توالی یابی و شناسایی چندشکلی های تک نوکلئوتیدی بخشی از ژن میوستاتین در شترهای تک کوهانه و دوکوهانه

هدایت ایوریق, نعمت; واحدی, وحید; سیدشریفی, رضا; بوستان, آزاده

doi:10.22103/jab.2016.1551

تعداد نشریات	26
تعداد شماره‌ها	447
تعداد مقالات	4,557
تعداد مشاهده مقاله	5,380,003
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	3,580,074

توالی یابی و شناسایی چندشکلی های تک نوکلئوتیدی بخشی از ژن میوستاتین در شترهای تک کوهانه و دوکوهانه

مجله بیوتکنولوژی کشاورزی

مقاله 8، دوره 8، شماره 3 - شماره پیاپی 23، آذر 1395، صفحه 120-135 اصل مقاله (441.58 K)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22103/jab.2016.1551

نویسندگان

نعمت هدایت ایوریق^* ¹؛ وحید واحدی²؛ رضا سیدشریفی¹؛ آزاده بوستان²

¹استادیار گروه علوم دامی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه محقق اردبیلی.

²استادیار گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی مغان، دانشگاه محقق اردبیلی.

چکیده

میوستاتین عضوی از خانواده بزرگ فاکتور رشد تغییر شکل یافته B است که یک تنظیم کننده منفی مهم در رشد ماهیچه در مهره داران می باشد. در این مطالعه بخشی از توالی ژن میوستاتین (اینترون 1) در جمعیت شترهای ایران مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از روش توالی یابی، دو چندشکلی و یک حذف و اضافه در اینترون 1 این ژن شناسایی شد. جهش ها باعث دو جابجایی شامل تغییر C به T در موقعیت 16 و تغییر T به C در موقعیت 136 و همینطور یک حذف یا اضافه شدن باز T در موقعیت 218 شدند. جهش های مشاهده شده در سه موقعیت اینترون 1 باعث ایجاد سه هاپلوتیپ متفاوت شدند که هر سه هاپلوتیپ در دو گونه شترهای دوکوهانه و یک کوهانه مشترک بود و هیچ هاپلوتیپی محدود به یک منطقه خاص یا نژاد خاص نبود. آزمون تاجیما D به جز جمعیت ایستگاه طرود مثبت به دست آمد ولی از نظر آماری تفاوت معنی داری با صفر نداشت.

کلیدواژه‌ها

شتر؛ میوستاتین؛ چندشکلی؛ جهش ژنی

اصل مقاله

توالی یابی و شناسایی چندشکلی های تک نوکلئوتیدی بخشی از ژن میوستاتین در شترهای تک کوهانه و دوکوهانه

نعمت هدایت ایوریق*¹، وحید واحدی²، رضا سیدشریفی¹، آزاده بوستان²

¹استادیار گروه علوم دامی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه محقق اردبیلی.

²استادیار گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی مغان، دانشگاه محقق اردبیلی.

تاریخ دریافت: 01/03/1395، تاریخ پذیرش: 18/08/1395

چکیده

کلمات کلیدی: شتر، میوستاتین، چندشکلی، جهش ژنی.

مقدمه

شترها یکی از شگفت انگیزترین انواع پستانداران در جهان محسوب میشوند که قابلیت فوق العاده آنها در تطبیق یافتن با شرایط دشوار آب و هوائی، مقاومت بسیار زیاد آنها در برابر بی آبی، توانائی حمل بار و طی کردن مسیرهای طولانی، سبب شده است که انسان از دیرباز از این جانوران در راستای اهداف خود استفاده کند. با توجه به شرایط جغرافیایی حاکم بر بخش زیادی از ایران، شتر ذخیره ژنتیکی منحصر به فردی برای کشور ایران محسوب میگردد (Barazandeh, 2016; Barazandeh et al., 2016a; Barazandeh et al., 2016b). همچنین محصولات شتر جزء محصولات ارگانیک بوده و به عنوان غذاهای فراسودمند با رویکرد دارویی محسوب می شوند. از طرفی شتر دارای ویژگیهای منحصر به فردی از جمله ذخیره انرژی در کوهان به صورت چربی، متغیر بودن دمای بدن در طول روز، دوبرابر بودن گلوکز خون نسبت به نشخوارکنندگان، 8 برابر بودن نمک رژیم غذایی نسبت به گوسفند وگاو و دارا بودن آنتی بادی زنجیره سنگین (HCAbs) منحصر به فرد است که منجر به تحمل و بقا شتر در شرایط سخت صحرا و دماهای گوناگون و به‌ویژه گرمای شدید تابستان و کمبود آب و علوفه میگردد. بنابراین، میتوان گفت که شتر کشتى بیابانهاست و قوى‏ترین، کم خرج‏ترین، پرفایده‏ترین، آرام‏ترین و بردبارترین حیوان است (Barazandeh, 2016; Barazandeh et al., 2016a; Barazandeh et al., 2016b). با توجه به موارد ذکر شده در مورد شتر و ویژگیهای آن تحقیق و پژوهش بر روی این حیوان ممکن است منجر به بهبود و استفاده بهینه از تولیدات آن گردیده و همچنین باعث شناسایی سازوکارهایی گردد که میتواند در درمان بیماریها و بهبود سلامت در انسان گردند (Barazandeh, 2016). کاهش تنوع ژنتیکی جمعیتهای شتر و یکسان شدن خزانه ژنی آنان میتواند در آینده سبب بروز برخی مشکلات غیر قابل پیشبینی گردد، چرا که امکان پیشبینی نیازهای آتی بشر به نوع فراوردههای دامی دشوار بوده و از طرفی کاهش تنوع ژنتیکی، مقاومت این حیوانات به بیماریها را نیز کاسته و بیش از پیش آنها را در معرض انقراض قرار میدهد. استفاده از ژنتیک ملکولی فواید زیادی دارد که یکی از این فواید معنی دار تعیین ژنوتیپ افراد برای جایگاه خاصی است (Mousavizadeh et al., 2009)، همچنین استفاده از نشانگرهای ژنتیکی در انتخاب و اصلاح نژاد حیوانات ممکن است به طور مهیجی پیشرفت ژنتیکی را تسریع کند (Javanmard et al., 2008). پروتئین میوستاتین بوسیله ژن میوستاتین کد می‌شود که عضوی از خانواده بزرگ فاکتور رشد تغییر شکل یافته B [1] است و به طور عادی تنظیم کننده منفی در توده عضلانی اسکلتی از طریق تنظیم تعداد و رشد فیبرهای عضلانی می‌باشد (Kim et al., 2004). علاوه بر بیان این ژن در عضلات، گزارشهایی مبنی بربیان این ژن در اندامهای دیگر مانند غده پستانی، بافت چربی، کبد، طحال، ریه و کلیه نیز ارائه شده است (Jiao et al., 2011). این ژن اولین بار در موش تعیین ویژگی شد و نتایج آن نشان داد که به طور معنی‌داری باعث افزایش توده ماهیچه‌ای می‌‌گردد (Kim et al., 2004; Guo et al., 2012). ژن میوستاتین در گونه‌های مختلف مهره داران تعیین ویژگی شده و دارای سه اگزون و دو اینترون است و به طور کلی cDNA آن پروتئین به طول 376-373 اسیدآمینه کد میکند (Jiao et al., 2011).

در نژادهای بلژین بلو، پایدمونتاز[2] و دیگر نژادهای گاو، جهش‌های ایجاد شده در داخل نواحی کد کننده از ژن میوستاتین باعث افزایش توده ماهیچه اسکلتی مرتبط با عضله سینه و ران می شود و منجر به تولید فنوتیپی می گردد که ماهیچه مضاعف نامیده می‌شود (Kocabas et al., 2002; Kim et al., 2004). گاوهای ماهیچه مضاعف بر خلاف دیگر نژاد‌ها دارای مقدار چربی کمتری هستند. این حیوانات به طور متوسط دارای میزان استخوان و چربی کمتر و 20 درصد گوشت بیشتر می باشند. چندشکلی‌های مشاهده شده در ژن میوستاتین در چندین گونه مختلف بر روی صفات رشد، تولید مثل، عملکرد و کیفیت لاشه تاثیر معنی داری داشته است (Riquetl et al., 1997; Kim et al., 2004).

فنوتیپ دارای هتروتروفی عضلانی در گونههای دیگر نیز شناسایی شده است. در گوسفند یک جهش در ژن میوستاتین اساس هتروتروفی عضلانی در نژاد تکسل[3] میباشد و نشان داده شده است که یک تغییر نوکلئوتیدی در ناحیه ^'3 غیرترجمه شونده و اینترون 1 از ژن باعث ایجاد جایگاه اتصال به میکرو RNA میشود (Clop et al., 2006). به دلیل جایگاه اتصال ایجاد شده برای میکرو RNA، mRNA میوستاتین سریعا تجزیه شده و منجر به کاهش سطح میوستاتین می شود و این کاهش منجر به هیپرتروفی عضلانی (ماهیچه مضاعف) می شود (Clop et al., 2006).

جهش هایی از ژن میوستاتین در سگ و اسب نیز گزارش شده است که آلل های غیر عملکردی آن مرتبط با افزایش عضلانی و سرعت می باشند. دو جفت آلل حذف شده در ژن میوستاتین سگ در نژاد وایپت[4] باعث ایجاد کدون متوقف کننده نابالغ و محصول غیر عملکردی ژن می شود. سگ هایی که یک نسخه از این آلل را داشته باشند هم از لحاظ عضلانی و هم از لحاظ سرعت برتر هستند (Mosher et al., 2007). سگهایی که دارای دو نسخه از این آلل هستند به شدت دارای عضلات حجیم بوده و از نظر سرعتی نیز نامطلوب می باشند. تحقیقات در اسب تروبرد[5]، نتایج مشابهی را در مورد ارتباط معنی دار چندشکلی موجود در ژن میوستاتین با سرعت نشان داده است (Hill et al., 2010). در دو نژاد گوسفند نروژی دو جهش مختلف در ناحیه کدون میوستاتین مرتبط با شکل گیری عضلات و چربی لاشه شناخته شده است (Lelong et al., 2000). بعلاوه در دیگر گوسفندان و خوک‌ها جهش‌هایی در قسمت غیر رمزشونده شناسایی شده است که تنظیم کننده اثر سطح بیان ژن میوستاتین بوده و یا مرتبط با رشد، توده عضلانی و دیگر صفات لاشه می باشد (Kim et al., 2004). در پژوهشیLiu et al. (2012) براساس آنالیز‌های فیلوژنتیکی نشان دادند که ژن میوستاتین در بین مهره دارن یک ژن حفاظت شده می‌باشد واین ژن در بیشتر بافت‌های بدن بیان می‌شود ولی بیشترین بیان آن در ماهیچه‌ها است. تحقیقات زیادی بر روی ژن میوستاتین انجام شده و جهش های مختلفی در ناحیه اگزون 1 جوجه (Zhang et al., 2012)، بز (Zhang et al., 2012a,b; Khani et al., 2015)، ناحیه اگزون 2 اسب (Baron et al., 2012)، ناحیه پروموتور ژن در ماهی (Li et al., 2011) گاو (Han et al., 2012) خوک (Guan et al., 2012)، اردک (Lu et al., 2011)، ناحیه اینترون 1 گوسفند(Sjakste et al., 2011; Soufy et al., 2009) و اینترون 2 در ماهی (Li et al., 2011) شناسائی شده است که با صفات کمیت و کیفیت گوشت در ارتباط است. همچنین علیرغم انجام پژوهشهای مختلف بر روی شتر در ایران (Barazandeh, 2016; Ghasemi Meymandi et al., 2015; Barazandeh et al., 2016a; Ghasemi Meymandi et al., 2016; Barazandeh et al., 2016b )، تا کنون ژن میوستاتین در شترهای ایرانی مورد مطالعه قرار نگرفته است. لذا، با توجه به ویژگیهای متفاوت گوشت شتر بنظر می رسد بررسی تفاوت این ژن با سایر گونه ها و شناسایی تنوع نوکلئوتیدی میتواند در بهتر شناختن این ژن مفید و مثمر ثمر باشد. توالی یابی از نواحی رمز کننده نشان می دهد که شباهت زیادی بین گونه های مختلف در بین پستانداران، پرندگان و ماهی ها وجود دارد با توجه به اینکه اینترونها نقش مهمی در فرآیند ویرایش و تنظیم جدا شدن اگزون ها از اینترون ها و متعاقبا تنظیم و شکل گیری پروتئین دارند لذا این پژوهش برای بررسی و توالی یابی جایگاه اینترون 1 ژن میوستاتین در شترهای ایران برای تولید منابع ژنومیکی مطلوب جهت پیدا کردن ساختار و عملکرد و تکامل ژن میوستاتین و شناسایی چندشکلی های تک نوکلئوتیدی انجام گردید.

مواد و روش ها

برای بررسی اینترون 1 ژن میوستاتین در کل 62 نمونه خون به صورت تصادفی از دو گونه شترهای دوکوهانه و یک کوهانه نمونه گیری شد. با توجه به کم بودن جمعیت شترهای دوکوهانه و در حال انقراض بودن آنها، فقط یک جمعیت در ایستگاه جهاد آباد استان اردبیل در دسترس بود که از 23 نفر شتر دوکوهانه در این ایستگاه نمونه گیری بعمل آمد و برای شترهای تک کوهانه از سه جمعیت مختلف ایستگاه پروش شتر یزد، ایستگاه بانک ژن شتر طرود و گله مردمی در استان سمنان به ترتیب 16، 14 و 8 نفر نمونه گیری شد. پس از خونگیری نمونه‌ها در محیط سرد به آزمایشگاه منتقل و تا تا زمان استخراج DNA در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. DNA ژنومیک با استفاده از کیت استخراجی DNA از خون پستانداران شرکت RBC (Real Biotech RBC Corporation, South Korea) استخراج گردید و کمیت و کیفیت DNA با استفاده از ژل آگارز 8/. درصد مورد بررسی قرار گرفت. جهت تکثیر اینترون 1 از جایگاه ژن میوستاتین با GDF-8 از یک جفت آغازگر اختصاصی از روی توالی ژن میوستاتین در شترهای دوکوهانه فرال با کد دسترسی 946665156 GI: در پایگاه اطلاعاتی NCBI به طول 2893 جفت باز با استفاده از نرم افزار آنلاین Primer 3 (http://simgene.com/Primer3) طراحی و استفاده گردید.

Forward: 5’- GGAAGGGTTCCTTCTTCCAG-3’

Backward: 5’- AGGAGTCTTGACGGGTCTCA-3’

برنامه حرارتی برای تکثیر ژن میوستاتین به ترتیب؛ دمای واسرشت شدن اولیه 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 35 سیکل با دمای واسرشت 94 درجه سانتیگراد برای 50 ثانیه، اتصال پرایمرها 60 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، تکثیر قطعه مورد نظر 72 درجه سانتیگراد به مدت 40 ثانیه و یک سیکل دمای تکثیر نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه تنظیم و انجام شد. غلظتهای مورد استفاده از مواد بعد از بهینه سازی برای انجام PCR به ترتیب 6/1 میکرولیتر 25mM MgCl2 (1.6 mM در 25 میکرولیتر)، 5/2 میکرولیتر بافرPCR 10X (بافر 1X در 25 میکرولیتر)، 6/1 میکرولیتر 10mM dNTP (0.65 mM در 25 میکرولیتر )، 18 پیکو مول از هر جفت پرایمر (8/1 میکرو لیتر)، 25/1 واحد Taq DNA Polymerase ، 5/1 میکرلیتر DNA ژنومی(100نانوگرم) و مابقی را تا رسیدن به 25 μL از آب مقطر استفاده شد. بعد از تکثیر جایگاه‌ اینترون 1 ژن میوستاتین جهت بررسی تنوع موجود در این جایگاه‌ها و شناسایی چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) توسط شرکت آمریکایی ماکروژن (Macrogen ) توالی یابی گردید. چند شکلیهای نوکلئوتیدی به دست آمده ابتدا با استفاده از نرم افزار MEGA 6.0 با استفاده از روش W Clustal برهمنهش گردید (Tamura et al., 2013) سپس با استفاده از نرم افزار DnaSp 5.10 هاپلوتیپها و فراسنجههای مربوط به تنوع ژنتیکی شامل تنوع نوکلئوتیدی و تنوع هاپلوتیپی به دست آمد (Librado and Rozas 2009). بر اساس هاپلوتیپهای به دست آمده بهترین مدل جایگزینی نوکلئوتید در نرم افزار MEGA 6.0 شناسایی و با استفاده از روش حداکثر درستنمایی درخت فیلوژنتیکی با بیشترین درستنمایی (2086/51-) بین نمونه های مختلف ترسیم گردید. فراسنجههای تمایز ژنتیکی، فاصله ژنتیکی و خلوص ژنتیکی با استفاده از نرم افزار MEGA 6.0 به دست آمد. جهت آنالیز شبکهای هاپلوتیپهای بدست آمده از نرمافزار Network V.4.6.1.2 استفاده شد (fluxus-engineering.com). این نرمافزار جهت ترسیم شبکه فیلوژنیکی به کار گرفته میشود. الگوریتم MJ^{^[6]} برای آنالیز هاپلوتیپهای حاصل به کار گرفته شد که اجازه آنالیز برای چندین نمونه به طور همزمان را فراهم میآورد. جهت بررسی اینترون 1 ژن میوستاتین در بین دامهای مزرعه ای اطلاعات ژنومی از مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی NCBI با کد دسترسی ذکر شده برای اسب (GQ183900.1، AY840554.2، KC708231.1، KC708232.1)، خوک (EF490990.1، EF490988.1، EF490986.1، AY208121.1)، گاو (AB076403.1، JQ711180.1، AF320998)، گاو میش (DQ091762.1، )، بز (JX078969.1، JX078968.1، JN012228.1، EF591039.1) گوسفند (DQ530260.1، AF393618، DQ990914.1، JN856478.1، JN856477.1) گاوهای کوهان دار (AY794986.1) دریافت شد و با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک ذکر شده در آنالیز توالی یابی، درخت فیلوژنتیکی با روش حداکثر درستنمایی (90/628-ln= ) و آنالیز شبکه ای هاپلوتیپ ها مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج و بحث

بعد از توالی یابی و تصحیح توالی ها در کل 374 جفت باز به عنوان بخشی از قسمت ناحیه اینترون 1 ژن میوستاتین به دست آمد بعد از برهمنهش با استفاده از روش Clustal W در نرم افزار Mega 6.0 تغییر نوکلئوتیدی در دو موقعیت 16 و 136 مشاهده گردید که باعث تغییر نوکلئوتید C به T در موقعیت 16 و تغییر نوکلئوتید T به C در موقعیت 136 می‌شود (جداول 1 و 2). همچنین یک جایگاه InDel نیز در موقعیت 218 مشاهده شد که باعث یک حذف یا اضافه شدن باز T می شود. ترکیب این سه تغییر باعث ایجاد سه نوع هاپلوتیپ در جمعیت ها شده است. حیواناتی که در جایگاه 136 دارای باز T بودند در جایگاه 218 نیز T را داشتند. نتایج حاصل از آنالیز DnaSP برای ناحیه انتخاب شده اینترون 1 (1-374) در شترهای ایران نشان داد که جمعیت شترهای دوکوهانه و ایستگاه طرود به ترتیب بیشترین (0025/0=π) و کمترین (0011/0=π) تنوع نوکلئوتیدی را در بین جمعیت های مورد بررسی دارند. میانگین تعداد نوکلئوتید مختلف 650/0=K برای همه توالی‌ها به دست آمد. آزمون تاجیما D بر اساس جهشهای خنثی در توالیهای مورد نظر میباشد. در زمانی که تاجیما D برابر با صفر باشد نشاندهنده اندازه ثابت و جمعیت بدون تغییر و یا نبود هیچ انتخاب برای آن جایگاه است (Zhu et al., 2014). بر اساس آنالیز داده های اینترون 1 ژن میوستاتین تاجیما D به جز جمعیت ایستگاه طرود مثبت به دست آمد ولی از نظر آماری تفاوت معنی داری با صفر نداشت که نشان دهنده اندازه ثابت جمعیت می باشد (جدول 3).

جدول 1- جهش های مشاهده شده در جایگاه اینترون 1 ژن میوستاتین

Table 1- Mutations observed in Intron 1 of Myostatin gene.

فراوانی frequency	نوکلئوتید nucleotide	جهش Mutation	موقعیت Position
0.79	C	C=>T	16
0.21	T		16
0.40	T	T=>C	136
0.60	C		136
0.40	T	T=>-	218
0.60	-		218

جدول 2- فراوانی هاپلوتیپ های مشاهده شده در جایگاه اینترون 1 ژن میوستاتین

Table 2- Frequency of haplotype observed in Intron 1 of Myostatin gene.

سمنان Semnan	طرود Trod	یزد Yazd	دوکوهانه Bactrian	کل توالی Whole samples	هاپلوتیپ Haplotype
0.250	0.071	0.063	0.348	0.193	CTT
0.125	0.071	0.187	0.348	0.210	TC-
0.625	0.585	0.750	0.304	0.597	CC-

جدول 3- چند شکلی و تنوع ژنتیکی ژن میوستاتین در جمعیت شترهای ایران.

Table 3- Polymorphisms and diversity of myostatin gene in Iranian camel populations.

تاجیما D Tajima D	تنوع نوکلئوتیدی N_d	میانگین تفاوت نوکلئوتیدی K	تنوع هاپلوتیپ H_d	تعداد هاپلوتیپ H	جهش Mutation	تعداد Number	جمعیت Population
1.604	0.0025	0.928	0.696	3	3	23	شترهای دوکوهانه Bactrian camel
0.519	0.0019	0.725	0.425	3	3	16	ایستگاه یزد Yazd station
-0.959	0.0011	0.407	0.274	3	3	14	ایستگاه طرود Trod station
0.0694	0.0014	0.541	0.607	3	3	8	گله سمنان Semnan

H: number of haplotype; H_d: Haplotype diversity; K: Average nucleotide difference; N_d: nucleotide diversity.

در پژوهشی دیگر که از 9 جفت نشانگر ریزماهواره ای برای ارزیابی وجود چندشکلی در جمعیت شتر دو کوهانه ایران استفاده شده بود، نشان داده شد که این جمعیت دچار افت هموزیگوسیتی (افزایش همخونی) شده است و بنابراین رسیدگی به برنامه حفاظتی این جمعیت از اهمیت خاصی برخوردار است. نتایج تحقیق حاضر نیز موید رخ دادن تنگنا در جمعیت مذکور است. یکی از اثرات تنگنا کاهش هتروزیگوسیتی است. نیاز به رسیدگی به برنامه های حفاظتی در مورد این جمعیت با توجه به این بخش از نتایج تحقیق حاضر نیز مورد توصیه است.

میانگین تعداد نوکلئوتیدهای جایگزین در هر جایگاه (D_XY) و تمایز ژنتیکی (F_st) از ژن GDF8 در بین جمعیت‌ها بدست آمد (جدول 4). شاخص D_XY برای انشعاب DNA بین گونه‌ها بوده و هر چه D_XY بیشتر باشد حاکی از فاصله ژنتیکی بیشتر بین جمعیت‌ها یا گونه‌های X و Y است. شاخص F_st در مورد تمایز ژنتیکی بین جمعیت ها می باشد هر چه این آماره کمتر باشد نشان از تمایز ژنتیکی کم در بین گونه ها و جمعیت ها می باشد. به عبارتی این دو آماره مکمل هم بوده و از آماره های مهم بررسی جمعیت به حساب می آید (Zhu et al., 2014).

وجود F_ST منفی میتواند به دلیل جایگاه چندشکلی دارای آلل تفکیکی در دو جمعیت مورد بررسی باشد در حالی که توزیع فراوانی آللها بین دو جمعیت متفاوت نباشد در این حالت در نظر گرفتن عدم تمایز ژنتیکی میتواند منطقی باشد از طرف دیگر F_ST منفی زمانی میتواند مشاهده گردد که توزیع فراوانی آللها در جایگاه نشانگر به مقدار زیادی چولگی نشان دهد و این زمانی ایجاد میشود که جایگاه نزدیک به حالت تک شکل بوده و چندشکلی توسط تعداد کمی از افراد مشاهده شود که نتیجه آن در نظر گرفتن عدم تمایز ژنتیکی است (Roesti et al. 2012). نتایج مربوط به بررسی فاصله ژنتیکی بین دامهای مزرعه ای نشان داد که شترهای یک کوهانه و دوکوهانه در بین دامهای مزرعه ای به اسب نزدیک تر هستند و بیشترین فاصله را با گاوسانان دارند (جدول 5).

جدول 4- میانگین تعداد نوکلئوتیدهای جایگزین در هر جایگاه (D_XY) پایین قطر و تمایز ژنتیکی (F_ST) بالای قطر ژن GDF8.

Table 4- The average of nucleotide substitution in each locus (D_xy) (under diameter) and genetic differentiation (F_ST) (upper diameter) in GDF8 gene.

سمنان Semnan	ایستگاه طرود Trod station	ایستگاه یزد Yazd station	شتر دوکوهانه Bactrian camel
0.061	0.307	0.147	-	شتر دوکوهانه Bactrian camel
-0.074	-0.022	-	0.003	ایستگاه یزد Yazd station
0.011	-	0.001	0.003	ایستگاه طرود Trod station
-	0.002	0.002	0.002	سمنان Semnan

درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده بین نمونه‌ها عدم وجود فاصله ژنتیکی بین دو گله سمنان و ایستگاه طرود و همچنین نزدیکی بین این دو گله با ایستگاه یزد را نشان داد (شکل 1). سه گروه مختلف از افراد در درخت فیلوژنتیکی مشاهده میشود که در همه جمعیت ها مشترک می باشد.

هاپلوتیپ های شناسایی شده با عنوان H_1، H_2 و H_3 نامگذاری شد و بیشترین فراوانی هاپلوتیپ مربوط به H_3 می باشد هر سه هاپلوتیپ با تنوع هاپلوتیپی متفاوت در همه جمعیت های مورد بررسی مشاهده شد. (شکل 2) وجود هاپلوتیپ مشترک در جمعیتها بخصوص بین گونه شترهای دوکوهانه و یک کوهانه در دو منطقه ژئوگرافیکی متفاوت نشان میدهد که وجود جغرافیای متفاوت تأثیر معنیداری در ساختار ژنتیکی جمعیت شترهای منطقه نداشته است. این نتیجه میتواند با دو فرضیه همراه باشد؛ نخست اینکه تنوع DNA در ژن میوستاتین یک نشانگر ضعیف برای بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت میباشد. ثانیاً، میتواند به دلیل جریان ژنی بالا در گذشته بوده باشد (Bradley et al., 1996). در پژوهش دیگری که در مورد شترهای یک و دو کوهانه شمال و شمال غرب ایران و با استفاده از توالی پروموتور ژن کاپاکازئین انجام شده بود نیز همولوژی بالا در بخش تعیین توالی شده ژنوم گزارش شد، که با این بخش از نتایج این تحقیق مطابقت دارد (Khabiri et al., 2014).

جدول 5- میانگین تعداد نوکلئوتیدهای جایگزین در هر جایگاه (D_XY) پایین قطر و تمایز ژنتیکی (F_ST) بالای قطر ژن GDF8 در دامهای مزرعه ای.

Table 5- The average of nucleotide substitution in each locus (D_xy) (under diameter) and genetic differentiation (F_ST) (upper diameter) in GDF8 gene in livestock animals.

خوک Pig	گوسفند Sheep	شترهای تککوهانه Dromedary camel	شتردوکوهانه Bactrian camel	اسب Horse	بز Goat	گاو Cattle
0.986	0.849	0.989	0.980	0.987	0.787	-	گاو Cattle
0.972	0.959	0.978	0.970	0.973	-	0.024	بز Goat
1.000	0.993	1.000	0.987	-	0.134	0.123	اسب Horse
0.991	0.986	0.667	-	0.096	0.161	0.139	شتردوکوهانه Bactrian camel
1.000	0.993	-	0.003	0.099	0.165	0.142	شتر تککوهانه Dromedary camel
0.992	-	0.157	0.154	0.129	0.019	0.017	گوسفند Sheep
-	0.124	0.137	0.134	0.104	0.130	0.117	خوک Pig

آنالیز شبکه ای بین گونه های مزرعه ای سه گروه هاپلوتیپی متفاوت را نشان می دهد (شکل 3). دو نوع از هاپلوگروهها در جمعیت شترهای ایران مشاهده گردید که یکی از این هاپلوگروهها مختص جمعیت شترهای ایران می باشد. همانطور که در شکل مشاهده میشود 10 هاپلوتیپ با نامهای mv1 تا mv10 وجود دارد. اینها هاپلوتیپهای بالقوه میباشند که در جمعیتهای مورد بررسی مشاهده نشد ولی ممکن است در این جمعیت و یا در نمونههای دیگر مشاهده شود.

آنالیز درخت فیلوژنتیکی بین گونه های مزرعه ای نشان داد که خانواده بویدا شامل گاو، گوسفند، گاومیش و بز به هم شبیه می باشند (Sajadi zarjani et al., 2016) و شترهای ایران متمایز از آنها بوده و در بین گونه های مزرعه ای از لحاظ توالی های مورد بررسی به اسب و خوک نزدیک تر هستند (شکل 4).

شکل 1- درخت فیلوژنتیکی ژن GDF8 در چهار جمعیت شتر (دوکوهانه (BC) و یک کوهانه (DC) با استفاده از روش حداکثر درستنمایی.

Figure 1- Phylogenetic tree between four population of camel using maximum likelihood based on GDF8 gene (BC: Bactrain camel; DC: dromedary camels).

شکل 2- آنالیز شبکه ای هاپلوتیپهای شناسایی شده ژن GDF8 در جمعیت شترهای ایران. شترهای دوکوهانه (هاشور سیاه)، ایستگاه یزد (هاشور قرمز)، ایستگاه طرود (زرد) و سمنان (هاشور آبی).

Figure 2- Network analysis of haplotype identified in GDF8 gene of Iranian camels.

شکل 3- آنالیز شبکه ای هاپلوتیپهای شناسایی شده قسمت اینترون 1 ژن GDF8 در بین دامهای اهلی رنگ زرد (گاومیش)، سیاه (گاو)، قرمز (گاو کوهان دار) سبز (بز)، صورتی (اسب)، خاکستری (شترهای دوکوهانه)، سفید (شترهای یک کوهانه)، آبی (گوسفند) و قهوه ای (خوک).

Figure 3- Network analysis of haplotype identified between livestock animals using Intron I of GDF8 gene.

شکل 4- درخت فیلوژنیکی بین گونه های اهلی براساس ناحیه اینترون 1 ژن میوستاتین (شترهای یک کوهانه (DC)، شترهای دوکوهانه (BC) اسب (EC)، خوک (SS)، گاو (BT)، گاو میش (BB)، گاو کوهان دار (BI)، گاو بدون کوهان (BT)، بز (CH) و گوسفند (OA).

Figure 4- Phylogenetic tree between livestock species using Intron I of myostatin gene (DC: dromedary camel; BC: Bactrian camel; EC; Horses; SS: Pig; BB: Buffalo; BI: Indicus cattle; BT: Taurus cattle; CH: goat and OA: sheep.

منابع

Barazandeh A (2016). Whole genome CpG islands investigation in Camelid species. PhD Thesis, Shahid Bahonar University of Kerman, pp. 128 (In Farsi).

Barazandeh A, Mohammadabadi MR, Ghaderi M, Nezamabadipour H (2016a). Genome-wide analysis of CpG islands in some livestock genomes and their relationship with genomic features. Czech Journal of Animal Science 61: 487-495.

Barazandeh A, Mohammadabadi MR, Ghaderi M, Nezamabadipour H (2016b). Predicting CpG islands and their relationship with genomic feature in cattle by hidden Markov model algorithm. Iranian Journal of Applied Animal Science 6: 571-579.

Baron E, Lopes M, Mendonça D, da Câmara Machado A (2012). SNP identification and polymorphism analysis in exon 2 of the horse myostatin gene. Animal Genetics 43: 229-232.

Bradley DG, MacHugh DE, Cunningham P, Loftus RT (1996). Mitochondrial diversity and the origins of african and european cattle. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 5131–5135.

Clop A, Marcq F, Takeda H, Pirottin D, Tordoir X, Bibe B, Jacques B, Florian C, Jean-Michel E, Francis E, Catherine L, Elisabeth L, Françoise M, Dragan M, James T, Carole C, Michel G (2006). A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep. Nature Genetics 38: 813–818.

Ghasemi Meymandi M, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK (2015). Genetic variation of camels in the North of Kerman province using microsatellite markers. Animal Production Research 4: 35-45.

Ghasemi Meymandi M, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK, Montazeri M (2016). Assigning individuals to the camel populations of north of kerman province using microsatellite markers. Modern Genetics 11: 319-325.

Guan X, Liu Y, Bian F, Zhu W, Han H (2012). MSTN gene polymorphism and its relationships with growth performance in Ma Shen porcine. Journal of Animal and Veterinary Advances 11: 1173-1176.

Guo Y, Li J, Shang J, Jin Y (2012). Development of muscle-related genes and their effects on meat quality. Energy Procedia 16: 229-233.

Han SH, Cho IC, Ko MS, Kim EY, Park SP, Lee SS, Oh HS (2012). A promoter polymorphism of MSTN g.− 371T> A and its associations with carcass traits in Korean cattle. Molecular Biology Reports 39: 3767-3772.

Hill EW, McGivney BA, Gu J, Whiston R, MacHugh DE, (2010). A genome-wide SNP-association study confirms a sequence variant (g.66493737C>T) in the equine myostatin (MSTN) gene as the most powerful predictor of optimum racing distance for Thoroughbred racehorses. BMC Genomics11: 552.

Javanmard A, Mohammadabadi MR, Zarrigabayi GE, Gharahedaghi AA, Nassiry MR, Javadmansh A, Asadzadeh N (2008). Polymorphism within the intron region of the bovine leptin gene in Iranian Sarabi cattle (Iranian Bos taurus). Russian Journal of Genetics 44: 495-497.

Jiao J, Yuan T, Zhou Y, Xie W, Zhao Y, Zhao J, Ouyang H, Pang D, (2011). Analysis of myostatin and its related factors in various porcine tissues. Journal of Animal Science 89 (10): 3099-106.

Kadim IT, Mahgoub O, Al-Marzooqi W, Al-Zadjali S, Annamalai K, Mansour MH, (2006). Effects of age on composition and quality of muscle longissimus thoracis of the Omani Arabian camel (Camelus dromedarius). Meat Science 80: 555–569.

Khabiri AA, Tahmoorespur M, Nassiri MR, Sekhavati MH (2014). Sequencing and bioinformatics analysis of the partial promoter region of κ-casein (CSN3) gene in Iranian Bacterianus and dromedaries camels. International Journal of Advanced Biological and Biomedical Research 2: 1719-1725.

Khani K, Abdolmohammadi AR, Foroutanifar S, Zebarjadi A (2015). Association of Myostatin Gene Exon 3 Polymorphism with twining trait in Markhoz Goat. Journal of Agricultural Biotechnolgy 7(3): 105-118

Kim HW, Mykles DL, Goetz FW, Roberts SB (2004). Characterization of a myostatin-like gene from the bay scallop, Argopecten irradians. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression 1679: 174-179.

Kocabas AM, Kucuktas H, Dunham RA, Liu Z (2002). Molecular characterization and differential expression of the myostatin gene in channel catfish (Ictalurus punctatus). Biochimical and Biophysical Acta 1575: 99.

Lelong C, Mathieu M, Favrel P (2000). Structure and expression of mGDF, a new member of the transforming growth factor β superfamily in the bivalve mollusc Crassostrea gigas. European Journal of Biochemistry 267: 3986-3993.

Li H, Fan J, Liu S, Yang Q, Mu G, He C (2011). Characterization of a myostatin gene (MSTN1) from spotted halibut (Verasper variegatus) and association between its promoter polymorphism and individual growth performance. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology 161: 315-322.

Librado P, Rozas J (2009). DnaSP v5: َA software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 25: 1451-1452.

Liu L, Yu X, Tong J (2012). Molecular characterization of myostatin (MSTN) gene and association analysis with growth traits in the bighead carp (Aristichthys nobilis). Molecular Biology Reports 39: 9211-9221.

Lu J, Hou S, Huang W, Yu J, Wang W (2011). Polymorphisms in the myostatin gene and their association with growth and carcass traits in duck. African Journal of Biotechnology 10: 11309-11312.

Maruyama T, Fuerst PA (1985). Population bottlenecks and non-equilibrium models in population genetics. II. Number of Alleles in a Small population that was 7 formed by a recent bottleneck. Genetics 111: 675-689.

Mosher DS, Quignon P, Bustamante CD, Sutter NB, Mellersh CS, Parker HG, and Ostrander EA (2007). A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs. PLoS Genetics 3: e79.

Mousavizadeh A, Mohammad Abadi MR, Torabi A, Nassiry MR, Ghiasi H, Esmailizadeh AK (2009). Genetic polymorphism at the growth hormone locus in Iranian Talli goats by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP). Iranian Journal of Biotechnology 7: 51-53.

Riquetl I, Schoeberleinl A, Dunnerz S, Ménissier F, Massabanda I (1997). A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nature Genetics 17: 71.

Roesti M, Salzburger W, Berner D (2012). Uninformative polymorphisms bias genome scans for signatures of selection. BMC Evolutionary Biology 12: 94.

Sajadi zarjani S, Bahreini bezasi MR, Fardaei M (2016). Sequencing of third exon of IGF1 gene in sheep. Journal of Agricultural Biotechnolgy. 7(4): 83-96.

Sjakste T, Paramonova N, Grislis Z, Trapina I, Kairisa D (2011). Analysis of the single-nucleotide Polymorphism in the 5′ UTR and part of intron I of the sheep MSTN gene. DNA and Cell Biology 30: 433-444.

Soufy B, Mohammadabadi MR, Shojaeyan K, Baghizadeh A, Ferasaty S, Askari N, Dayani O (2009). Evaluation of myostatin gene polymorphism in Sanjabi sheep by PCR-RFLP method. Animal Science Research 19: 81-89.

Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S (2013). MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-29.

Zhang C, Liu Y, Xu D, Wen Q, Li X, Zhang W, Yang L (2012). Polymorphisms of myostatin gene (MSTN) in four goat breeds and their effects on Boer goat growth performance. Molecular Biology Reports 39: 3081-3087.

Zhang G, Zhao X, Wang J, Ding F, Zhang L (2012). Effect of an exon 1 mutation in the myostatin gene on the growth traits of the Bian chicken.. Animal Genetics 43: 458-459.

Zhu Y, Cheng Q, Rogers SM (2014). Genetic structure of Scomber Japonicus (Perciformes: Scombridae) along the coast of China revealed by complete mitochondrial cytochrome b sequences. Mitochondrial DNA 1-9.

Sequencing and identification of single nucleotide polymorphisms of Partial myostatin gene in dromedary and Bactrian camels

Hedayat-Evrigh N.*¹, Vahedi V.², Seyed Sharifi R.¹, Boustan A.²

¹Assistant professor, Department of Animal Science, Faculty of Agricultural Sciences, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran.

²Assistant professor, Department of Animal Science, Moghan College of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran.

Abstract

Myostatin (MSTN) is a member of the transforming growth factor-β superfamily (TGF-β) and is an important negative regulator of muscle growth in vertebrates. In this study, a partial sequence of MSTN gene (intron 1), in the camel population of Iran, was evaluated. Two single nucleotide polymorphisms and one insertion or deletion (InDell) were identified in intron 1 of the myostatin gene, using sequencing method. The mutations caused, two substitutions including C to T and T to C in positions 16 and 136, respectively and one InDell of T in position 218. The mutations observed in three positions of intron 1, created three different haplotypes. These haplotypes were shared among Bacterianus and Dromedaries camel populations with no haplotype restricted to a specific region or a single camel breed. Tajima D were positive for all populations except Trod station, but it wasn’t significant.

Keywords: Camel, Myostatin, Polymorphism, InDel.

* نویسنده مسئول: نعمت هدایت ایوریق تلفن: 04533512081 Email: nhedayat@uma.ac.ir

[1] Transforming growth factor beta

[2] Belgian Blue and Piedmontese

[3] Texel

[4] Whippet

[5] Thoroughbred

[6] Median- Joining

* Corresponding Author: Hedayat-Evrigh N. Tel: 04533512081 Email: nhedayat@uma.ac.ir

مراجع