بررسی امکان ریزازدیادی گیاه زینتی دراسنا با استفاده از روش کشت درون شیشه­ای

رضا شیرزادیان خرم آباد¹*، صدیقه نصررمزی²، اشرف السادات میرعباسی³

¹استادیار گروه بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان

² دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه گیلان

³ کارشناس پژوهشی پژوهشکده محیط زیست، جهاد دانشگاهی گیلان

تاریخ دریافت: 07/09/1391، تاریخ پذیرش: 05/08/1392

چکیده

دراسنا (Dracaena) از جمله گیاهان ارزشمند و زینتی در ایران و جهان محسوب شده که تکثیر انبوه و ایجاد تنوع ژنتیکی در آن در تحقیقات ریز ازدیادی و به­نژادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. در این تحقیق به­منظور کالوس­زایی و باززایی رقم Tricolor از گونه Dracaena marginata، از قطعات کوچک جوان ساقه با طول cm 5/0 استفاده شد. به­منظور بررسی کنترل آلودگی­های سطحی بافت‌های فوق از هیپوکلریت سدیم (غلظت­های 1%٬ 25/1% 5/1%) در زمان­های 15 و 10 دقیقه استفاده گردید. غلظت­های متفاوت از تنظیم کننده­های رشد 2,4-D، NAA و Kinetin در محیط پایه MS جهت ارائه مناسب­ترین محیط غذایی به­منظور القاء کالوس، باززایی شاخساره از کالوس­ و ریشه­زایی شاخساره مورد بررسی قرار گرفت. جهت انجام بخش­های مختلف این پژوهش از طرح­های آزمایشی مناسب استفاده گردید. نتایج بدست آمده نشان می­دهد که مناسب­ترین تیمار برای ضدعفونی قطعات فوق همراه با بالاترین درصد سلامت بافت­ها مربوط به غلظت 25/1% هیپوکلریت­سدیم به مدت 15 دقیقه بود. مناسب­ترین غلظت­های تنظیم کننده­های رشدی در محیط MS جهت القاء کالوس­ در قطعات کوچک ساقه دراسنا شامل mgL^-1 5/0 2,4-D و یا mgL^-1 1 NAA و میزان mgL^-1 1 از Kinetin به­منظور باززایی شاخساره از کالوس­ و غلظت mgL^-11 از NAA به­منظور القاء ریشه­زایی در شاخساره در محیط پایه MS تعیین شد. با توجه به تعیین محیط غذایی مناسب جهت القاء کالوس در بافت ساقه دراسنا و امکان باززائی شاخساره در این تحقیق، امکان به‌نژادی و انتقال ژن­های مطلوب به این گیاه زینتی ارزشمند تسهیل شده است.

 واژه­های کلیدی: Dracaena marginata، باززایی، تنظیم کنندگان رشد، کالوس، کشت بافت

مقدمه

گیاه دراسنا با نام علمی Dracaena spp. متعلق به خانواده Asparagaceae بوده و با نام انگلیسی Dracaena یا درخت اژدهای ماداگاسکار[1] شناخته می­شود. جنس Deracaena دارای 60 گونه بوده و در زیستگاه­های طبیعی (مناطق گرمسیری آسیا و آفریقا) به شکل درخت یافت می‌شود (Subhashini et al., 2011). چندین گونه آن مانند D. marginata،D. Fragrans  و D.Sanderiana از جمله گیاهان زینتی محسوب می‌شوند (Henny and Chen, 2003). دراسناها در روشنایی کم و محدود بخوبی رشد کرده و بهترین دامنه pH برای رشد آنها در حدود 5/6-6 است (McConnell et al., 1980). دراسناها همچنین از موادی استروئیدی چون Sapogenins وSaponins که دارای فعالیت سیتوتوکسینی بر علیه سلول‌های سرطانی هستند غنی می‌باشند (Yokoduk et al., 2000). تکثیر این گیاهان علاوه بر بذر با استفاده از روش قلمه زنی امکان پذیر است. از آنجائیکه تعداد جوانه جانبی و نیز جوانه انتهایی در دراسنا محدود است،  لذا تکثیر انبوه این گیاه از نقطه نظر دارویی و تجارتی از اهمیت قابل توجهی برخوردار بوده و از جمله اهداف تحقیقات ریزازدیادی و به­نژادی محسوب می­شود. مطالعات زیادی در زمینه ریزازدیادی انواع گونه­های دراسنا با استفاده از روش کشت بافت انجام شده­است. اولین بار تکثیر درون شیشه‌ای دراسنا با استفاده از جوانه انتهایی در سال 1976 انجام شد (Miller & Murashige, 1976). مطالعات بعدی با استفاده از تکثیر جوانه جانبی در D. deremensis (Badawy et al., 2005; Blanco et al., 2004) و در D. fragrans و باززایی قطعات ساقه در D. marginata (Dragan et al., 1989; Chua et al., 1981, ) و D. fragrans (Vinterhalter, 1989) صورت گرفت. تأثیر 4 ماده تنظیم کننده رشد از جمله BA، 2,4-D، NAA و IBA بر کال­زایی، باززایی و ریشه­زایی قطعات کوچک ساقه D. fragrans بررسی شد (Vinterhalter, 1989). در پژوهشی از هورمونIAA  طبیعی عصاره نارگیل برای تولید و رشد ریشه در D. purplecompacta L. استفاده شد (Agampodi and Jayawardena, 2009). همچنین به ترتیب غلظت­های­ mgL^-1 3/2 ، 1/1 و 2/0 از IAA جهت کالوس‌زایی، جوانه­زنی و ریشه­زایی Dracaena surculosa استفاده شده است (Liu et al., 2010). استفاده از غلظت­ mgL^-1 1 از NAA و Kinetin نیز برای کالزایی قطعات کوچک دراسنا مناسب دانسته شده است (Blanco et al., 2004). همچنین بیشترین تعداد جوانه ساقه با افزودن mgL^-1 1 از IAA و Kinetin و نیز بیشترین تعداد ریشه را با افزودن mgL^-1 5 از IBA به محیط کشت MS در Dracaena fragrans بدست آمد (Badawy et al., 2005).  'Tricolor'از جمله زیباترین ارقام گلدانی دراسنا از گونه Dracaena marginata محسوب شده که دارای برگ­های سبز تیره با حاشیه قرمز و در قسمت پایین و مرکز برگ دارای نوار طلائی رنگ است. پژوهش حاضر شناسایی مناسب­ترین تیمار  ضدعفونی قطعات کوچک و جوان ساقه‌ها با بالاترین درصد سلامت در بافت­های فوق٬ و نیز بررسی مناسب­ترین محیط غذایی القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه D. marginata (Tricolor)، باززایی کالوس­ها و ریشه­زایی گیاهچه­ها را مورد توجه قرار داد.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی، محیط کشت­، تنظیم کنندگان رشد و خاک مورد استفاده

در این تحقیق از گیاه زینتی رقم 'Tricolor'  متعلق به گونه Dracaena marginata استفاده شد. تنظیم کنندگان رشدی مورد استفاده در این پژوهش شامل NAA، 2,4-D و Kinetin (غلظت­های مختلف صفر تا 3 mgL^-1) بودند. محیط کشت اصلی و پایه مورد استفاده محیط غذایی MS با 7/5 pH= (Murashige & Skoog, 1962) بود. نمونه­های کشت شده به­­­منظور کالزایی، جوانه­زنی و ریشه­زایی، در اتاقک رشد در دما و فتوپریود مناسب و مورد نیاز در هر بخش نگهداری شدند. در مراحل نهایی جهت رشد و ریشه­زایی، گیاهچه­ها به خاک مناسب (ترکیبی از پیت­ماس و شن) انتقال یافتند.

بررسی آلودگی­های سطحی قطعات کوچک ساقه دراسنا

ابتدا گیاهان مادری به مدت یک ماه در گلخانه نگهداری و مراقبت­های لازم به­منظور رشد مناسب و سالم گیاهان اعمال گردید. از سه غلظت متفاوت هیپوکلریت­سدیم شامل غلظت‌های 1%٬ 25/1% 5/1% در ترکیب با دو دوره زمانی 10 و 15 دقیقه به­منظور کنترل آلودگی­های سطحی قطعات کوچک ساقه استفاده شد و مناسب­ترین تیمار در این خصوص جهت کنترل آلودگی سطحی قطعات کوچک ساقه با بالاترین درصد سلامت و زنده­مانی بافت­ها شناسایی گردید.

کالوس­زایی در قطعات کوچک ساقه دراسنا

این آزمایش به­منظور شناسایی مناسب­ترین محیط غذایی القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه انجام شد. لذا ­قطعات کوچک سالم و جوان ساقه با طول cm 5/0 از گیاهان مادری جدا و پس از اعمال مناسب­ترین روش ضدعفونی، در سطح محیط کشت MS حاوی مقادیرمتفاوتی (mgL^-10  ، 5/0 ، 1 و 2) از تنظیم­کنندگان رشدی NAA و 2,4-D کشت شدند. شرایط محیطی مورد نیاز نگهداری بافت­های کشت شده، فتوپریود (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) و دمای 26 درجه سانتی­گراد اعمال شد. بعد از گذشت حدود 4 هفته کالوس­ها به تدریج و شمارش تعداد کالوس­ها انجام و داده­های بدست آمده بر اساس طرح کاملاً تصادفی در 3 تکرار آنالیز شدند.

باززایی شاخساره­ از کالوس­

به­منظور باززایی شاخساره، کالوس­های ایجاد شده با سن مشابه به محیط کشت MS حاوی مقادیر  mgL^-10 ، 1 ، 2 و 3 از Kinetin انتقال یافتند. نگهداری بافت­ها در این مرحله تحت فتوپریود (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و دمای 26 درجه سانتی­گراد اعمال شد. در نهایت تعداد شاخساره­های باززایی شده از کالوس­ها شمارش شد. سپس تعداد شاخساره باززایی شده از کالوس‌ها شمارش و داده­های بدست آمده با استفاده از طرح کاملاً تصادفی در 3 تکرار آنالیز شد.

ریشه­زایی در شاخساره­ها و انتقال به خاک

شاخساره­های باززایی شده از مرحله قبل به­منظور القاء ریشه­ به محیط تغذیه­ای MS حاوی مقادیر متفاوتی از NAA (mgL^-10 ، 5/0 و 1) انتقال یافتند. محیط نگهداری شاخساره برای ریشه­زایی شامل فتوپریود (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و دمای 26 درجه سانتی­گراد اعمال شد. در این آزمایش تعداد شاخساره­های ریشه­دار شده شمارش و با شرایط خاک مقایسه شدند. شاخساره­ها بعد از ریشه­زایی و رشد کافی برای سازگاری با شرایط in vivo انتقال و به مدت 2-1 هفته در ماسه استریل و رطوبت محیطی حدود 95% نگهداری و آنگاه به خاک مناسب رشد و نمو گیاه دراسنا منتقل شدند. لازم به ذکر است که آنالیز کلیۀ داده­های این پژوهش با نرم افزار MSTAT-C تحت برنامه windows انجام و تمام نمودارها با استفاده از برنامه  Excel نسخه 2003 رسم شدند.

نتایج و بحث

کنترل آلودگی در قطعات کوچک ساقه دراسنا

حفظ سلامتی حداکثری بافت­های کوچک ساقه مورد استفاده و کنترل مناسب آلودگی در ریزازدیادی گیاهان زینتی از اهمیت زیادی برخوردار است. نتایج این آزمایش نشان می­دهد که افزایش غلظت و زمان تیمار بافت­ها با محلول هیپوکلریت­سدیم موجب افزایش امکان کنترل آلودگی­های سطحی در قطعات کوچک ساقه و افزایش روند خسارت به سلامت و نکروزه شدن بافت­های مورد استفاده می­شود (شکل1). افزایش درصد هیپوکلریت­سدیم به میزان 5/1% در دو فاصله زمانی 10 و 15 دقیقه تأثیر مطلوبی بر کنترل آلودگی بافت دارد، اما از میزان سلامت نمونه­ها کاسته شد. اما با کاهش میزان هیپوکلریت­سدیم به 1% نیز به دلیل افزایش شدت آلودگی، بافت­های بیشتری از بین رفت. در این خصوص استفاده از میزان 25/1% محلول هیپوکلریت­سدیم به مدت 15 دقیقه میانگین مطلوبی را در زمینه کنترل آلودگی (63%) و سلامت بافت­ها (36%) ارائه نمود (شکل 1).

شکل1- تأثیر مقادیر مختلف هیپوکلریت‌سدیم و دورهای زمانی متفاوت بر کنترل آلودگی و سلامت بافت­ها.

Figure 1- The effect of various concentrations of sodium hypochlorite in combination with two different time periods on decontamination and tissue healthiness.

در پژوهشی استفاده از هیپوکلریت­سدیم جهت استریل نمودن بافت­ها مناسب شناخته شده و قرار دادن قطعات کوچک دراسنا در هیپوکلریت سدیم 5% به مدت 10 دقیقه جهت ضدعفونی پیشنهاد شده است (Chua et al., 1981). در یک بررسی متفاوت تأثیر سه ماده هیپوکلریت­سدیم، سرکه و کیتوزان [2]بر سلامت بافت­های Dracaena sanderiana بررسی و گزارش گردید. در این خصوص بیشترین درصد سلامت بافت­ها مربوط به استفاده از کیتوزان بود، اما هیپوکلریت­سدیم نیز در این مورد دارای کارایی قابل قبولی بود (Gunathilake and Abeywickrama, 2011). در پژوهشی دیگری استفاده توأم از هیپوکلریت­سدیم و مرکوریک‌کلراید[3] به­منظور استریل نمودن قطعات کوچک دراسنا موثر بود. قرار دادن قطعات کوچک در هیپوکلریت­سدیم %075/0 به همراه gL^-1 3/0 مرکوریک­کلراید برای مدت 20 دقیقه مناسب بود٬ اما با افزایش میزان مصرف هیپوکلریت سدیم، تعداد بافت سالم کاهش می‌یابد (Badawy et al., 2005). لذا نتایج این تحقیق ضمن تأیید مطالعات انجام شده مبنی بر استفاده از هیپوکلریت­سدیم به­عنوان منبع ضدعفونی کننده مناسب، در کلیه مراحل آزمایش از میزان 25/1% محلول هیپوکلریت­سدیم به مدت 15 دقیقه جهت ضدعفونی قطعات کوچک ساقه استفاده نموده است.

القاء کالوس­ در قطعات کوچک ساقه دراسنا

به­منظور شناسایی مناسب­ترین محیط غذایی القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا، در 2 آزمایش متفاوت سطوح مختلف دو تنظیم کننده رشد NAA و 2,4-D شامل mgL^-10 ، 5/0 ، 1 و 2 در محیط پایه MS مورد بررسی قرار گرفت. بعد از گذشت حدود 4-3 هفته از کشت نمونه­های کوچک ساقه ، کالوس­ها به تدریج ظاهر شدند. کالوس‌ها عمدتاً در نقاط برش خورده در بافت‌های کوچک جوان ساقه دراسنا القا گردید. بسیاری از کالوس­های القاء شده در این مرحله فشرده و زرد رنگ بوده و در مراحل بعدی مورد استفاده قرار گرفتند (شکل 2).

شکل 2- a) کشت قطعه کوچک ساقه دراسنا (5cm) در سطح محیط کشت القا کالوس­زایی، b) کالوس حاصله از قطعه کوچک ساقه دراسنا بعد از مدت 4 هفته.

Figure 2- a) Dracaena small stem segments cultured on callus induction media, b) Callus derived from small stem segments after 4 weeks.

براساس جدول تجزیه واریانس (جدول 1) بین سطوح مختلف 2,4-D و NAA در زمینه القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا اختلاف معنی­داری در سطح 1% ملاحظه می­شود. مقایسه میانگین تأثیر سطوح مختلف تنظیم کنندگان رشد فوق بر میزان کالوس­زایی بافت­های ساقه با استفاده از آزمون  LSDو 5%= α انجام شد (شکل 3و4). همانطور که مشاهده می‌شود در غلظت  mgL^-15/0 از 2,4-D بیشترین درصد و بعد از آن غلظت  mgL^-11 و در نهایت غلظت  mgL^-12 کمترین درصد القاء کالوس را القاء نمودند (شکل 3). لذا با افزایش غلظت 2,4-D از  mgL^-15/0 تا میزان  mgL^-12 از درصد کال­زایی کاهش می­یابد. در این خصوص می­توان محیط غذایی حاوی mgL^-15/0 از 2,4-D را به­عنوان مناسب­ترین غلظت تنظیم­کننده رشد جهت القاء کالوس توصیه نمود. هیچگونه کالوسی در بافت­های کوچک ساقه کشت شده بر روی محیط­های غذایی فاقد مواد تنظیم­کننده رشد القاء نگردید. همچنین هیچگونه شاخساره‌ای از کالوس‌ها در محیط‌های حاوی2,4-D القا نگردید. لذا در قسمت بعدی باززایی شاخساره‌ها از کالوس‌ها با استفاده از تنظیم کننده رشد Kinetin مورد توجه قرار گرفت. در پژوهشی جهت کالوس زایی قطعات کوچک ساقه دراسنا دو سطح mgL^-15/0 و 8/0 از 2,4-D را بر کال­زایی قطعات Dracaena fragrans cv. را بررسی و پیشنهاد شد علی رغم اینکه بیشترین درصد کال‌زایی مربوط به غلظت  mgL^-18/0 مربوط می‌شود، اما کالوس شکل گرفته در این غلظت در مقایسه با کالوس‌های بدست آمده از غلظت mgL^-15/0 از توانایی باززایی کمتری برخوردارند (Wen-Liang, 2002; Wen-Liang, 2003). لذا وی غلظت mgL^-15/0 از 2,4-D را بهترین غلظت در زمینه کالوس زایی معرفی کرد. در پژوهشی دیگر نیز میزان 2,4-D  mg L^-125/0-5/0 برای کال­زایی معرفی شد (Vinterhalter, 1989). نتایج فوق بر اهمیت تأثیر تنظیم کننده­های فوق بر القاء کالوس از قطعات کوچک ساقه دراسنا و نیز نقش موثر آنها در زمینه جنین­زایی کالوس­ها صحه میگذارد. لازم به ذکر است که اکسین­ها خصوصاً 2,4-D و NAA در زمینه القاء کالوس نقش مهمی دارند (Singh et al., 2008).

جدول 1- تجزیه واریانس تأثیرات جداگانه هر یک از تنظیم کننده‌های NAAو  2,4-Dدر 2 آزمایش کال‌زایی قطعات کوچک ساقه دراسنا و آزمایش تأثیرKinetin بر باززایی کالوس‌ها.

Table 1- Variance Analysis of individual effects of various levels of 2,4-D and NAA on callus induction in small stem segments of Dracaena and effect of Kinetin on plantlet regeneration from callus.

^** در سطح احتمال 1% و 5% معنی­دار است.

شکل 3- مقایسه میانگین تأثیر غلظت­های متفاوت 2,4-D بر القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا.

Figure 3- Mean comparison of different concentrations of 2, 4-D on Dracaena callus induction.

بر اساس نتایج بدست آمده در خصوص بررسی تأثیر سطوح مختلف NAA (شکل 4)٬ هیچگونه کالوسی در بافت­های کشت شده روی محیط­های غذایی فاقد NAA تشکیل نشد. همچنین غلظت mgL^-11 دارای بیشترین درصد القاء کالوس و به ترتیب در غلظت­های mgL^-15/0 و  mgL^-12 درصد القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا کاهش یافت (شکل 3). لذا در این خصوص می­توان محیط غذایی حاوی mgL^-11 از NAA را به­عنوان مناسب­ترین غلظت جهت القاء کالوس توصیه نمود.

شکل 4 - مقایسه میانگین تأثیر غلظت­های متفاوت NAA بر القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا.

Figure 4- Mean comparison of different concentrations of NAA on callus induction in stem segments of Dracaena.

بررسی سطوح مختلف 2,4-D و NAA در زمینه القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا نشاندهنده اهمیت این دو ماده تنظیم کننده بر القا کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا می‌باشد (Wen-Liang, 2002). بنابراین نتایج دیگر محققان نیز دستاوردهای این تحقیق را تأیید می‌کند. لذا با بر اساس نتایج حاصله، اضافه نمودن میزان  mgL^-15/0 از 2,4-D و یا mgL^-11 از NAA به تفکیک در محیط غذایی MS توصیه شده و می­تواند موجب القاء درصد قابل توجهی از کالوس­ها در قطعات کوچک ساقه دراسنا شود (شکل 3 و4).

باززایی شاخساره­ از کالوس­

در این قسمت به­منظور باززایی شاخساره دراسنا از کالوس­های بدست آمده، از غلظت­های متفاوت Kinetin (mgL^-10 و 1 و 2 و 3) در محیط کشت MS استفاده شد. بعد از گذشت 4 هفته، القاء تمایز در کالوس­ها به صورت تولید کلروفیل و ظاهر شدن تدریجی تمایز برگچه­ها مشاهده شد (شکل 5).

شکل 5- تمایز کالوس­های حاصله از قطعات کوچک ساقه دراسنا و باززایی آنها (a-c).

Figure 5- a, b and c) callus Differentiation and regeneration from small stem segments Dracaena.

بر اساس نتایج تجزیه واریانس (جدول 1) در زمینه باززایی شاخساره از کالوس­های مورد استفاده، بین سطوح مختلف Kinetin در سطوح احتمال 1% و 5% اختلاف معنی­داری وجود دارد. مقایسه میانگین تأثیر سطوح مختلف Kinetin بر میزان تمایز شاخساره از کالوس‌ها با استفاده از آزمون  LSDو 5%= α انجام شد (شکل 6). نتایج مقایسه میانگین تأثیر سطوح مختلف Kinetin بر میزان تمایز نشان می­دهد که بیشترین درصد باززایی به ترتیب در غلظت­های  mgL^-11 و mgL^-12 از  Kinetinبه ترتیب به میزان 69% و 40% مشاهده شد. در غلظت  mgL^-13 از Kinetin هیچ­گونه باززایی در کالوس­ها مشاهده نشد (Rout et al., 1990) (شکل 6). لذا در صورت استفاده ازKinetin درمقادیربین  mgL^-11 و  mgL^-12 امکان القاء تمایز در کالوس­ها افزایش می­یابد (Chua et al., 1981). لازم به ذکر است که Kinetin در القاء تشکیل جوانه و باززایی شاخساره از کالوس، تقسیم سلولی و تمایز بافت­ها نقش داشته و نیز مانع از نکروزه و زرد شدن قطعات کوچک ساقه می­شود (Singh et al., 2008).

شکل 6- مقایسه میانگین تأثیر غلظت­های متفاوت Kinetin به­منظور باززایی و تمایز کالوس.

Figure 6- Mean comparison of different concentrations of Kinetin on callus Differentiation and regeneration.

در پژوهشی میزان  mgL^-11 از Kinetin را به عنوان مناسب‌ترین غلظت جهت باززایی شاخساره­های  Dracaena deremensisتوصیه شد (Blanco et al., 2004). در پژوهشی دیگر نیز غلظت mgL^-1 1/1 از IAA جهت باززایی شاخساره گیاه Dracaena surculosa از کالوس توصیه شده است (Liu et al., 2010).  غلظت‌های متفاوتی از Kinetin جهت باززایی شاخساره Dracaena fragrans در سه محیط کشت MS،¾ MS  وMS  ½ بررسی و پیشنهاد شده است که استفاده از mgL^-11 Kinetin همراه با  mgL^-15/0 IAA برای باززایی شاخساره­ها در محیط کشت MS ½ موثر بوده و با افزایش غلظت Kinetin از باززایی کاسته می‌شود (Badawy et al., 2005). همچنین این محیط بیشترین تعداد برگ را تولید کرد. طی پژوهشی با بهره گیری از محیط پایه MS حاوی  Kinetin mgL^-11 و میزان  mgL^-18/0 از IAA بیشترین درصد باززایی شاخساره را بدست آمد (Kobza et al., 1991). در باززایی گیاهچه­های کتان از Kinetin استفاده و توصیه شده که بیشترین درصد باززایی در محیط کشت MS حاوی Kinetin  mgL^-125/0 حاصل می‌شود و با افزایش از مقدار فوق درصد باززایی کاهش می‌یابد (Rauf et al., 2004). در پژوهشی دیگر نیز بیشترین درصد باززایی شاخسارهDracaena marginata cv. Tricolor از محیط MS حاوی mgL^-14 BA و mgL^-105/0 NAA بدست آمد، در حالی که با استفاده از محیط کشت MS حاوی IBA و NAA (mgL^-12 و1 و 5/0) تعداد ریشه افزایش چشمگیری داشت (Atta-Alla et al., 1996). لذا براساس نتایج بدست آمده در این پژوهش استفاده از غلظت  mgL^-11 از Kinetin در محیط پایه MS جهت باززایی شاخساره‌ها از کالوس‌های دراسنا توصیه می‌شود.

ریشه­زایی در شاخساره

شاخساره­های بدست آمده از مرحله قبل به­منظور القاء ریشه­زایی، به محیط کشت MS حاوی مقادیر متفاوت از NAA (mgL^-10 و 5/0 و 1) انتقال یافتند (شکل7 و8). در این آزمایش محیط خاک استریل به عنوان شاهد در نظر گرفته شد.

شکل 7- ریشه­زایی شاخساره های دراسنا در محیط کشت القاء ریشه (a-d)­.

Figure 7- Root induction in regenerated Dracaena plantlets in root induction medium (a-d).

بر اساس نتایج بدست آمده در این آزمایش استفاده از NAA در غلظت  mgL^-11 میتواند بیشترین درصد ریشه­زایی(14%) را در شاخساره­ها القاء نماید. سپس به ترتیب غلظت  mgL^-15/0 به میزان 2/6% و نمونه شاهد یعنی گیاهچه­های انتقال یافته به خاک با میزان 95/1% توانستند ریشه زایی را القا نمایند. همچنین عدم استفاده از NAA کمترین درصد ریشه­زایی یعنی 1% را داشت که این مقدار میزان از درصد ریشه­زایی گیاهچه­ها در خاک کمتر بود (شکل 8). لذا در صورت استفاده از NAA به میزان  mgL^-11، درصد ریشه­زایی افزایش می­یابد اما با افزایش این مقدار، درصد ریشه­زایی کاهش یافت (شکل 8).

شکل 8- تأثیر غلظت­های متفاوتNAA  بر القاء ریشه در دراسنا در مقایسه با خاک.

Figure 8- Effect of various concentrations of NAA on root induction in Dracaena in comparison with soil.

براساس مطالعات انجام شده تعیین گردید که 100-90% ریشه­زایی در محیط حاوی NAA رخ داده و موجب کوتاه و ضخیم شدن ریشه­ها می­شود (Stankovic, 1991). همچنین استفاده توأم از IBA و NAA را بر ریشه­زایی بررسی و بیان شد که غلظت  mgL^-11 از NAA بیشترین تعداد ریشه را تولید نمود و موجب کاهش طول ریشه می‌شود (Badawy et al., 2005). همچنین با افزایش غلظت NAA تا  mgL^-15 رشد ریشه متوقف شد. سطوح مختلف NAA (ppm 0، 100، 200، 300 و 400) در زمان­های 72، 48 و 24 ساعت روی گیاه Dracaena sanderiana (lucky bamboo) بررسی و مشخص شد که استفاده از میزان ppm NAA 100، 200 و 300 در زمان­های 48 و 72 ساعت بیشترین درصد ریشه­زایی را القا می‌کند (Shakouri et al., 2012). در این تحقیق همچنین توصیه شد که با افزایش غلظت NAA قطر ریشه افزایش ولی از طول آن کاسته می­شود. براساس نتایج بدست آمده در تحقیق حاضر می‌توان غلظت mgL^-11 از NAA را برای القاء ریشه در شاخساره­های باززایی شده از کالوس‌های حاصله از قطعات کوچک ساقه دراسنا توصیه نمود.

انتقال به خاک و سازگاری با شرایط in vivo

یکی از مهمترین مراحل تکنیک کشت بافت انتقال موفقیت­آمیز گیاهان بعد از تکثیر از محیط in vitro به  in vivoاست که به دلیل تغییر شرایط محیطی ضروری است با دقت و توجه ویژه انجام گیرد. شرایط in vitro عموماً شامل نور کم، رطوبت زیاد و ریشه­زایی ضعیف است، در حالی که شرایط in vivo از نظر نور و حرارت بسیار متفاوت است (Wardle et al., 1983). براین اساس ابتدا روی گلدان­ها یک مانع پلاستیکی همراه با چند منفذ به­منظور هوادهی مناسب قرار می‌گیرد. بعد از مدت یک هفته و اطمینان از رشد مناسب گیاهچه­ها، سزپوش فوق برداشته می‌شود. قابل ذکر است که یکی از نهاده‌های اصلی تولید برای پرورش گیاهان زینتی به ویژه گیاهان گلدانی، بسترهای کشت مناسب است. لذا تأمین و آماده­سازی خاک مناسب برای دراسنا دارای اهمیت ویژه­ای است. بدین منظور گیاهچه­ها به مدت 2-1 هفته در ماسه استریل و رطوبت محیطی حدود 95% نگهداری و آنگاه به خاک مناسب (ترکیبی از پیت ماس و شن با نسبت 1:1) شده و به گلخانه انتقال یافتند (شکل 9).

شکل 9- انتقال گیاهچه­های دراسنا به خاک (a-c).

Figure 9- Transfer of Dracaena plantlets to the proper soil (a-c).

در مجموع می­توان گفت مناسب­ترین غلظت تنظیم کننده رشد جهت القاء کالوس در قطعات کوچک ساقه دراسنا mgL^-15/0 2,4-D و mgL^-11 NAA و میزان mgL^-11 Kinetin به‌منظور باززایی شاخساره از کالوس و غلظت mgL^-11 NAA به­منظور القاء ریشه­زایی در شاخساره در محیط غذایی MS است. همچنین می­توان گفت که با توجه به ارائه مناسب محیط غذایی جهت القاء کالوس در بافت ساقه دراسنا و امکان باززائی شاخساره­ها، امکان به­نژادی این گیاه زینتی و استفاده از این روش جهت انتقال ژن­های مطلوب فراهم شده است.