مقایسه سطوح مختلف بیان ژنRheb در بافت های مختلف بز کرکی راینی

مقایسه سطوح مختلف بیان ژنRheb  در بافت های مختلف بز کرکی راینی

فاطمه توحیدی نژاد¹، محمدرضا محمدآبادی*²، علی اسمعیلی زاده کشکوئیه²، عذرا نجمی نوری³

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد بخش علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

² دانشیار بخش علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

³ دانشجوی کارشناسی ارشد بخش علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج

تاریخ دریافت: 10/12/1392، تاریخ پذیرش: 31/04/1393

چکیده

ژن Rheb تحت عنوان ژن اولیه فوری[1] (IEG) برای اولین بار در سال 1994 شناسایی شد که دارای 184 اسید آمینه و وزن ملکولی 20497 دالتون است. Rheb متعلق به خانواده Ras است که چارچوب کربوکسی ترمینال CAAX را کد می­نماید که نشان می­دهد پروتئین ممکن است تحت فارنسیلاسیون بعد از ترجمه[2] قرار گیرد. Rheb یک فاکتور تنظیم کننده بالادست مسیر سیگنال­دهی mTOR است و Rheb-GTP می­تواند mTOR را فعال کند که القا کننده قوی فسفوریلاسیون S6K1 اندوژنوس در رزیدوهای ترئونین 389، ترئونین 421 و سرین 424 می­باشد. بیان بیش از حد Rheb رشد سلولی را تحریک می­کند، در حالی­که توقف بیان Rheb سنتز پروتئین و رشد سلولی را مهار می­کند. بیان بیش از حد Rheb-GAP  فعالیت mTOR را مهار می­کند و ناحیه برش عرضی فیبر را در ماهیچه­های اسکلتی پستانداران کاهش می­دهد. بین میواستاتین و مسیرهای سیگنال­دهی mTOR در ماهیچه­های اسکلتی پستانداران اثرمتقابل وجود دارد. نمونه­ها از بافت­های مغز، قلب، شش، پانکراس، طحال، کلیه، کبد و بیضه مربوط به بز کرکی راینی تهیه شدند. RNA استخراج شده در دمای منفی80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. کیفیت و کمیت RNA بررسی و سنتز  cDNA انجام شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز صورت گرفت. محصولات PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شد و با نرم افزار Gene Tools سطوح مختلف بیان در بافت های ذکر شده، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که این ژن در تمامی بافت های بررسی شده بیان شده است و بیشترین سطح بیان در بافت کلیه و کمترین سطح بیان در بافت های پانکراس و بیضه مشاهده شد. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل آماری توسط نرم افزار SPSS نشان می دهد که بیان ژن Rheb در بز کرکی رائینی در بین بافت های مختلف تفاوت معنی داری در سطح 1 درصد دارد. لذا می­توان پیشنهاد کرد که احتمالا ژن Rheb در سلول های بز نقش دارد و باید در تحقیقات بعدی این نقش(­ها) شناسایی شوند.

کلمات کلیدی: ژن Rheb، بز کرکی راینی، بیان، بافت.     

مقدمه

با توجه به رشد روز افزون جمعیت جهان استفاده از روش­های نوین برای تاٴمین نیازهای مختلف این جمعیت عظیم ضروری به نظر می رسد. در کشورهای توسعه یافته پرورش دام به روش­های علمی جایگزین روش­های سنتی گردیده است و این امر توانسته تحول بزرگی در تولید محصولات دامی ایجاد کند. در اواخر دهه 80 میلادی مطالعات و بررسی های به عمل آمده روشن نمود که مکانیسم­های مولکولی در زمره مهم­ترین فرایندهای ژنتیکی (مشتمل بر همانندسازی DNA، رونویسی، ترجمه و حتی نحوه تنظیم ژن ها) هستند (Ahmadikhah, 2008). ماده ژنتیکی[3] یک سلول دارای تعداد زیادی ژن می باشد که هیچ گاه به طور همزمان بیان نمی­شوند و در یک زمان خاص فقط تعداد کمی از آنها بیان شده و پروتئین یا آنزیم مورد نیاز سلول را تولید می­نمایند. نیاز به بیان ژن توسط محیطی که در آن رشد می کند کنترل می­شود و در صورت عدم نیاز به فرآورده ژن، آن ژن به صورت خاموش و غیرفعال باقی خواهد ماند. ساز و کار بیان ژن اولین بار در باکتری E.coli کشف شد. بیان ژن های یوکاریوتی تحت کنترل موقت و چندبعدی می­باشد. تنها یک مجموعه نسبتاً کوچک از تمام ژنوم در هر یک از انواع بافت ها بیان می شود و نیز بیان ژن­ها به مرحله نمو بستگی دارد. بنابراین، بیان ژن در یوکاریوت­ها برای هر بافت اختصاصی است. همچنین مقدار محصولات ژن که در همان بافت و نیز در سایر بافت­هایی که آن محصول را می­سازند، ساخته شده سبب تنظیم بیان آن ژن می­شود. پروتئین­های Ras[4] تنظیم کننده واکنش­های بیوشیمیایی مختلفی در داخل سلول­ها هستند و از جمله در تکثیر سلولی و تمایز، انتقال وزیکولی و پلاریته (قطبیت) سلولی نقش دارند (Yamagata et al. 1994). ژن Rheb (همولوگ Ras غنی شده در مغز[5]) در یوکاریوت­ها بسیار حفاظت شده است و در همه آنها از مخمر تا پستانداران وجود دارد (Urano et al. 2001). این ژن GTPase کوچکی را کد می کند که ارتباط نزدیکی با RAS دارد که یا در حالت فعال (باند شده به GTP) و یا در حالت غیر فعال (باند شده به GDP)، وجود دارد (Clark et al. 1997; Im et al. 2002). ژن Rheb تحت عنوان ژن اولیه فوری[6] (IEG) برای اولین بار در سال 1994 شناسایی شد که دارای 184 اسید آمینه و وزن ملکولی 20497 دالتون  است (Yamagata et al. 1994). Rheb متعلق به خانواده Ras است که باکس کربوکسی ترمینال CAAX را کد می­نماید و ممکن است پروتئین تحت فارنسیلاسیون بعد از ترجمه[7] قرار گیرد (Hancock et al. 1989; Kinsella et al. 1991; Knox 1995). اما، نکته ویژه این است که Rheb یک آرژنین به جای گلایسین در مکان 12 دارد که در خانواده Ras حفاظت شده است (Lau and Nathans 1987; Saffen et al. 1988). مشابه دیگر پروتئین­های Ras، نواحی با همولوژی بالا بین Rheb و خانوادهRas  وجود دارد که متناظر با 5 باکس Ras دخیل در باند شدنGTP  هستند و شامل باکس G1 تا G5 هستند (Bourne et al. 1991). بدیهی است که Rheb یک گوانوزین تری فسفات (GTPase) کوچک شبیه Ras است که بین فرم فعال باند شده به GTP و فرم غیرفعال باند شده به GDP نوسان می­کند (Yamagata et al. 1994; Aspuria and Tamanoi 2004). Rheb یک فاکتور تنظیم کننده بالادست مسیر سیگنال دهی [8]mTOR (هدف متازوایی راپامایسین) است و Rheb-GTP می­تواند mTOR را فعال کند که القا کننده قوی فسفوریلاسیون S6K1[9] اندوژنوس در رزیدوهای ترئونین 389، ترئونین 421، و سرین 424 می­باشد (Castro et al. 2003; Sarbassov et al. 2005; Sato et al. 2008). mTOR یک پروتئین کیناز سرین/ترئونین است که با Rheb همبسته است. تنظیم کننده بالادست Rheb کمپلکس TSC2/TSC1 است که یک پروتئین فعال کننده TPase (GAP) است و مسیر سیگنال دهی mTOR را به وسیله تحریک هیدرولیز GTP فرم فعال Rheb (Rheb-GTP) به فرم غیر فعال Rheb (Rheb-GDP) مهار می­کند (Tee et al. 2003; Zhang et al. 2003; Hay and Sonenberg 2004). Rheb یک کیناز کلیدی متصل کننده کمپلکس TSC2/TSC1 و mTOR است. شواهد نشان می­دهد که Rheb از طریق باند کردن مستقیم Rheb-GTP به mTOR برای پیشرفت فعال سازی mTOR تنظیم mTOR را انجام می­دهد (Long et al. 2005). mTOR کنترل کننده مرکزی رشد سلول است، برای رشد و توسعه اولیه سلول ضروری است، حافظه و پیری را در بزرگسالان تحت تأثیر قرار می­دهد و در سیگنال دهی آن فاکتورهای رشد، مواد مغذی، انرژی و استرس نقش دارند. محققین دیگر نشان داده­اند که FKBP38 می­تواند به mTOR باند شود تا فعالیت آن را مهار کند و Rheb-GTP به طور مستقیم با FKBP38 اثرات متقابل ایجاد می­کند تا از همبستگی FKBP38 با mTOR جلوگیری نماید (Bai et al. 2007; Ma et al. 2008). اما، خصوصیات بیوشیمیایی جامع و گسترده اثرمتقابل Rheb/FKBP38 با استفاده از سه ارزیابی در شرایط آزمایشگاهی[10] مختلف  مشخص نکرده است که بین Rheb و FKBP38 اثرمتقابل وجود دارد (Katharina et al. 2009). بنابراین مکانیسم اثر متقابل بین Rheb و FKBP38 هنوز تحت شک و تردید است و نیاز به مطالعه بیشتر دارد.

Rheb به صورت آنتاگونیست TSC (کمپلکس اسکلروزیس غده­ای[11])، که فعال کننده فعالیت Rheb-GTPase، یعنی Rheb-GAP (پروتئین فعال کننده GTPase)[12] است عمل می کند (شکل 1). سلول­هایی که فعالیت TSC-Rheb-GAP آنها از بین رفته است فعال سازی ساختاری سیگنال دهی TORC1[13] (کمپلکس هدف راپامایسین 1) را نشان می­دهند. مکانیسم­های عمل اسیدهای آمینه در کنترل سیگنال دهی TOR و مکانیسم آن در کنترل عمل Rheb هنوز به خوبی درک نشده­اند. غیرفعال سازی سیگنال دهی TORC1 محروم از مواد مغذی می­تواند به وسیله بیان بیش از حد Rheb نوترکیب محفوظ شود. Rheb به عنوان تنظیم کننده مثبت سیگنال دهی TOR به وسیله باند شدن به لوب آمینوترمینال دامین کاتالیتیک mTOR عمل می­کند. فعال سازی ساختاری Rheb ترانسفورماسیون آنکوژنیک را از طریق پروتئین TOR القا می­کند (Jiang and Vogt 2008). Rheb همچنین به طور مستقل از TOR در تنظیم جنبه­های مختلف عمل سلولی نقش ایفا می­کند. در پژوهشی Rosel et al. (2012) نشان دادند که Rheb فاگوسیتوز را در مسیر وابسته به TORC2 و مسیر مستقل از AKT (پروتئین کیناز B)[14] در این سیستم مدل مهار می­کند.  

ژن کد کننده Rheb در بزbp  555 طول دارد. وزن مولکولی پیش بینی شده برای پروتئین ویرایش نشده آن 20358 دالتون و نقطه ایزوالکتریک تخمین زده شده (PI) برابر 27/6 است. اسیدهای آمینه اصلی شامل 3/10 درصد سرین، 2/9 درصد ایزولوسین ، 2/9 درصد والین ، 6/7 درصد لیزین و 6/7 درصد لوسین هستند. Rheb شامل ناحیه­ای ازRas  است که از اسیدآمینه شماره 4 شروع شده و در اسیدآمینه شماره 170 به پایان می رسد.

این ژن شامل جابجایی منطقه I از اسیدآمینه 36 تا 43 و جابجایی منطقه II از اسیدآمینه 62 تا 80 می باشد. آنالیزهای بیوانفورماتیک نشان داده است که ژنRheb  یک جایگاه N-glycosylation، سه جایگاه فسفریل دارکردن پروتئین کیناز C، دو جایگاه فسفریل دار کردن کیناز کازئین II، چهار سیگنال هدف گیرنده انتهای C میکروبادی­ها[15]، دو جایگاه اتصال ATP/GTP موتیف A (P-Loop) و یک جایگاه اتصال گروه preny 1 (باکس CAAX) دارد (Zheng et al., 2011). فعالیت Rheb توسط فاکتورهای رشد، قابلیت دسترسی به مواد مغذی و ATP سلولی و سطح اکسیژن تنظیم می شود (Buerger et al., 2006).

شکل 1- محل Rheb در قسمتی از مسیر سیگنالی Insulin/mTOR/S6K در سلول های پستانداران (Yamagata et al., 1994).

Figre 1- Rheb position in part of Insulin/mTOR/S6K signaling pathway in mammalian cells (Yamagata et al., 1994).

غیر فعال شدن موتاسیونی ژن Rheb، باعث ایجاد سلول هایی با سایز کوچک می­شود و از طرف دیگر بیان بالای ژن Rheb باعث افزایش عمده سایز سلولی می­شود (Long et al., 2007). بیان بیش از حد Rheb رشد سلولی را تحریک می­کند، در حالی­که توقف بیان Rheb سنتز پروتئین و رشد سلولی را مهار می­کند (Aspuria and Tamanoi, 2004). بیان بیش از حد Rheb-GAP  فعالیت mTOR را مهار می­کند و ناحیه برش عرضی فیبر را در ماهیچه­های اسکلتی پستانداران کاهش می­دهد (Wan et al., 2006). اگرچه ژن Rheb در موش، بز و انسان شناسایی شده است، اما عملکردهای فیزیولوژیک آن به طور کامل مطالعه نشده است و نیاز است که شفاف سازی در این زمینه صورت گیرد. با همه این وجود این ژن در ایران روی هیچ یک از دام­های کشور مورد مطالعه قرار نگرفته است، لذا هدف این مطالعه بیان ژنRheb  در بافت های مختلف بز کرکی راینی و مقایسه سطوح مختلف بیان آن­ برای اولین بار بود.

مواد و روش ها

برای تهیه­ی نمونه های بافتی شامل مغز، قلب، شش، پانکراس، طحال، کلیه، کبد و بیضه (از هر بافت 3 تکرار) مربوط به بز کرکی رائینی اقدام به خریداری یک بز نر 17 ماهه کرکی رائینی از گله ای واقع در شهرستان جیرفت شد. بزهای موجود در این گله فقط از نژاد کرکی رائینی بودند که از مرکز اصلاح نژاد بز کرکی رائینی واقع در شهرستان بافت خریداری شده بودند. بلافاصله پس از کشتار قطعات کوچکی از اندام های مورد نیاز توسط تیغ استریل جدا گردید و در داخل میکروتیوب های 5/1 میلی لیتری قرار داده شدند. سپس هر چند عدد از میکروتیوب ها در داخل یک فویل آلومینیومی قرار داده شد و سریعاً به داخل تانک ازت فرستاده شدند. پس از انجماد سریع نمونه ها در داخل فریزر 80- نگهداری شدند.

پایداری RNA از DNA کمتر است و نسبت به تخریب در هنگام جمع آوری، فرآیندکردن و نگهداری نمونه بسیار حساس­تر است. توالی­های بلند RNA  به سادگی تخریب می­شوند. استخراج RNA بایستی در محیط عاری از RNase[16] انجام شود. قبل از انجام استخراج  RNAتمامی وسایل توسط آب  DEPC[17] (سیناژن، MR8244) از RNase عاری[18] شدند. برای استخراج RNA از نمونه های بافتی فوق (از هر بافت 3 تکرار) از کیت استخراج RNA شرکت دنازیست آسیا (S‐1020) استفاده گردید. RNA استخراج شده در دمای منفی80 درجه سانتیگراد نگهداری و کیفیت و کمیت RNA با روش های اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز روی ژل آگارز بررسی شد.

برای سنتز  cDNAاز کیت سنتز cDNA شرکت فرمنتاز استفاده شد (RerertAid^TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit #K1631). برای این امر از مقدارμg 5-ng 10 از RNA کل یا ng500-ng 1 ازPoly (A) mRNA  استفاده می شود. ممکن است حین استخراج مقادیر متفاوتی RNA از هر بافت به دست آید، لذا جهت یکسان کردن  RNA به کار رفته برای ساختcDNA ، مقدار ١ میکروگرم از  RNA به کار رفت. برای انجام واکنش های RT-PCR باید نمونه  RNAعاری از آلودگی به DNA باشد، به این منظور RNA با استفاده از DNaseI تیمار شد. محصول واکنش نسخه برداری معکوس می­تواند مستقیما برای PCR استفاده شود و یا در دمای 20- درجه سانتی گراد برای کمتر از یک هفته نگهداری شود. برای نگهداری در زمانی طولانی تر، ذخیره در دمای 70- درجه سانتی گراد توصیه می­شود.

واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده ازPCR Master Kit  (PR8251C) شرکت سینا ژن صورت گرفت. توالی پرایمر پیشرو و برگشتی Rheb به ترتیب 5'-ATG CCG CAG TCC AAG TCC-3' و 5'-TCA CAT CAC CGA GCA GGA AG-3' (شرکت ژن فن آوران) (Zheng et al., 2011) و توالی پرایمر پیشرو و برگشتی بتااکتین به ترتیب 5'-TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAC GAG-3' و 5'-CGT CCC CAG AGT CCA TGA CAA TG-3' (شرکت سیناژن) بود (Zheng et al., 2011). مقادیر مختلف اجزای واکنش PCR شامل 5/12 میکرولیتر Master mix با غلظت x1، 5/0 میکرولیتر پرایمر رفت با غلظت mM 1-1/0، 5/0 میکرولیتر پرایمر برگشت با غلظت mM 1-1/0، 2 میکرولیتر cDNA با غلظت mg1-pg 10 و 5/9 میکرولیتر آب دیونیزه استریل بود. شرایط انجام واکنش PCR به صورت واسرشت کردن اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه، انجام 35 سیکل با شرایط واسرشت کردن در 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، اتصال          در 63 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، سنتز در 72 درجه سانتیگراد به مدت 40 ثانیه و سنتز نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه بود.

محصولات PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شد و پس از پایان آزمایشات مولکولی، با استفاده از تصویر گرفته شده توسط دستگاه تصویربرداری از ژل و نرم افزار (3.07.02)Gene Tools سطوح مختلف بیان در بافت های ذکر شده، مورد بررسی قرار گرفت و با استفاده از نرم افزار SPSS معنی داری نتایج مورد بررسی قرار گرفت. جهت تعیین اختلاف معنی دار بین گروه­ها از آزمون دانکن و درجه معنی داری 01/0 P≤ استفاده شد.

نتایج و بحث

نتایج حاصل از بررسی اعداد جذب نمونه های استخراج شده در دستگاه اسپکتروفتومتری بیانگر کیفیت مناسب و مطلوب نمونه های RNA در نسبت طول موج A₂₆₀ /A₂₈₀بود (شکل 1). همان­طور که در شکل 2 مشخص است دو باند  S18 و S28 به وضوح ملاحظه می شود.

مشاهده تک باند در محدوده bp 555 برای پرایمر Rheb و در محدوده bp229 برای بتااکتین در مورد تمامی نمونه ها، بیانگر صحت انجام PCR و مراحل قبلی آزمایش می باشد (شکل 3). نتایج حاصل نشان داد که این ژن در تمام بافت های مورد بررسی بیان می­شود. در بررسی دقیق بیان ژن Rheb در بافت های مختلف بز کرکی رائینی با استفاده از نرم افزار Gene Tools دیده شد که این ژن به مقدار زیادی[19] در بافت کلیه بیان شده است و کمترین سطح بیان در بافت های پانکراس و بیضه مشاهده شده است (شکل 4).

نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل آماری توسط نرم افزار SPSS نشان می دهد که بیان ژن Rheb در بز کرکی رائینی در بین بافت های مختلف تفاوت معنی داری در سطح 1 درصد دارد (جدول 1).

شکل 2- نمونه هایی از RNA های استخراج شده.

Figure 2- Samples of the extracted RNA.

شکل 3- الکتروفورز نمونه های مورد بررسی با استفاده از پرایمرهای Rheb و بتااکتین (کنترل). M50؛ نشانگر اندازه.

Figure 3- Electrophoresis of studied samples using Rheb and beta Actin (control) primers. M50; size marker.

شکل 4- سطوح مختلف بیان نسبی ژنRheb  در بافت های مختلف بز کرکی رائینی (از 0 تا 200 درصد).

Figure 4- different levels of Rheb gene relative expression in different tissues of Raini Cashmir goat (from 0 to 200%).

جدول 1- تجزیه واریانس بیان ژن Rheb در بز کرکی رائینی در بین بافت های مختلف.

Table 1- ANOVA of Rheb gene expression in Raini Cashmir goat between different tissues.

در این پژوهش بیان ژن Rheb در هشت اندام مختلف بز کرکی رائینی با استفاده از روش RT PCR مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که این ژن در تمامی بافت های بررسی شده بیان شده است و بیشترین سطح بیان در بافت کلیه و کمترین سطح بیان در بافت های پانکراس و بیضه مشاهده شد. در بررسی مشابهی که توسط Zheng et al. (2011) بر روی بز کرکی مغولی انجام شده بود بیشترین سطح بیان در مغز دیده شده بود و بیان آن در قلب و طحال محدود شده بود، که این نتایج با نتایج حاصل از این پژوهش تفاوت دارد که شاید دلیل آن تفاوت در ژنوتیپ، تأثیر محیط بر روی ژنوتیپ، سن، جنس و نوع تغذیه باشد که باید در پژوهش­های بعدی مد نظر قرار گیرد. در پژوهش صورت گرفته روی این ژن توسط Yamagata et al. (1994) در موش دیده شد که ژن Rheb در سطوح بالایی در هیپوکامپوس و کورتکس مغزی بیان شده است و در بافت های شش، تیموس، کلیه و روده هم به میزان زیادی بیان شده است. در بررسی های صورت گرفته توسط Tabancay et al. (2003) بر روی ژن Rheb در انسان نشان داده است که سطح بالایی از آن در قلب و ماهیچه های اسکلتی بیان شده است. اما، در بررسی Eom et al. (2008) ژن Rheb در انسان به میزان زیادی در خیلی از بافت های بدن از جمله شش، کلیه، پوست و روده بیان شده است. در بررسی دیگری هم که توسط Gromov et al. (1995) بر روی بافت های مختلف انسان انجام شده بود، مشاهده شده که این ژن در بافت های مختلف انسان بیان شده و بیشترین سطح بیان در ماهیچه های قلبی و اسکلتی (و نه در مغز) دیده شد و کمترین سطح بیان در شش و کبد مشاهده شد. اما در بررسی دیگری روی انسان توسط Saito et al. (2005) بیشترین سطح بیان در مغز و کمترین سطح بیان در طحال مشاهده شد. در تحقیق حاضر، از لحاظ بیان ژن Rheb، بین نمونه های قلب با مغز و بین نمونه های پانکراس با بیضه تفاوت معنی داری وجود نداشت، اما بین سایر گروهها تفاوت معنی دار وجود داشت (01/0 P). لذا، می­توان نتیجه گرفت که ژن Rheb نقش مهمی را در سلول های بز ایفا می­کند.