Sharifi, 2009). این اختلاف در نتایج را می­توان به تفاوت در مکان جمع­آوری پداژه­ها نسبت داد. با توجه به آلودگی بیش از نیمی از پداژه‎های موجود در بازار به ویروس موزاییک خیار، گستردگی دامنه میزبانی این ویروس و شیوه انتقال آن در طول فصل رشد، احتمال آلودگی اکثر گیاهان وجود دارد، بنابراین استفاده از پداژه‎های سالم برای کشت در مزارع جدید تولید گل از روش‎های اساسی برای کنترل آلودگی به ویروس موزاییک خیار و کاهش خسارت این ویروس می‎باشد.

در تحقیق حاضر از روش کشت مریستم انتهایی و همچنین گرمادرمانی و برق درمانی به همراه کشت مریستم برای حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل استفاده شد. نتایج به‎دست آمده نشان داد که میزان حذف ویروس از مریستم انتهایی با اندازه نیم میلی‎متر 66/66 درصد و از مریستم‎هایی با  اندازه 7/0 میلی‎متر 20 درصد بود (جدول 5). کشت مریستم انتهایی با اندازه 7/0-5/0 میلی‎متر برای حذف ویروس موزاییک زرد لوبیا از گلایل سبب حذف ویروس از 90-80 درصد گیاهان تیمار شده گردید (Bertaccini & Marani, 2003). کشت مریستم انتهایی با اندازه 5/0 تا 7/0 میلی‎متر برای حذف دو ویروس موزاییک خیار و موزاییک زرد لوبیا از گلایل سبب حذف هر دو ویروس از همه گیاهان شده است (Logan & Zettler, 1985). نتایج این تحقیق با یافته‎های فوق متفاوت بود. در این تحقیق  برای ردیابی ویروس در گیاهان باززایی‎شده از آزمون RT-PCR استفاده‎شد در حالیکه پژوهشگران یادشده برای شناسایی ویروس در گیاهان باززایی‎شده از آزمون سرولوژیکی الایزا استفاده کردند. بنابراین به‎نظر می‎رسد این اختلاف به‎دلیل استفاده از روش با حساسیت بیشتر (RT-PCR) در ردیابی ویروس در پژوهش حاضر می­باشد.

در تحقیق حاضر میزان حذف ویروس در روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم انتهایی در اندازه 5/0 میلی‎متر 100 درصد بود (جدول 3) که با نتایج پژوهش‎های قبلی مشابه است (Mangal et al., 2006; Selvarajan et al., 1999). از روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم انتهایی برای حذف دو ویروس موزاییک خیار و موزاییک زرد لوبیا از گیاه گلایل استفاده شده‎است و در نتیجه کشت مریستم با اندازه 5/0-3/0 میلی‎متر سبب عاری شدن 80 تا 100 درصد نمونه‎ها از هر دو ویروس شده است (Selvarajan et al., 1999) و در پژوهش دیگری روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم انتهایی با اندازه 7/0-5/0 میلی‎متر برای حذف این دو ویروس از گیاه گلایل سبب حذف هر دو ویروس به میزان 100 درصد گیاهان شده است (Mangal et al., 2006). کشت مریستم همراه با گرمادرمانی برای حذف ویروس موزاییک زرد لوبیا از گلایل‎های آلوده به این ویروس، مورد استفاده قرار‎گرفته‎است کشت مریستم با اندازه‎های 5/0 و یک میلی‎متر سبب حذف ویروس از 89 تا 99 درصد گیاهان شده‎ است (Sharifi Nezamabad et al., 2015). در پژوهش حاضر کارایی حذف ویروس در روش کشت مریستم همراه با گرمادرمانی مریستم با اندازه 5/0 میلی‎متر 100درصد و مریستم با اندازه 5/0 میلی‎متر بدون اعمال گرما 66/66 بود (جدول 3) که بالابودن درصد عاری از ویروس‎شدن در گیاهان حاصل از ریزنمونه‎های گرمادرمانی‎شده نسبت به گرمادرمانی‎نشده، نشان‎دهنده کارایی گرمادهی در تولید گیاهچه‎های عاری از ویروس است. نتایج بدست آمده توسط سایر محققین نیز نشان دهنده موثرتر بودن روش کشت مریستم همراه با گرمادرمانی نسبت به روش کشت مریستم به‎تنهایی در تولید اندام­های گیاهی عاری از ویروس می‎باشد (Koubouris et al., 2007; Manganaris et al., 2003; Wang et al., 2006).

در تحقیق حاضر روش برق‎درمانی برای اولین‎بار به‎منظور حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل استفاده‎شد. نتایج بدست‎آمده از بکارگیری روش برق‎درمانی نشان‎داد که شدت جریان 10 میلی‎آمپر به مدت 10 و 15 دقیقه به ترتیب باعث حذف 33/33 و 60 درصد ویروس از نمونه‎های باززایی‎شده شد. در حالیکه تیمار 15 میلی‎آمپر به مدت 10 و 15 دقیقه به ترتیب باعث حذف 60 و 75 درصد از نمونه‎های باززایی‎شد. پایه‎های مادری مو آلوده به ویروس ای انگور با استفاده از روش برق درمانی همراه با کشت مریستم سبب حذف ویروس در گیاهان تیمار شده با شدت جریان 20 و 30 میلی‎آمپر به مدت 15 دقیقه شده است در حالیکه تیمار 10 دقیقه قادر به حذف ویروس نشده است (Bayati et al., 2011). نتایج پژوهش حاضر با نتایج Bayati و همکاران (211) تفاوت دارد، در این تحقیق از اندازه مریستم 7/0 میلی‎متر استفاده‎شد درحالیکه که Bayati و همکاران (2011) از اندازه مریستم یک میلی‎متر استفاده کرده بودند و احتمالا اختلاف در میزان حذف ویروس به دلیل اختلاف در گونه گیاه میزبان، گونه ویروس و احتمالا اختلاف در اندازه مریستم کشت شده است.

در تحقیق حاضر در مجموع 73 درصد گیاهان تیمار شده با استفاده از آزمون الایزا عاری از ویروس تشخیص داده شدند درصورتیکه در آزمون ملکولی 42 درصد عاری از ویروس تشخیص داده شدند. تفاوت بین درصد ردیابی ویروس با این دو روش در نتایج سایر محققین نیز مشاهده شده است (Verma et al., 2004; Baker et al., 1993). این اختلاف را می­توان به دقت بیشتر روش RT-PCR نسبت به الیزا نسبت داد.

با توجه به اهمیت گل گلایل، آلودگی گسترده‎ پداژه­های موجود در بازار به ویروس موزاییک خیار و نحوه تکثیر این گل، توصیه می‎شود پداژه‎های گلایل عاری از ویروس موزاییک خیار با استفاده از روش کشت مریستم با اندازه 5/0 میلی­متر همراه با گرما­درمانی تولید و در اختیار تولیدکنندگان گل قرار گیرد.